小菜蛾蛋白酶體亞基α6基因在溴氰菊酯抗性治理中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于害蟲抗藥性機(jī)理與防治領(lǐng)域，具體涉及小菜蛾蛋白酶體亞基α6基因在溴氰菊酯抗性治理中的應(yīng)用。本發(fā)明用prosalpha6基因RNAi后幼蟲的抗藥性水平明顯下降，用同樣劑量的溴氰菊酯處理后，干擾組幼蟲的存活率下降了2.5倍，與對(duì)照組之間有顯著差異。本發(fā)明通過個(gè)體和細(xì)胞水平分別證明該基因與溴氰菊酯的抗性密切相關(guān)，對(duì)進(jìn)一步闡明溴氰菊酯的抗性機(jī)理以及在抗性的防治應(yīng)用中均具有重要的意義。
【專利說明】
小菜蛾蛋白酶體亞基α6基因在溴氰菊酯抗性治理中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于害蟲抗藥性機(jī)理與防治領(lǐng)域，具體涉及小菜蛾泛蛋白酶體α6亞基基因 pro sa 1 pha6及一種治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 連續(xù)、大量、單一使用一種或一類藥劑是導(dǎo)致昆蟲產(chǎn)生抗藥性的主要原因。在連年 大量使用某一藥劑以后，對(duì)該藥耐藥力弱的昆蟲經(jīng)自然選擇后被淘汰，而耐藥性強(qiáng)的個(gè)體 得以存活下來并得到迅速繁殖，從而相關(guān)的抗藥性基因也通過遺傳保留了下來，并且隨著 化學(xué)藥劑用量的增加，這些抗藥性基因又經(jīng)過殺蟲劑作用和選擇，如此逐代的選擇作用，抗 藥性積累加強(qiáng)，昆蟲的抗藥能力也逐漸增強(qiáng)，這就產(chǎn)生抗藥性品系的昆蟲。但是有關(guān)這些基 因與抗藥性關(guān)系的分析主要是在基因表達(dá)水平的差異比較，沒有進(jìn)行相關(guān)基因的敲減和增 強(qiáng)表達(dá)之后對(duì)殺蟲劑抗性水平影響的細(xì)胞和活體研究，缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，因此難以進(jìn) 行開發(fā)和應(yīng)用。
[0003] 小菜蛾prosalpha6基因是20S蛋白酶體的一個(gè)結(jié)構(gòu)亞基，尚未有該基因與溴氰菊 酯抗性相關(guān)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供小菜蛾對(duì)溴氰菊酯的抗性相關(guān)基因及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明首先以果繩Kc細(xì)胞作為模式系統(tǒng)，分析prosalpha6基因與溴氰菊酯抗性的 關(guān)系。根據(jù)GenBank中已有的果繩prosalpha6基因序列，設(shè)計(jì)引物克隆出果繩prosalpha6基 因的開放閱讀框序列，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明果蠅prosalpha6基因是溴氰菊酯抗性相關(guān)基因。
[0000]發(fā)明人進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小菜蛾的Prosalpha6蛋白基因在溴氰菊酯抗性品系中的 表達(dá)水平明顯高于敏感品系。
[0007]本發(fā)明公開了小菜蛾prosalpha6基因在治理小菜蛾的溴氰菊酯抗性中的應(yīng)用。 [0008] 小菜蛾蛋白酶體α6亞基基因 prosalpha6的dsRNA在制備小菜蛾對(duì)溴氰菊酯增敏劑 中的應(yīng)用。
[0009] 一種利用蛋白酶體α6亞基基因 prosalpha6治理小菜蛾溴氰菊酯抗性的方法，其步 驟是：
[0010] (1)用prosalpha6的SEQ ID N0.1 和SEQ ID N0.2引物，按照MEGAscriptRNAi Kit 說明書進(jìn)行操作，合成小菜蛾蛋白酶體α6亞基基因 prosalpha6的dsRNA;
[0011] (2)核酸酶消化以去除DNA和ssRNA;
[0012] (3)純化 dsRNA;
