線粒體靶向超氧陰離子成像探針及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了線粒體靶向超氧陰離子成像探針及其制備方法。該線粒體靶向超氧陰離子探針的結(jié)構(gòu)式可為式Ⅰ或式Ⅰ′所示化合物。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明設(shè)計(jì)和合成了一系列線粒體靶向超氧陰離子成像探針，本發(fā)明探針中在苯并戊內(nèi)酯的苯環(huán)上引入了線粒體靶向基團(tuán)，能夠定向靶向性的到達(dá)細(xì)胞的線粒體，對細(xì)胞線粒體具有高度的選擇性；本發(fā)明探針是在4-硝基熒光素的兩個(gè)羥基上與二苯次磷酰氯成酯，引入了雙檢測基團(tuán)的探針鏈，能夠?qū)Τ踝杂苫x擇性檢測；本發(fā)明探針能實(shí)時(shí)和高選擇性地檢測出線粒體內(nèi)超氧陰離子的產(chǎn)生，對線粒體中其他活性氧則沒有反應(yīng)，對超氧陰離子的檢測具有專一性。
【專利說明】
線粒體靶向超氧陰離子成像探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種線粒體靶向超氧陰離子成像探針及其制備方法，屬于分子檢測和 分子成像領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 線粒體是一種廣泛存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的由兩層膜包被的細(xì)胞器，直徑在 0.5到10微米左右。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP)的主要場所，為 細(xì)胞的活動提供了能量，所以有"細(xì)胞動力工廠"之稱。除了為細(xì)胞供能外，線粒體還參與 諸如調(diào)節(jié)膜電位并控制細(xì)胞程序性死亡；細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與細(xì)胞代謝的調(diào)控；合成膽 固醇及某些血紅素；負(fù)責(zé)細(xì)胞信息傳遞并擁有調(diào)控細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的能力。
[0003] 自由基是一些能夠獨(dú)立存在的，具有一個(gè)或多個(gè)未成對電子的原子或分子。當(dāng)兩 個(gè)電子自旋方向相反，成對在同一個(gè)軌道上，那么它們就更加穩(wěn)定。生物體內(nèi)自由基是來自 機(jī)體正常生理代謝過程和生存環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)生的不穩(wěn)定中間產(chǎn)物，它是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要 信使分子，與生物體內(nèi)各種生理作用及病理現(xiàn)象密切相關(guān)。大量研究表明，動物細(xì)胞內(nèi)的自 由基有99%來自線粒體的電子傳遞鏈上。體內(nèi)重要的一類自由基是活性氧自由基，也稱為 活性氧，一般包括〇 2 ·、· 〇H、R00 ·、R0 ·等。
[0004] 活性氧，顧名思義，就是比起普通的氧分子，它們有著更高的氧化還原活性。活性 氧不僅包括一些自由基，如羥自由基（·〇Η)，超氧陰離子（0 2·)，過氧羥自由（·Η02)，過氧 自由基（R00 ·)和烷氧基自由基（R0 ·)，也包括了一些非自由基，即過氧化氫（Η202)，單線 態(tài)氧（1〇2)和次氯酸（H0C1)?；钚匝跏侵冈谏矬w內(nèi)與氧代謝有關(guān)的含氧自由基和易形成 自由基的過氧化物的總稱，機(jī)體內(nèi)氧化代謝可不斷形成活性氧，在一定的空間、時(shí)間和一定 的限度內(nèi)活性氧有積極的生理作用。
[0005] 自由基分為氧化性和還原性自由基，在體內(nèi)處于平衡狀態(tài)，調(diào)控體內(nèi)的氧化-還 原平衡，一旦一方過量失去平衡就會對細(xì)胞造成損傷，帶來一系列疾病。自由基可攻擊生命 大分子物質(zhì)及細(xì)胞壁，造成機(jī)體的多種損傷和病變，加速機(jī)體的衰老；自由基摧毀細(xì)胞膜， 導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生變性，使得細(xì)胞不能從外部吸收營養(yǎng)，也排泄不出細(xì)胞體內(nèi)的代謝廢物，并 喪失了對細(xì)菌和病毒的抵御能力。從而使人體免疫力低下、疲勞和器官病變。如果導(dǎo)致細(xì) 胞死亡或細(xì)胞內(nèi)雜質(zhì)無法代謝就會形成色素沉積，產(chǎn)生黃褐斑、蝴蝶斑、老年斑等；自由基 攻擊正在復(fù)制中的基因，造成基因突變，誘發(fā)癌癥發(fā)生；自由基氧化血液中的脂蛋白造成膽 固醇向血管壁的沉積，引起心臟病、中風(fēng)、動脈硬化、腦血栓、腦溢血、偏癱或高血壓等心腦 血管病癥。