一種煙草織孢霉菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙草織孢霉菌及其應(yīng)用。所述煙草織孢霉菌分類命名為煙草織孢霉菌（Plectosporium?tabacinum），株號為XJ-14，已于2013年5月26日保藏于位于中國武漢市珞珈山武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），保藏編號為：CCTCC?NO：M2013232。所述應(yīng)用是煙草織孢霉菌在降解增塑劑中的應(yīng)用，包括：將煙草織孢霉菌的菌懸液或孢子懸液投加到被增塑劑污染的土壤或水體中。本發(fā)明的煙草織孢霉菌能用于降解鄰苯二甲酸二辛酯，能在以鄰苯二甲酸二辛酯為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中生長。
【專利說明】一種煙草織孢霉菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物種質(zhì)資源領(lǐng)域，具體涉及一種煙草織孢霉菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]塑料在人類生活的許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在塑料生產(chǎn)過程中，需要在其骨架結(jié)構(gòu)如聚乙烯或聚氯乙烯中添加大量的增塑劑，以增加其彈性和柔韌性，擴大塑料產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。
[0003]其中鄰苯二甲酸二辛酯(DOP，d1ctyl phthalate)是最常用的增塑劑之一，DOP具有良好的綜合性能，混合性能好，增塑效率高，揮發(fā)性較低，低溫柔軟性較好，耐熱性和耐候性良好，與絕大多數(shù)工業(yè)上使用的合成樹脂和橡膠均有良好的相容性，是目前工業(yè)上使用最為廣泛的通用型增塑劑。在實際生產(chǎn)中，DOP主要用于聚氯乙烯脂的加工，還可用于環(huán)氧樹脂、醋酸樹脂、ABS樹脂及橡膠等高聚物的加工，也可用于造漆、染料、分散劑等，DOP增塑的聚氯乙烯可用于制造人造革、農(nóng)用薄膜、包裝材料、電纜等。
[0004]塑料雖然給生活生產(chǎn)帶來了極大的便利，但隨著塑料的大量使用，產(chǎn)生了大量的廢物塑料。由于塑料的難降解特性，廢塑料殘體大量存在于環(huán)境中，帶來越來越嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。其中的增塑劑如D0P，是通過范德華力結(jié)合到塑料骨架成分中，結(jié)合力弱，容易通過淋溶、揮發(fā)、沉降等過程進(jìn)入自然環(huán)境，在土壤、水體和大氣等環(huán)境介質(zhì)中遷移、轉(zhuǎn)化，并在土壤、水體沉積物中累積。鄰苯二甲酸酯類成分是環(huán)境激素類物質(zhì)，具有生殖、發(fā)育毒性，對動物具有致癌、致突變、致畸和生殖毒性等作用。美國國家環(huán)保局(US EPA)已將鄰苯二甲酸二辛基酯(DOP)列為優(yōu)先控制有毒污染物，我國將DOP列為優(yōu)先監(jiān)測污染物。土壤中的DOP可通過生物富集，經(jīng)由消化系統(tǒng)進(jìn)入人體，具有慢性毒性、引起雌激素效應(yīng)以及肥胖癥，甚至致癌。因此，對環(huán)境中的DOP進(jìn)行有效處理，是減少和防止DOP污染的重要手段。
[0005]微生物是自然環(huán)境中的分解者，許多微生物對有機物具有降解作用。利用微生物降解處理環(huán)境污染物，處理條件溫和，沒有二次污染，成本低廉，越來越受到重視。
[0006]真菌是自然環(huán)境中重要的微生物，在其生長過程中可以分泌大量非特異性胞外酶，將其細(xì)胞周圍的有機物降解成為可以被真菌細(xì)胞吸收的物質(zhì)，為自身的生長提供營養(yǎng)。利用這個特點，人們可以篩選對特定有機物具有降解作用的真菌。
[0007]目前織孢霉菌屬真菌包括4個種，研究人員對這4個種的形態(tài)特征有詳細(xì)描述，但對這類真菌在生物降地膜增塑劑鄰苯二甲酸二辛酯降解作用未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了一種煙草織孢霉菌，該煙草織孢霉菌對鄰苯二甲酸二辛酯具有較強的降解作用。
