人胃腸腫瘤中ypel3 基因的檢測(cè)試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了人胃腸腫瘤中YPEL3 基因的檢測(cè)試劑，該檢測(cè)試劑為一對(duì)特異性引物，其上游引物的核苷酸序列為：TTAGGTGATT TTTAATTTTT ACGGC，下游引物的核苷酸序列為：CTAAACTATC AATTCCCAAT TTCGA；該檢測(cè)試劑針對(duì)人胃腸腫瘤中YPEL3 基因，YPEL3 基因雖然目前認(rèn)為是與細(xì)胞衰老有關(guān)，但我們發(fā)現(xiàn)在胃腸腫瘤中，癌變組織與癌旁組織之間YPEL3 基因在熒光定量甲基化檢測(cè)中YPEL3基因甲基化程度不同，癌變組織YPEL3基因甲基化程度明顯高于癌旁組織，該檢測(cè)試劑具有檢測(cè)靈活快速，簡(jiǎn)單方便，針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠、效率高，經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)，有利于結(jié)直腸癌和胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療。
【專利說(shuō)明】
人胃腸腫瘤中基因的檢測(cè)試劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及消化系統(tǒng)腫瘤的檢測(cè)試劑，具體涉及人胃腸腫瘤中基因的檢 測(cè)試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 消化系統(tǒng)腫瘤中主要是惡性胃癌和結(jié)直腸癌，在所有消化系統(tǒng)惡性腫瘤死亡病例 中，約有一半的患者死于胃癌，結(jié)直腸癌近年來(lái)的發(fā)病率有明顯上升趨勢(shì)?，F(xiàn)用于診斷消化 系統(tǒng)中惡性腫瘤的方法主要包括消化內(nèi)鏡檢查，影像學(xué)檢查，生化和免疫學(xué)檢查及基因診 斷。免疫學(xué)檢查中胃癌的標(biāo)記物主要有CA199、CEA、CA242、CA125、AFP、NES等，結(jié)直腸癌的標(biāo) 記物主要有CA19-9、CEA、P53、K-ras等?；蛟\斷是近年來(lái)興起的檢測(cè)技術(shù)，具有快速、特異 和靈敏的優(yōu)點(diǎn)，如授權(quán)公告號(hào)為CN102787174的發(fā)明專利，就公開了針對(duì)與胃腸腫瘤相關(guān)折 抑癌基因 CPG表觀突變的檢測(cè)試劑，其中用25對(duì)引物測(cè)序CPG基因的啟動(dòng)子區(qū)，基因啟動(dòng)子 區(qū)域高甲基化可導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默，致使腫瘤的發(fā)生，從而確認(rèn)胃腸腫瘤。但該發(fā)明專 利需要對(duì)胃腸腫瘤DNA進(jìn)行25對(duì)引物的PCR檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜，延緩了病患的 確診和救治時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種人胃腸腫瘤中基因的檢測(cè)試劑，該 檢測(cè)試劑具有檢測(cè)靈活快速，簡(jiǎn)單方便，針對(duì)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:人胃腸腫瘤中基因的檢測(cè) 試劑，該檢測(cè)試劑為一對(duì)特異性引物，其特征在于該對(duì)特異性引物核苷酸序列如下： 上游引物的核苷酸序列為:5'_ TTAGGTGATT TTTAATTTTT ACGGC -3'， 下游引物的核苷酸序列為:5'_ CTAAACTATC AATTCCCAAT TTCGA -3'。
[0005] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于人胃腸腫瘤中基因的檢測(cè)試劑，該檢 測(cè)試劑為一對(duì)特異性引物，其上游引物的核苷酸序列為:TTAGGTGATT TTTAATTTTT ACGGC， 下游引物的核苷酸序列為:CTAAACTATC AATTCCCAAT TTCGA;該檢測(cè)試劑針對(duì)人胃腸腫瘤中 基因，基因雖然目前認(rèn)為是與細(xì)胞衰老有關(guān)，但我們發(fā)現(xiàn)在胃腸腫瘤中，癌變 組織與癌旁組織之間基因在熒光定量甲基化檢測(cè)中基因甲基化程度不同，癌 變組織基因甲基化程度明顯高于癌旁組織，該檢測(cè)試劑具有檢測(cè)靈活快速，簡(jiǎn)單方 便，針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠、效率高，經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)，有利于結(jié)直腸癌和胃癌的早期發(fā)現(xiàn)和及 時(shí)治療。