侵蝕腦細(xì)胞使人易患老年性癡呆；自由基作用于人體內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致膠原蛋 白酶和硬彈性蛋白酶的釋放，這些酶作用于皮膚中的膠原蛋白酶和硬彈性蛋白并使這兩種 蛋白產(chǎn)生過度交聯(lián)并降解，結(jié)果使皮膚失去彈性，出現(xiàn)皺紋及囊泡，使體內(nèi)毛細(xì)血管脆性增 加，使血管容易破裂，這可導(dǎo)致靜脈曲張，水腫等與血管通透性升高有關(guān)的疾病的發(fā)生；自 由基引起關(guān)節(jié)膜及關(guān)節(jié)滑液的降解，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎；侵蝕胰臟細(xì)胞引起糖尿??；損傷肝 臟器官導(dǎo)致肝炎。
[0006] 人體內(nèi)自發(fā)產(chǎn)生的適量的活性氧是相當(dāng)重要的，它們涵蓋了不同的生命活動，諸 如在信號轉(zhuǎn)換，神經(jīng)傳遞，肌肉舒展放松及蠕動，血小板凝集，血壓調(diào)節(jié)，免疫系統(tǒng)控制，學(xué) 習(xí)和記憶，能量產(chǎn)生，細(xì)胞常規(guī)生長，重要的生命化合物的合成和機(jī)體的新陳代謝中，都發(fā) 揮了重要的作用。然而，當(dāng)活性氧產(chǎn)生過量或機(jī)體自身的抗氧化劑的量大量減少時(shí)，活性氧 就變得相當(dāng)有害了。它們通過氧化生物分子，使得細(xì)胞脂質(zhì)膜、蛋白質(zhì)組織、酶、碳水化合物 或DNA等氧化損傷，造成細(xì)胞損壞或死亡?？傊谝话慵?xì)胞環(huán)境中，活性氧對于生命體是 必不可少的，但過量的活性氧就會造成危害。
[0007] 自由基的種類很多，用來說明衰老發(fā)生機(jī)制的自由基，主要是超氧自由基、羥自由 基和類脂質(zhì)過氧化自由基。在線粒體內(nèi)膜，分子氧（〇 2)首先接受一個(gè)電子被還原成超氧自 由基（〇2)，生成的超氧再進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成H0 ·、0N00 -、R00 ·和R0 ·等活性更高的氧自由基 (R0S)。超氧自由基作用的產(chǎn)物，都是強(qiáng)氧化劑，可使類脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸氧化為類脂 過氧化物。它們都是引發(fā)脂質(zhì)過氧化自由基反應(yīng)的氧化劑，在正常情況下，由于生物體內(nèi)存 在自由基清除劑，如性激素、S0D、過氧化氫酶等使生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除保持相對 平衡，并參與許多正常的生理生化反應(yīng)。若自由基清除劑的合成惡性化或自由基反應(yīng)發(fā)生 紊亂，則會導(dǎo)致機(jī)體一系列的病理改變。超氧自由基能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，加快肌體的衰 老過程，并可誘發(fā)癌癥、心血管疾病等，嚴(yán)重危害人體健康，人體通過超氧化物歧化酶（S0D) 將其轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧氣除去。由此可見，超氧自由基是誘導(dǎo)自由基反應(yīng)鏈啟動的首要 自由基，它與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而線粒體是超氧陰離子產(chǎn)生的主要場所，能夠 定向靶向性地在超氧陰離子產(chǎn)生地線粒體中實(shí)現(xiàn)對超氧的檢測對研究自由基以及超氧引 起的相關(guān)疾病的預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種線粒體靶向超氧陰離子成像探針及其制備方法，本發(fā)明 線粒體靶向超氧陰離子探針能夠?qū)崿F(xiàn)定向靶向性檢測線粒體內(nèi)超氧陰離子檢測。
[0009] 本發(fā)明提供的化合物，其結(jié)構(gòu)式為式I或式P，
[0011] 式I和式I '中：X M+-L-D和X M+均為線粒體靶向分子基團(tuán)；
[0012] M+為R 3P+、R3N+，R為碳原子數(shù)為2~6的鏈狀烷基或苯基；
[0013] X 為 Cl、Br 或 I ;
[0014] L為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀烷基、_(0CH2CH2)n-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的 直鏈，其中η為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合；
[0015] D為-C0NH-、-CH2-NH-或-C0-0-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的 任意一種： _C0NH_、_CH2_NH _ 和 _C0_0_〇