[0009]一種煙草織孢霉菌,分類命名為煙草織孢霉菌(Plectosporium tabacinum),株號為XJ-14，已于2013年5月26日保藏于位于中國武漢市珞珈山武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為:CCTCC NO:M2013232。
[0010]本發(fā)明的煙草織孢霉菌分離自在麥田中使用過的破舊地膜，其ITS序列如SEQ IDN0.1所示，主要生物學(xué)特征為:在PDA平板上22°C黑暗培養(yǎng)14天，菌落直徑5.2-7.8cm，菌落白色至淺紅色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，1.4-2.7 μ m寬，菌落表面的菌絲頂端常凝結(jié)有許多細(xì)小的水滴，菌落邊緣有放射狀的洼陷；分生孢子梗單生，無色，分支或不分支，在分生孢子梗的頂端或側(cè)面產(chǎn)生1-多個瓶梗狀產(chǎn)孢細(xì)胞，(2.3-) 5.5-28.8 (-31.5) X (1.4_) 1.8-3.1 (-3.6)μ m，瓶梗頂端1.1-1.8 μ m，產(chǎn)孢后往往留下圍領(lǐng)型的圓柱狀產(chǎn)孢痕，深度1.4-2.3μπι ;許多分生孢子在瓶梗頂端聚集，并附著一滴水珠，形成圓球形孢子球；分生孢子無色，兩邊對稱，無隔膜或有I個隔膜，有時分生孢子的側(cè)面略彎曲，使分生孢子的兩端明顯不同，一端較鈍，一端較尖銳，(4-) 4.5-9.6 (-10.9) X (1.8) -2.3-2.7 μ m。
[0011]該菌與鐮刀菌的主要區(qū)別是產(chǎn)孢后瓶梗上明顯的圍領(lǐng)型的圓柱狀產(chǎn)孢痕，部分分生孢子的兩端一端較鈍，一端較尖銳，菌落生長速度明顯比鐮刀菌慢，菌落表面有明顯塌陷，表面不平整。
[0012]本發(fā)明的煙草織孢霉菌還能以鄰苯二甲酸二辛酯為唯一碳源和能源生長。基于該生長特性，本發(fā)明提供了一種所述煙草織孢霉菌的生長培養(yǎng)基，包括碳源，所述碳源即為鄰苯二甲酸二辛酯。
[0013]作為優(yōu)選，所述鄰苯二甲酸二辛酯的濃度為0.2~0.4%，更優(yōu)選為0.2%。作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述生長培養(yǎng)基的配方為=K2HPO4.3H20 9g、KH2PO4 3g、MgSO4.7H20 0.lg、(NH4)2SO4 lg、瓊脂 15g、鄰苯二甲酸二丁辛酯 2g、水 1000mL。
[0014]基于該菌的生長特性，本發(fā)明還提供了所述煙草織孢霉菌在降解增塑劑中的應(yīng)用，包括:將煙草織孢霉菌的菌懸液或孢子懸液投加到被增塑劑污染的土壤或水體中。作為微型，所述增塑劑為鄰苯二甲酸二辛酯。
[0015]本發(fā)明還提供了含有所述煙草織孢霉菌的菌劑。該菌劑可以采用煙草織孢霉菌的菌絲或孢子制成，優(yōu)選為采用孢子制成，菌劑中煙草織孢霉菌孢子的濃度為1.0X 16~18個 /mL。
[0016]當(dāng)需要對鄰苯二甲酸二辛酯進(jìn)行降解處理時，將該菌劑直接投加或經(jīng)適當(dāng)倍數(shù)稀釋后投加到被污染土壤或水體中即可。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0017]本發(fā)明的煙草織孢霉菌能用于降解鄰苯二甲酸二辛酯，該煙草織孢霉菌能在以鄰苯二甲酸二辛酯為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中生長。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1A為XJ-14菌株的瓶梗狀分生孢子梗形態(tài)圖；
[0019]圖1B為XJ-14菌株著生分生孢子的瓶梗狀分生孢子梗形態(tài)圖；
[0020]圖1C為分生孢子梗發(fā)生處的菌絲形態(tài)圖；
[0021]圖1D為兩端不相同的分生孢子形態(tài)圖；分生孢子的一端較鈍，一端較尖銳；
[0022]圖1E為XJ-14菌株的分生孢子形態(tài)圖；
[0023]圖1F為XJ-14菌株的另一分生孢子形態(tài)圖；
[0024]圖1A ~IF 中，標(biāo)尺=10 μ m ；