[0013] (4)將prosalpha6的dsRNA噴灑到田間小菜蛾的卵、幼蟲和飼料上，通過滲透和取 食，dsRNA進(jìn)入小菜蛾細(xì)胞，沉默prosalpha6基因；
[0014] (5)48小時(shí)后施溴氰菊酯類殺蟲劑。
[0015] 經(jīng)研究表明：prosalpha6基因 RNAi后幼蟲的抗藥性水平明顯下降，用同樣劑量的 溴氰菊酯處理后，干擾組幼蟲的存活率下降了 2.5倍，與對(duì)照組之間有顯著差異。
[0016]我們通過個(gè)體和細(xì)胞水平分別證明該基因與溴氰菊酯的抗性密切相關(guān)，因此本發(fā) 明對(duì)進(jìn)一步闡明溴氰菊酯的抗性機(jī)理以及在抗性的防治應(yīng)用中均具有重要的意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1果繩Kc細(xì)胞中prosalpha6的mRNA表達(dá)水平（*代表ρ〈0·05)。
[0018]圖2 prosalpha6的RNAi對(duì)不同濃度溴氰菊酯脅迫下細(xì)胞存活率的影響。*代表ρ〈 0.05〇
[0019] 圖3小菜蛾成活率檢測(cè)。*代表ρ〈0 · 05。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)施例一
[0021] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0022] 小菜蛾源自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)中曹鄉(xiāng)的甘藍(lán)地，室內(nèi)繁殖一代后測(cè)四齡幼蟲的 LD5q值，與武漢市蔬菜研究所的小菜蛾敏感品系四齡幼蟲LD5Q值比較，發(fā)現(xiàn)小菜蛾田間種群 為敏感種群。將其作為敏感品系同步隔離培養(yǎng)。小菜蛾溴氰菊酯抗性品系由點(diǎn)滴法處理小 菜蛾四齡幼蟲敏感品系經(jīng)多代繁育選育而成。
[0023] 2、prosalpha6 的功能研究
[0024 ] (1)不同濃度溴氰菊酯對(duì)pr 〇 sa 1 pha6的誘導(dǎo)作用
[0025] 用不同濃度的溴氰菊酯處理果蠅Kc細(xì)胞，采用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)不同濃度處 理細(xì)胞中prosalpha6基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，prosalpha6的表達(dá)量隨著藥物濃度的升 高而不斷被上調(diào)，呈現(xiàn)出一定的線性關(guān)系（圖1);
[0026] (2)prosalpha6基因 RNAi對(duì)細(xì)胞存活率的影響
[0027] RNA干擾48h后，用不同濃度的溴氰菊酯處理干擾組(dsRNA)和對(duì)照組(control)細(xì) 胞24h，臺(tái)盼藍(lán)試劑檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果表明：在一系列濃度的溴氰菊酯脅迫下，干擾組細(xì) 胞的存活率明顯低于對(duì)照組細(xì)胞的存活率(圖2)。
[0028] (3)小菜蛾prosalpha6基因 RNAi對(duì)溴氰菊酯抗性水平的影響
[0029] ①小菜蛾prosalpha6基因 RNAi的合成
[0030]根據(jù)prosalpha6基因的保守序列利用pp5軟件設(shè)計(jì)下列引物，合成出小菜蛾 prosalpha6 基因的dsRNA。
[0031] 上游引物：
[0032] S^TAATACGACTCACTATAGGGATGTTTCGCAACCAGTACGA-S7 (SEQ ID N0.1)
[0033] 下游引物：
[0034] S^TAATACGACTCACTATAGGGCTATGGACGCTGCTCGGT-S7 (SEQ ID NO.2)
[0035] ②構(gòu)建表達(dá)載體
[0036] 核酸酶消化以去除DNA和ssRNA。
[0037] ①冰上加樣消化液如下
[0039] ②置于37Γ孵育lh;
[0040] 純化 dsRNA。
[0041 ]①組裝反應(yīng)液
[0043] ②輕輕吹打混勻組裝反應(yīng)液，室溫13000rpm條件下離心2min，棄濾液；