[0016] 本發(fā)明中氨基酸指的是廣義上的氨基酸，即含有氨基和羧基的化合物。
[0017] 本發(fā)明上述式I所示化合物中，M+為R3P+，R為苯基；X為Br ;L為碳原子數(shù)為3 的鏈狀烷基；D為-CH2-NH-;即式I所示化合物的結(jié)構(gòu)式具體可如下：
[0018]
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述化合物式I的制備方法，該制備方法以4-硝基熒光素 為原料，利用帶正電基團(tuán)可靶向跨過線粒體膜導(dǎo)入線粒體的特點(diǎn)，將帶正電荷的官能團(tuán)結(jié) 合到4-硝基熒光素上，得到上述式I線粒體靶向成像探針；包括如下步驟：
[0020] (1)在有機(jī)溶劑I中，4-硝基熒光素與二苯基次磷酰氯進(jìn)行反應(yīng)I，得到中間產(chǎn) 物I ;
[0021]
[0022] 所述有機(jī)溶劑I為DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0023] (2)在有機(jī)溶劑II中，所述中間產(chǎn)物I進(jìn)行反應(yīng)II，還原劑將硝基還原為氨基，得 到中間產(chǎn)物II，
[0024]
[0025] 所述有機(jī)溶劑II為DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0026] (3)在有機(jī)溶劑III中，在縮合劑的作用下所述中間產(chǎn)物II與XM+-L-D_Y進(jìn)行反應(yīng) III，得到式I所示化合物；
[0027] XM+-L-D-Y中，X為Cl、Br或I ;M+為R3P+、R3N+，R為碳原子數(shù)為2~6的鏈 狀烷基或苯基；L為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀烷基、-(0CH 2CH2)n-或2~10個(gè)氨基酸基 團(tuán)組成的直鏈，其中η為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合； D為-C0NH-、-CH2-NH-或-C0-0-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的任意一 種：-C0NH-、-CH 2-NH-和-C0-0- ;Y 為-OH、-Cl、-Br 或-I ;
[0028] 所述有機(jī)溶劑III為DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種。
[0029] 上述化合物式I的制備方法，步驟（1)中，所述4-硝基熒光素與所述二苯基次磷 酰氯的摩爾比為1 :1~4,具體可為1 :2. 1 ;所述反應(yīng)I的溫度為40~120°C，具體可為 80°C，時(shí)間為8~40h，具體可為10h ;
[0030] 步驟（2)中，所述中間產(chǎn)物I與所述還原劑的摩爾比為1 :1~3,具體可為1 :2 ; 所述反應(yīng)II的溫度為-40~0°C，時(shí)間為8~40h，具體可為15h ;所述還原劑為LiAlH4;
[0031] 步驟（3)中，所述中間產(chǎn)物II、所述XM+-L-D-Y與所述縮合劑的摩爾比為1 :1~5 : 1~3,具體可為1 :1. 1 :1. 1 ;所述反應(yīng)III的溫度為20~40°C，具體可為25°C，時(shí)間為15~ 40h，具體可為20h;所述縮合劑為二環(huán)己基碳二亞胺（EDC)、可溶于水的碳二亞胺（DCC)、 4_二甲氨基吡啶（DMAP)或0-苯并三氮唑-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸（TBTU)。
[0032] 上述化合物式I的制備方法，所述反應(yīng)I和所述反應(yīng)II結(jié)束后均包括冷卻至0~ 20°C的步驟；
[0033] 所述反應(yīng)III結(jié)束后還包括冷卻至0~30°C的步驟。
[0034] 本發(fā)明還提供了上述化合物式I ^的制備方法，該制備方法以4-硝基熒光素為 原料，利用帶正電基團(tuán)可靶向跨過線粒體膜導(dǎo)入線粒體的特點(diǎn)，將帶正電荷的官能團(tuán)結(jié)合 到4-硝基熒光素上，得到上述式I線粒體靶向成像探針；包括如下步驟 ：
[0035] (1)在有機(jī)溶劑I中，4-硝基熒光素與二苯基次磷酰氯進(jìn)行反應(yīng)I，得到中間產(chǎn) 物I ;
[0036]
[0037] 所述有機(jī)溶劑I為DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0038] (2)在有機(jī)溶劑II中，所述中間產(chǎn)物I進(jìn)行反應(yīng)II，還原劑將硝基還原為氨基，得 到中間產(chǎn)物II，
[0039]