[0025]圖2A為XJ-14菌株在PDA培養(yǎng)基上22°C培養(yǎng)7天的菌落形態(tài)圖(正面)；
[0026]圖2B為XJ-14菌株在PDA培養(yǎng)基上22°C培養(yǎng)7天的菌落形態(tài)圖(反面)；
[0027]圖3A為XJ-14菌株在含DOP的基本培養(yǎng)基上生長14天的菌落形態(tài)圖；
[0028]圖3B為XJ-14菌株在不含DOP的基本培養(yǎng)基上生長14天的菌落形態(tài)圖。

【具體實施方式】
[0029]實施例1菌株分離
[0030]1、培養(yǎng)基配制
[0031](I)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA):在馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g中加蒸餾水定容至100mL ;然后進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121 °C 下滅菌 20min)。
[0032](2) 2%水瓊脂(WA)培養(yǎng)基:瓊脂粉20g、水100mL,進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121°C下滅菌20min)。
[0033](3)基本培養(yǎng)基=K2HPO4.3H20 9g、KH2PO4 3g、MgSO4.7Η200.lg、(NH4)2SO4 lg、瓊脂15g、水lOOOmL，進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個大氣壓，121°C下滅菌20min)。
[0034]2、菌株分離
[0035]XJ-14菌株是從我國新疆維吾爾自治區(qū)昌吉回族自治州昌吉市(東經(jīng)80° 12’ 13.68”，北緯120° 7’ 11.28”)小麥田中的地膜上分離得到的，其分離步驟為:
[0036](I)采集麥田中上個生長季使用過的地膜，在實驗室用自來水漂洗干凈，無菌水漂洗3次；
[0037](2)處理后的地膜用無菌刀片切成3 X 3cm2的小塊,置于含50 μ g.ml-1氨節(jié)青霉素和50 μ g.ml-1鏈霉素的2%水瓊脂(WA)平皿上，25 °C暗培養(yǎng)3天后，在解剖鏡下檢查，用挑針將在地膜上長出的菌絲移接到直徑為6cm的PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)7天；
[0038](3)將5ml無菌水加到長好菌落的直徑為6cm的平板上，洗下孢子，轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管中，取100 μ L孢子液滴在血球計數(shù)板上，顯微鏡下計數(shù)；
[0039](4)取100 μ L孢子液加到一個新的1.5mL離心管中，根據(jù)計數(shù)結(jié)果，加適量無菌水配成濃度為2000個孢子/mL的孢子液；將10mL的2%水瓊脂(WA)培養(yǎng)基融化后，室溫冷卻至50°C，再加入氯霉素儲備液和鏈霉素儲備液各100 μ L，混勻后倒平板；取50 μ L調(diào)好濃度的孢子液均勻涂布在已經(jīng)倒好的含氯霉素和鏈霉素水瓊脂平板上，培養(yǎng)2天；
[0040](5)在倒置顯微鏡下，找到單個孢子萌發(fā)形成的小菌落，用挑針轉(zhuǎn)移到新的PDA平板上，25°C培養(yǎng)5天，得到單孢分離的純培養(yǎng)物；
[0041](6)通過上述方法分離得到了 230株真菌純培養(yǎng)物，將分離得到的真菌純培養(yǎng)物接種在含有0.2%的DOP的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，發(fā)現(xiàn)菌株XJ-14生長出菌絲。將菌株XJ-14保存在PDA培養(yǎng)基上。
[0042]3、菌株鑒定
[0043](I)形態(tài)鑒定
[0044]XJ-14經(jīng)過單孢分離純化后，接種到PDA培養(yǎng)基上，22°C培養(yǎng)14天。用挑針挑取少量菌體，制成玻片，在顯微鏡下觀察，測量，拍照。分生孢子和分生孢子梗形態(tài)如圖1所示，菌落生長狀態(tài)如圖2所示。