[0044] ③吸取500yL Wash Solution加入到制備管中，室溫下13000rpm離心2min，棄濾 液；
[0045] ④重復(fù)步驟③一次；
[0046] ⑤再空管離心30sec以盡可能的去除多余的液體；
[0047]⑥將制備管放入一個(gè)新的收集管中，向其中加入50yL預(yù)先加熱至大于95°C的 Elution Solution，最大轉(zhuǎn)速離心2min，收集濾液；
[0048]⑦重復(fù)步驟⑥一次；
[0049]⑧分光光度計(jì)測(cè)定產(chǎn)物的A26Q以檢測(cè)dsRNA的濃度將擴(kuò)增的prosalpha6基因的 dsRNA插入pET_2P (購(gòu)自promega公司）構(gòu)建雙鏈RNA表達(dá)載體pET-2P_pros。
[0050] ③雙鏈RNA在大腸桿菌中的表達(dá)
[0051 ] 取5yL pET-2P-pros質(zhì)粒加入到50yL解凍后的HT115感受態(tài)細(xì)胞中，加入IPTG使終 濃度為〇. ImM，37°C條件下連續(xù)培養(yǎng)5h，對(duì)照組不加 IPTG誘導(dǎo)，相同條件下培養(yǎng)5h。
[0052]④小菜蛾抗溴氰菊酯品系幼蟲喂食dsRNA
[0053]將菌液和超純水以1:10的比例混合至菌體沉淀完全溶解，將大小相同的新鮮甘藍(lán) 葉片置于菌液中浸泡l〇s，晾干后放于直徑9cm，高1.5cm的玻璃培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放置 15頭幼蟲。未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)組和只用超純水處理組作為對(duì)照組，同樣每個(gè)培養(yǎng)皿15頭幼蟲。各 設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60頭幼蟲，連續(xù)喂食dsRNA浸漬的新鮮葉片3天。
[0054]④毒力測(cè)定
[0055] 將溴氰菊酯以丙酮作為溶劑配成濃度2500ppm，分別對(duì)prosalpha6基因干擾組、未 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)組和只用超純水處理組的小菜蛾幼蟲進(jìn)行毒力測(cè)定。適宜條件下培養(yǎng)48小時(shí)， 統(tǒng)計(jì)不同處理組的幼蟲死亡數(shù)。用鑷子觸動(dòng)蟲體，不活動(dòng)者計(jì)為死亡，統(tǒng)計(jì)死亡率。結(jié)果表 明，干擾了 prosalpha6基因的小菜蛾的成活率均明顯低于對(duì)照組，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。水處 理對(duì)照組設(shè)為1(圖3)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 蛋白酶體α6亞基基因 prosalpha6在治理溴氰菊酯抗性中的應(yīng)用。2. -種利用蛋白酶體α6亞基基因 prosalpha6治理小菜蛾溴氰菊酯抗性的方法，其步驟 是： (1) 用prosalpha6的SEQ ID N0.1 和SEQ ID N0.2引物，按照MEGAscriptRNAi Kit說明 書進(jìn)行操作，合成小菜蛾蛋白酶體妨亞基基因 prosalpha6的dsRNA; (2) 核酸酶消化以去除DNA和ssRNA; (3) 純化 dsRNA; (4) 將prosalpha6的dsRNA噴灑到田間小菜蛾的卵、幼蟲和飼料上，通過滲透和取食， dsRNA進(jìn)入小菜蛾細(xì)胞，沉默prosalpha6基因； (5) 48小時(shí)后施溴氰菊酯類殺蟲劑。3. 小菜蛾蛋白酶體α6亞基基因 prosalpha6的dsRNA在制備小菜蛾對(duì)溴氰菊酯增敏劑中 的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/90GK105969808SQ201610304811
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月10日
【發(fā)明人】程羅根, 胡俊麗, 程晨, 焦東旭, 李風(fēng)良
【申請(qǐng)人】南京師范大學(xué)