[0040] 所述有機(jī)溶劑II為DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種；
[0041] (3)在有機(jī)溶劑III中，所述中間產(chǎn)物II與MX進(jìn)行反應(yīng)III，得到式I '所示化合物；
[0042] MX中，Μ為R3P、R3N，R為碳原子數(shù)2~6的鏈狀烷基或苯基；X為-Cl、-Br或-I ;
[0043] 所述有機(jī)溶劑III為DMSO、DMF、THF、乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿中至少1種。
[0044] 上述化合物式I '的制備方法，步驟（1)中，所述4-硝基熒光素與所述二苯基次 磷酰氯的摩爾比為1 :1~4 ;所述反應(yīng)I的溫度為40~120°C，時(shí)間為8~40h ;
[0045] 步驟⑵中，所述中間產(chǎn)物I與所述還原劑的摩爾比為1 :1~3 ;所述反應(yīng)II的溫 度為-40~0°C，時(shí)間為8~40h ;所述還原劑為LiAlH4;
[0046] 步驟⑶中，所述中間產(chǎn)物II、所述MX與所述縮合劑的摩爾比為1 :1~5 :1~3 ; 所述反應(yīng)III的溫度為20~40°C，時(shí)間為15~40h ;所述縮合劑為二環(huán)己基碳二亞胺、可溶 于水的碳二亞胺、4-二甲氨基吡啶或0-苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲四氟硼酸。
[0047] 上述化合物式I '的制備方法，所述反應(yīng)I和所述反應(yīng)II結(jié)束后均包括冷卻至 0~20°C的步驟；
[0048] 所述反應(yīng)III結(jié)束后還包括冷卻至0~30°C的步驟。
[0049] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述化合物式I或式I ^在制備線粒體靶向超氧自由基探 針中的應(yīng)用。
[0050] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述化合物式I或式I ^在線粒體靶向超氧自由基檢測和 線粒體靶向成像中的應(yīng)用。
[0051] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0052] (1)本發(fā)明設(shè)計(jì)和合成了一系列線粒體靶向超氧陰離子成像探針。
[0053] (2)本發(fā)明探針中在苯并戊內(nèi)酯的苯環(huán)上引入了線粒體靶向基團(tuán)，能夠定向靶向 性的到達(dá)細(xì)胞的線粒體，對細(xì)胞線粒體具有高度的選擇性。
[0054] (3)本發(fā)明探針是在4-硝基熒光素的兩個(gè)羥基上與二苯次磷酰氯成酯，引入了雙 檢測基團(tuán)的探針鏈，能夠?qū)Τ踝杂苫x擇性檢測。
[0055] (4)本發(fā)明探針能實(shí)時(shí)和高選擇性地檢測出線粒體內(nèi)超氧陰離子的產(chǎn)生，對線粒 體中其他活性氧則沒有反應(yīng)，對超氧陰離子的檢測具有專一性。
【附圖說明】
[0056] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中制備線粒體靶向超氧自由基成像探針的合成路線圖。
[0057] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備的線粒體靶向超氧自由基成像探針對H9C2的細(xì)胞毒 性中，不同濃度探針對H9C2的細(xì)胞毒性的柱形圖。
[0058] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制備的線粒體靶向超氧自由基探針在細(xì)胞內(nèi)D0X超氧檢測 和線粒體靶向定位試驗(yàn)成像照片，其中圖a為無刺激的線粒體探針Hochest成像的照片，圖 b為無刺激的本發(fā)明線粒體探針Mito-Superoxide-tracke成像的照片，圖c為無刺激的線 粒體探針Mito-SOX成像的照片，圖d為無刺激的Mito-Superoxide-tracker和Mito-SOX 疊加后的照片，圖e為加 D0X刺激的線粒體探針Hochest成像的照片，圖f為加 D0X刺激 的線粒體探針Mito-Superoxide-tracker 1成像的照片，圖g為加 D0X刺激的線粒體探針 Mit〇-S0X成像的照片，圖h為加 D0X刺激后的Mito-Superoxide-tracker和Mit〇-S0X疊加 后的照片。
[0059] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制備的線粒體靶向超氧自由基探針在細(xì)胞內(nèi)百草枯刺 激產(chǎn)生超氧檢測試驗(yàn)，其中圖a為無刺激的線粒體探針Mito-Superoxide-tracker成像 的照片，圖b為無刺激的線粒體探針Mito-SOX成像的照片，圖c為無刺激的線粒體探針 Mito-Superoxide-tracker和Mito-SOX成像的照片，圖d為線粒體探針在細(xì)胞明場照 片，圖e為加百草枯刺激的線粒體探針Mito-Superoxide-tracker成像的照片，圖f為 加百草枯刺激的線粒體探針Mito-SOX成像的照片，圖g為加百草枯刺激的線粒體探針 Mito-Superoxide-tracker和Mito-SOX成像的照片，圖h為加百草枯刺激的線粒體探針 Mito-Superoxide-tracker 明場照片。