[0045]由圖1和圖2可見，XJ-14在PDA平板上22°C黑暗培養(yǎng)14天，菌落直徑5.2-7.8cm，菌落白色至淺紅色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，1.4-2.7 μ m寬，菌落表面的菌絲頂端常凝結(jié)有許多細(xì)小的水滴，菌落邊緣有放射狀的洼陷；分生孢子梗單生，無色，分支或不分支，在分生孢子梗的頂端或側(cè)面產(chǎn)生1-多個瓶梗狀產(chǎn)孢細(xì)胞，(2.3-) 5.5-28.8 (-31.5) X (1.4_) 1.8-3.1 (-3.6)μ m，瓶梗頂端1.1-1.8 μ m，產(chǎn)孢后往往留下圍領(lǐng)型的圓柱狀產(chǎn)孢痕，深度1.4-2.3μπι;許多分生孢子在瓶梗頂端聚集，并附著一滴水珠，形成圓球形孢子球；分生孢子無色，兩邊對稱，無隔膜或有I個隔膜，有時分生孢子的側(cè)面略彎曲，使分生孢子的兩端明顯不同，一端較鈍，一端較尖銳，(4-) 4.5-9.6 (-10.9) X (1.8) -2.3-2.7 μ m。
[0046](2)分子鑒定
[0047](2.1) DNA 提取
[0048]1)XJ_14菌株在PDA平板上生長14天后，用牙簽刮取平板上的菌絲，放入已滅菌的含有300 μ L提取緩沖液1.5mL離心管中；
[0049]2)用電磨機將挑取的菌絲磨碎，然后再加入300 μ L提取緩沖液，劇烈震蕩2min ；
[0050]3) 1000rpm 離心 1min ；
[0051]4)吸取上清至另一離心管中，棄沉淀；
[0052]5)加入等體積的異丙醇(分析純)，沉淀核酸，輕輕顛倒混勻數(shù)次后，12000rpm離心 1min ；
[0053]6)輕輕倒去上清液，在吸水紙上排干水分；
[0054]7)加入300 μ L 70%乙醇，輕輕顛倒混勻數(shù)次后，12000rpm離心2min ；
[0055]8)輕輕倒去上清液，在吸水紙上排干水分，置于37°C下15min，使乙醇充分揮發(fā)；
[0056]9)用50 μ L ddH20重懸沉淀，得到XJ-14基因組DNA，濃度達(dá)到30ng/ μ L。
[0057](2.2)真菌ITS rDNA基因的PCR擴增
[0058]采用50 μ L反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴增，體系中含有:上下游引物各2 μ M，dNTPs200 μ Μ, Mg2+ 1.5mM, 10XPCR buffer 5 μ L，模版 DNA 2 μ L, Taq 酶 2U。
[0059]上游引物ITSl 序列為 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，
[0060]下游引物ITS4 序列為 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。
[0061]PCR擴增反應(yīng)在朗基MG96G型PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性2min，然后35個循環(huán)包括:94°C變性30sec，55°C退火40sec，72°C延伸lmin。最后72°C后延伸lOmin。
[0062](2.3) PCR產(chǎn)物的回收純化
[0063]PCR反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用愛思進(jìn)生物技術(shù)公司的DNA凝膠純化試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行。步驟如下:
[0064]I)電泳結(jié)束后，在紫外燈下用刀片切取含目的DNA片段的凝膠，置于2mL離心管中,稱重；
[0065]2)加入3倍體積的DE-A緩沖液，75°C保溫lOmin，期間振蕩數(shù)次，至完全融化；
[0066]3)加入0.5個倍體積的DE-B緩沖液，混合均勻；
[0067]4)將DNA制備管放入2mL離心管中，將混合液轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，12000rpm離心lmin,棄上清；
[0068]5)將DNA制備管放回2mL離心管中，加500 μ L緩沖液Wl, 12000rpm離心30s ；