【具體實(shí)施方式】
[0006] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0007] 實(shí)施例1 人胃腸腫瘤中基因的檢測(cè)試劑，該檢測(cè)試劑為一對(duì)特異性引物，其上游引物的 核苷酸序列為：5'_ TTAGGTGATT TTTAATTTTT ACGGC -3'，下游引物的核苷酸序列為：5'_ CTAAACTATC AATTCCCAAT TTCGA -3'。是針對(duì)基因的啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)的熒光定量甲 基化特異性擴(kuò)增上游引物和熒光定量甲基化特異性擴(kuò)增下游引物，經(jīng)過(guò)我們大量篩選施驗(yàn) 確認(rèn)得到，引物由上海生功生物工程股份有限公司合成。
[0008] 實(shí)施例2 利用實(shí)施例1的一對(duì)引物進(jìn)行病例檢測(cè)，具體檢測(cè)過(guò)程如下： 1、DNA提取:我們從寧波第三人民醫(yī)院采集5例胃癌石蠟樣本和對(duì)應(yīng)的癌旁組織石蠟樣 本，用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(購(gòu)于Qiagen, Hilden,德國(guó)）DNA提取試劑盒提取DNA 樣本，我們從寧波第三人民醫(yī)院采集5例結(jié)直腸癌石蠟樣本和對(duì)應(yīng)的癌旁組織石蠟樣本，同 樣提取，得到DNA樣本，DNA樣本要求DNA的吸光度(A)的比值(A260/A280)約為1.80。
[0009] 2、DNA樣本甲基化:采用EZ DNA甲基化試劑盒(購(gòu)于Zymo公司，美國(guó)）對(duì)樣本DNA進(jìn) 行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，用重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，可使發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)堿基保持 不變，而使未發(fā)生甲基化的C轉(zhuǎn)變成了尿嘧啶（U)，然后通過(guò)熒光定量進(jìn)行PCR反應(yīng)，測(cè)序 基因甲基化率。
[0010] 3、PCR反應(yīng)：取DNA樣本1.6ul加入到10ul SYBR Green混合液（購(gòu)于Roche公司， 美國(guó)）中，再加入6.8ul無(wú) DNA和RNA酶水，并加入上述一對(duì)17貨/^基因的特異性擴(kuò)增引 物，進(jìn)行熒光定量PCR甲基化擴(kuò)增;所采用的熒光定量甲基化程序?yàn)?首先95°C lOmin的變 性;接著95°C 20s，60°C 30s，72°C 30s，共45個(gè)循環(huán)的退火反應(yīng);反應(yīng)完成后是95°C lmin， 59°C 30s，95°C 30s進(jìn)入熔解曲線分析，判斷產(chǎn)物的特異性。
[0011] 4、完畢后，利用2^^方法分析各樣本基因甲基化程度，其中ACT = CTct? -CT (管家基因，購(gòu)于上海生功生物工程股份有限公司）、陽(yáng)性對(duì) 照（甲基化標(biāo)準(zhǔn)品DNA，購(gòu)于Zymo公司）的檢測(cè)同步驟2、3,采用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分 析，我們發(fā)現(xiàn):結(jié)直腸癌變組織與癌旁組織之間，胃癌癌變組織與癌旁組織之間的DNA甲基 化水平均存在顯著差異如表1。
[0012] 表1:癌變組織基因與癌旁組織基因甲基化率比較表
從表1中可以看出，在胃癌和結(jié)直腸癌病癥患者中，通過(guò)基因的檢測(cè)試劑檢測(cè)， 其癌變組織的甲基化率明顯高于癌旁組織。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.人胃腸腫瘤中基因的檢測(cè)試劑，該檢測(cè)試劑為一對(duì)特異性引物，其特征在于 該對(duì)特異性引物核苷酸序列如下： 上游引物的核苷酸序列為：TTAGGTGATT TTTAATTTTT ACGGC， 下游引物的核苷酸序列為：CTAAACTATC AATTCCCAAT TTCGA。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105969896SQ201610561599
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年7月18日
【發(fā)明人】葉孟, 李錦蕓, 周重昌, 倪超, 楊平, 陳思, 畢旭兒
【申請(qǐng)人】寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院