[0060] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例1制備的線粒體靶向超氧自由基探針在細(xì)胞內(nèi)S0D處 理的百草枯刺激產(chǎn)生超氧檢測試驗(yàn)，其中圖a為百草枯刺激的線粒體探針Hochest成 像的照片，圖b為百草枯刺激的線粒體探針Mito-Superoxide-tracker成像的照片， 圖c為百草枯刺激的線粒體探針Mito-SOX成像的照片，圖d為百草枯刺激的線粒體 探針Mito-Superoxide-tracker和Mit〇-S0X成像的照片，圖e為加 S0D處理的百草 枯刺激的線粒體探針Hochest成像的照片，圖f為加 S0D處理的百草枯刺激的線粒 體探針Mito-Superoxide-tracker成像的照片，圖g為加 S0D處理的百草枯刺激的 線粒體探針Mito-SOX成像的照片，圖h為加 S0D處理的百草枯刺激的線粒體探針 Mito-Superoxide-tracker 和 Mit〇-S0X 成像的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0061 ] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0062] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0063] 實(shí)施例1、線粒體革巴向超氧陰離子成像探針Mito-Superoxide-tracker的制備和 應(yīng)用
[0064] ( 一）線粒體革巴向超氧自由基探針Mito-Superoxide-tracker的制備
[0065] 按照如圖1所示的合成路線制備線粒體靶向超氧自由基成像探針 Mito-Superoxide-tracker〇
[0066] (1)將4-硝基熒光素溶解在THF溶劑中，在20°C下慢慢滴加二苯磷酰氯到反應(yīng)液 中，4-硝基熒光素與二苯磷酰氯的摩爾比控制在1 :2. 1，在80°C攪拌反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束冷 卻到20°C，蒸干反應(yīng)溶劑，過柱和重結(jié)晶分離純化得中間產(chǎn)物I。
[0067] 結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下"H NMR(300MHz，DMS0, TMS) : δ 8. 65 (s, 2H)，8. 41 (m，J = 7. 5Hz，1H)，7· 86-7. 78 (m，J = 7. 5Hz，8H)，7· 65-7. 60 (d，J = 7. 5Hz，1H)，7· 55-7. 43 (m，J = 7. 5Hz, 8H), 7. 40-7. 29 (m, J = 7. 5Hz, 4H), 7. 25-7. 21 (d, J = 6. 5Hz, 1H), 7. 22-7. 10 (t, J =6. 8Hz, 1H) , 7. 18-7. 13 (m, J = 7. 5Hz, 1H) , 7. 03-6. 98 (d, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 92-6. 87 (d, J = 7. 5Hz, 1H), 6. 83-6. 71 (1, J = 7. 5Hz, 1H) ；13C NMR (300MHz, DMS0, TMS ):δ 169. 5, 151. 7, 147. 4, 145. 3, 143. 2, 140. 3, 134. 2, 133. 5, 132. 3, 130. 8, 129. 5, 129. 0 ,128. 8, 128. 1, 127. 2, 125. 8, 124. 1, 120. 1, 113. 9, 111. 9, 115. 2, 107. 7, 105. 7, 84. 8 ；m/ z(HRMS):Calcd.M-Br，F(xiàn)or C44H29N09P2:778. 3524, found:m/z = 777. 13。
[0068] 經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定所合成的化合物確為中間產(chǎn)物I。
[0069] (2)將中間產(chǎn)物I溶解在THF溶劑中，在-40°C下將LiAlH^g慢加入到反應(yīng)液中， 中間產(chǎn)物I與LiAlH 4的投料摩爾為1 :2,在-20°C攪拌反應(yīng)15h，反應(yīng)結(jié)束冷卻到20°C，蒸 干反應(yīng)溶劑，過柱和重結(jié)晶分離純化得中間產(chǎn)物Π 。