[0069]6)將DNA制備管放回2mL離心管中，加700 μ L緩沖液W2, 12000rpm離心30s ；
[0070]7)重復(fù)步驟6) 一次；
[0071]8)將DNA制備管放回2mL離心管中，12000rpm離心2min。以排干膜上洗滌液；
[0072]9)將DNA制備管放回2mL離心管中，加50 μ L的ddH20，1000rpm離心lmin，洗脫DNA置-20°C下保存。
[0073](2.4)基因的測序和序列分析
[0074]將純化回收的目的DNA片段經(jīng)電泳檢測后送至上海生工用ABIPRISMA377型自動測序儀進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)過嚴(yán)格核對后，得到如SEQ ID N0.1所示的長度為499bp的DNA片段序列。
[0075]將測得的核苷酸序列用BLAST在GenBank中查找和比對同源或相似的核苷酸序列。根據(jù)同源序列的數(shù)據(jù)庫注釋，再結(jié)合菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)來判斷所研究菌株的種屬。經(jīng)過BLAST比對，該序列與登錄號為KC845227和KC845226的序列覆蓋率100%，相似度達(dá)到99%。這兩個序列都是來自煙草織抱霉菌Plectosporium tabacinum的ITS rDNA。這些結(jié)果表明分子鑒定與形態(tài)鑒定結(jié)果相符。XJ-14菌株為煙草織孢霉菌菌株，對該菌株進(jìn)行了如下保藏:保藏名稱為:煙草織孢霉菌Plectosporium tabacinum,保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學(xué)；保藏日期:2013年5月26，保藏號=CCTCC No:M 2013232。
[0076]實施例2XJ-14對DOP的降解利用
[0077]在實施例1的基本培養(yǎng)基中加入終濃度0.2%的鄰苯二甲酸二丁辛酯，獲得本實施例的生長培養(yǎng)基。
[0078]將菌株XJ-14在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，從菌落邊緣挑取約3 X 3的cm2的菌塊，置于含有DOP的生長培養(yǎng)基的直徑9cm的平板中央，以不加DOP的基本培養(yǎng)基為對照，置于25°C培養(yǎng)14天，觀察生長情況，觀察結(jié)果如圖3所示。
[0079]由圖3可見，菌株XJ-14在含DOP的生長培養(yǎng)基上明顯生長，而對照則沒有生長，表明XJ-14可以利用DOP作為唯一碳源和能源，將DOP分解以提供碳素營養(yǎng)，供自身菌絲生長應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1.一種煙草織孢霉菌，其特征在于，命名為煙草織孢霉菌(Plectosporium tabacinum)XJ-14，保藏編號為:CCTCC NO:M2013232o
2.一種含有如權(quán)利要求1所述煙草織孢霉菌的菌劑。
3.如權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于，所述菌劑采用煙草織孢霉菌的孢子制成。
4.如權(quán)利要求3所述的菌劑，其特征在于，菌劑中煙草織孢霉菌孢子的濃度為1.0X 16 ~18 個/mL。
5.如權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于，所述菌劑采用煙草織孢霉菌的菌絲制成。
6.如權(quán)利要求1所述煙草織孢霉菌在降解增塑劑中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，包括:將煙草織孢霉菌的菌懸液或孢子懸液投加到被增塑劑污染的土壤或水體中。
8.如權(quán)利要 求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述增塑劑為鄰苯二甲酸二辛酯。
【文檔編號】C02F3/34GK104073443SQ201410129934
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】王洪凱, 林福呈 申請人:浙江大學(xué)