[0070] 結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下"H NMR(300MHz, DMS0, TMS) : δ 8. 65 (s, 2H)，8. 41 (m，J = 7. 5Hz，1H)，7· 86-7. 78 (m，J = 7. 5Hz，8H)，7· 65-7. 60 (d，J = 7. 5Hz，1H)，7· 55-7. 43 (m，J = 7. 5Hz，8H)，7. 40-7. 29 (m，J = 7. 5Hz，4H)，7. 25-7. 21 (d，J = 6. 5Hz，1H)，7. 22-7. 10 (t，J = 6. 8Hz, 1H), 7. 18-7. 13 (m, J = 7. 5Hz, 1H), 7. 03-6. 98 (d, J = 6. 0Hz, 1H), 6. 92-6. 87 (d, J = 7.5Hz，1H)，6.83-6.71(1，J = 7.5Hz，1H)，5.28(s，2H);13CMMR(300MHz，DMS0，TMS): δ 169. 5, 151. 7, 147. 4, 145. 3, 143. 2, 140. 3, 134. 2, 133. 5, 132. 3, 130. 8, 129. 5, 129. 0, 128. 8, 128. 1, 127. 2, 125. 8, 124. 1, 120. 1, 113. 9, 111. 9, 115. 2, 107. 7, 105. 7, 84. 8 ；m/ z(HRMS):Calcd.M-Br，F(xiàn)or C44H31N07P2:747. 6835, found:m/z = 747. 16。
[0071 ] 經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定所合成的化合物確為中間產(chǎn)物II。
[0072] (3)將中間產(chǎn)物II溶解在THF溶劑中，在10_40°C下將（3-丙羧基）三苯基溴化膦， 慢慢加入到反應(yīng)液中，中間產(chǎn)物II與（3-丙羧基）三苯基溴化膦投料摩爾比為1 :1. 1，加入 EDC縮合劑，中間產(chǎn)物II與縮合劑的投料比為1 :1. 1，在25°C攪拌反應(yīng)20h，反應(yīng)結(jié)束冷卻到 20°C，蒸干反應(yīng)溶劑，過柱和重結(jié)晶分離純化得目標(biāo)探針Mito-Superoxide-tracker。
[0073] 結(jié)構(gòu)確證結(jié)果如下,Η NMR(300MHz, DMS0, TMS) : δ 8. 65 (s, 2H)，8. 41 (m，J = 7. 5Hz，1H)，7· 86-7. 78 (m，J = 7. 5Hz，8H)，7· 75-7. 64 (m，J = 6. 5Hz，6H)，7· 65-7. 60 (d，J = 7. 5Hz，1H)，7. 55-7. 43 (m，J = 7. 5Hz，8H)，7. 40-7. 29 (m，J = 7. 5Hz，4H)，7. 36-7. 29 (m，J = 6. 5Hz, 3H), 7. 25-7. 21 (d, J = 6. 5Hz, 1H), 7. 22-7. 10 (t, J = 6. 8Hz, 1H), 7. 18-7. 13 (m, J = 7.5Hz，lH)，7.15-7.11(m，J = 6·5Ηζ，6Η) ,7.03-6. 98 (d，J = 6·0Ηζ，1Η)，6.92-6. 87 (d，J =7. 5Hz, 1H),6. 83-6. 71(1, J = 7. 5Hz, 1H), 5. 28 (s, 2H), 3. 68-3. 58 (t, J = 7. 5Hz, 2H) ,2. 46-2. 35 (t, J = 7. 5Hz, 2H),1.70-1.61(t, J = 7. 5Hz, 2H) ；13C NMR(300MHz, DMSO, TMS ):δ 169. 5, 151. 7, 147. 4, 145. 3, 143. 2, 140. 3, 134. 2, 133. 5, 132. 3, 130. 8, 129. 5, 129. 0 ,128. 8, 128. 1, 127. 2, 125. 8, 124. 1, 120. 1, 113. 9, 111. 9, 115. 2, 107. 7, 105. 7, 84. 8 ；m/ z(HRMS):Calcd. M-Br,For C66H51BrN08P3:1158. 9686, found:m/z = 1157.21〇
[0074] 由上述譜圖數(shù)據(jù)，可確認(rèn)本實(shí)施例制備得到的化合物的結(jié)構(gòu)如下：
[0075]
[0076] (二）應(yīng)用
[0077] (1)細(xì)胞毒性測試
[0078] 1)接種細(xì)胞：用含10%胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔 1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μ L。
[0079] 2)培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)24h。
[0080] 3)加藥：將本實(shí)施例制備的探針Mito-Superoxide-Tracker溶解在培養(yǎng)基中，加 入96孔板，每孔體積200 μ L，
[0081] 探針的濃度分別為 12. 5ηΜ、25ηΜ、50ηΜ、100ηΜ、200ηΜ、300ηΜ、400ηΜ、500ηΜ 和 ΙΟΟΟηΜ，不加探針的為對照組（con)，培養(yǎng)24h。
[0082] 4)呈色：培養(yǎng)24天后，每孔加 MTT溶液（5mg/mL用pH為7. 4的PBS配制）20 μ L， 繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)；小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔 內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μ L DMS0,振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。
[0083] 5)比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，如 圖2所示，以探針的濃度為橫坐標(biāo)，490nm處熒光吸收值為縱坐標(biāo)繪制曲線，由圖1可知，證 明本發(fā)明探針Mito-Superoxide-Tracker在10 μ Μ時(shí)幾乎沒有顯示出細(xì)胞毒性。
[0084] (2)線蟲成像測試
[0085] 1)按標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng)好線蟲待用，待線蟲長到成年且生長狀態(tài)良好，用Μ9溶液洗出 部分線蟲待用。
[0086] 2)取本實(shí)施例制備得到的探針Mito -Superoxide -Tracker溶解在Μ9溶液中，配 置成800nM溶液，加入到線蟲中培養(yǎng)30min。
[0087] 3)線粒體成像探針Mito - SOX配成1 μ Μ培養(yǎng)液，加入到線蟲中培養(yǎng)30min。
[0088] 4)在加有線蟲的同時(shí)進(jìn)行步驟2)和3)的各三個(gè)培養(yǎng)皿中分別加藥，即加入培養(yǎng) 基稀釋好的?ο μ Μ的D0X、10 μ Μ的百草枯和10 μ Μ的S0D處理后的百草枯，孵育30min，移 走藥液，PBS洗滌一遍。
[0089] 5)分別將不加藥和加藥的線蟲在激光共聚焦下用488nm和559nm同時(shí)激發(fā)，如圖 3所示，為本發(fā)明制備的線粒體靶向超氧自由基探針在細(xì)胞內(nèi)檢測D0X刺激產(chǎn)生的超氧成 像試驗(yàn)，證明本發(fā)明制備的線粒體靶向超氧自由基探針具有檢測D0X刺激產(chǎn)生的超氧陰離 子作用；如圖4所示，為本發(fā)明制備的線粒體靶向超氧自由基探針在細(xì)胞內(nèi)百草枯刺激產(chǎn) 生超氧檢測試驗(yàn)，證明本發(fā)明制備的線粒體靶向超氧自由基探針具有檢測百草枯刺激產(chǎn)生 的超氧陰離子作用；如圖5所示，為本發(fā)明制備的線粒體靶向超氧自由基探針在細(xì)胞經(jīng)S0D 處理后，再由百草枯刺激產(chǎn)生超氧檢測試驗(yàn)，證明本發(fā)明制備的線粒體靶向超氧自由基探 針具有選擇性檢測超氧的作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化合物，其結(jié)構(gòu)式為式I或式I'，式I和式I '中；X M+-L-D和X M+均為線粒體祀向分子基團(tuán)； M+為R RsN+，R為碳原子數(shù)為2~6的鏈狀烷基或苯基； X為Cl、化或I ; L為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀烷基、-(OCH2CH2)。-或2~10個(gè)氨基酸基團(tuán)組成的直鏈， 其中n為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合； D為-CONH-、-CHz-NH-或-CO-O-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的任意 一種；-CONH-、-邸2-畑-和-CO-O-。2. 權(quán)利要求1所述化合物式I的制備方法，包括如下步驟： (1) 在有機(jī)溶劑I中，4-硝基英光素與二苯基次磯醜氯進(jìn)行反應(yīng)I，得到中間產(chǎn)物I ;所述有機(jī)溶劑I為DMS0、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； (2) 在有機(jī)溶劑II中，所述中間產(chǎn)物I進(jìn)行反應(yīng)II，還原劑將硝基還原為氨基，得到中 間產(chǎn)物II，所述有機(jī)溶劑II為DMS0、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； (3)在有機(jī)溶劑III中，在縮合劑的作用下所述中間產(chǎn)物II與X M4-D-Y進(jìn)行反應(yīng)III，得 到式I所示化合物； X M4-D-Y中，X為Cl、化或I ;M +為R 3P\ RsN+, R為碳原子數(shù)為2~6的鏈狀 烷基或苯基；L為碳原子數(shù)為2~10的鏈狀烷基、-(OCH2CH2)。-或2~10個(gè)氨基酸基 團(tuán)組成的直鏈，其中n為2~5的整數(shù)，所述氨基酸基團(tuán)為2~10個(gè)氨基酸脫水縮合； D為-CONH-、-CHz-NH-或-CO-O-;或D與L中的端位基團(tuán)共同形成下述基團(tuán)中的任意一 種；-C0NH-、-邸2-畑-和-CO-O- ;Y 為-OH、-C1、-Br 或-I ; 所述有機(jī)溶劑III為DMS0、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：步驟（1)中，所述4-硝基英光素與 所述二苯基次磯醜氯的摩爾比為1 ;1~4 ;所述反應(yīng)I的溫度為40~12(TC，時(shí)間為8~ 40h ; 步驟似中，所述中間產(chǎn)物I與所述還原劑的摩爾比為1 ;1~3 ;所述反應(yīng)II的溫度 為-40~0°C，時(shí)間為8~40h ;所述還原劑為LiAlH*; 步驟（3)中，所述中間產(chǎn)物II、所述X M+A-D-Y與所述縮合劑的摩爾比為1 ; 1~5 ; 1~ 3 ;所述反應(yīng)III的溫度為20~4(TC，時(shí)間為15~40h ;所述縮合劑為二環(huán)己基碳二亞胺、可 溶于水的碳二亞胺、4-二甲氨基化巧或0-苯并H氮哇-N，N，N'，N'-四甲基脈四氣測酸。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于：所述反應(yīng)I和所述反應(yīng)II結(jié)束 后均包括冷卻至0~20°C的步驟； 所述反應(yīng)III結(jié)束后還包括冷卻至0~3(TC的步驟。5. 權(quán)利要求1所述化合物式I '的制備方法，包括如下步驟： (1) 在有機(jī)溶劑I中，4-硝基英光素與二苯基次磯醜氯進(jìn)行反應(yīng)I，得到中間產(chǎn)物I ;所述有機(jī)溶劑I為DMS0、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種； (2) 在有機(jī)溶劑II中，所述中間產(chǎn)物I進(jìn)行反應(yīng)II，還原劑將硝基還原為氨基，得到中 間產(chǎn)物II，所述有機(jī)溶劑II為DMSO、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少I種； (3)在有機(jī)溶劑III中，所述中間產(chǎn)物II與MX進(jìn)行反應(yīng)III，得到式I '所示化合物； MX中，M為RsP、RsN, R為碳原子數(shù)2~6的鏈狀烷基或苯基；X為-Cl、-Br或-I ; 所述有機(jī)溶劑III為DMSO、DMF、THF、己臘、丙麗、二氯甲焼和氯仿中至少1種。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：步驟（1)中，所述4-硝基英光素與 所述二苯基次磯醜氯的摩爾比為1 ;1~4 ;所述反應(yīng)I的溫度為40~12(TC，時(shí)間為8~ 40h ; 步驟似中，所述中間產(chǎn)物I與所述還原劑的摩爾比為1 ;1~3 ;所述反應(yīng)II的溫度 為-40~0°C，時(shí)間為8~40h ;所述還原劑為LiAlH*; 步驟（3)中，所述中間產(chǎn)物II、所述MX與所述縮合劑的摩爾比為1 ; 1~5 ; 1~3 ;所述 反應(yīng)III的溫度為20~4(TC，時(shí)間為15~40h ;所述縮合劑為二環(huán)己基碳二亞胺、可溶于水 的碳二亞胺、4-二甲氨基化巧或O-苯并H氮哇-N，N，N'，N'-四甲基脈四氣測酸。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的制備方法，其特征在于：所述反應(yīng)I和所述反應(yīng)II結(jié)束 后均包括冷卻至0~2(TC的步驟； 所述反應(yīng)III結(jié)束后還包括冷卻至0~3(TC的步驟。8. 權(quán)利要求1所述化合物在制備線粒體祀向超氧自由基探針中的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求1所述化合物在線粒體祀向超氧自由基檢測和線粒體祀向成像中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N21/64GK105985380SQ201510071298
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月11日
【發(fā)明人】黃賽朋, 杜立波, 劉揚(yáng)
【申請人】中國科學(xué)院化學(xué)研究所