一種二價、三價或多價hpv假病毒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明公開一種二價、三價或多價HPV假病毒、含有所述HPV假病毒的兩種、三種或多種型別組合物及利用其檢測HPV中和抗體的方法。
【專利說明】
一種二價、三價或多價HPV假病毒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種二價、三價或多價HPV假病 毒、含有所述HPV假病毒的兩種、三種或多種型別組合物及利用其檢測HPV中和抗體的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭瘤病毒（Human Papillomavirus,簡稱HPV)主要通過人體密切接觸，如性 傳播的病毒，可引起人類多種增殖性上皮病變，包括乳頭狀瘤(疣）和瘤樣病變。具體來講， HPV誘發(fā)的疾病主要包括3大類，第1類：宮頸、陰道、女性外陰、陰莖和肛門的癌癥及某些 類型的頭頸部腫瘤等惡性病變。100%的宮頸癌患者都是HPV感染所導(dǎo)致的，90%的肛門癌， 40%的外陰、陰道及陰莖，12%的口咽及3%的口腔癌癥歸因于HPV感染。第2類：良性病變 如扁平疣、尖銳濕疣等生殖器疣，是一種性傳播疾病，在性行為活躍的人群中很常見。雖然 生殖器疣不會像癌癥一樣造成嚴(yán)重的后果，但是病變通常會引起病人較為痛苦的臨床癥狀 如灼痛、出血和疼痛，同時產(chǎn)生尷尬、焦慮和自卑等負(fù)面的心理反應(yīng)，而且反復(fù)治療的過程 浪費(fèi)了大量的醫(yī)療資源。在世界范圍內(nèi)估計由非致癌性HPV(主要是6和11型）引起的生 殖器疣有3000萬，其中20~50%的病變中還包含有高危型HPV的混合感染。第3類：HPV 感染還能引起復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭瘤（RRP)，這是一種罕見的、具有潛在致命性的疾病，主要 發(fā)生在青少年時期，有時，大量的乳頭瘤可以引起呼吸困難并導(dǎo)致較小年齡兒童死亡。
[0003] 人乳頭瘤病毒（HPV)感染的流行范圍廣，所引發(fā)的相關(guān)致死性的惡性腫瘤和多種 性傳播疾病對人類健康具有嚴(yán)重的危害性，開發(fā)安全有效的預(yù)防或治療性疫苗具有重大意 義。針對HPV的中和抗體水平是HPV疫苗研究開發(fā)的關(guān)鍵性指標(biāo)，因此建立高效、準(zhǔn)確和便 捷的中和抗體檢測方法十分重要。然而，由于HPV具有嚴(yán)格的宿主特異性，同時其病毒復(fù)制 與宿主細(xì)胞的分化狀態(tài)密切相關(guān)，目前難于在體外對HPV進(jìn)行快速高效的組織培養(yǎng)，也缺 乏適宜的動物模型。因此探索建立可及時快速鑒定或篩選中和抗體和評估待選疫苗保護(hù)性 的方法十分必要。
[0004] 目前，已發(fā)展出多種不同類型的HPV中和抗體評估方法，如基于免疫缺陷小鼠組 織移植模型的評估方法（White WI等，病毒學(xué)雜志，1998年，72卷：959-964頁)、基于體外 感染原代上皮組織的評估方法(Meyers C等，科學(xué)，1 9 92年，2 5 7卷：971-973頁)、基于 HPV類病毒顆粒（VLP)的ELISA方法（1 9 9 9年，Semin Cancer Biol)以及血凝抑制實驗 (Roden RB等，病毒學(xué)雜志，1 99 6年，7 0卷：3298-3301頁)等，但這些方法存在操作復(fù)雜、 效率低、實驗周期長或不能準(zhǔn)確反映抗體的中和保護(hù)作用等問題。因此，迫切需要發(fā)展能夠 便捷、有效地檢測HPV中和抗體的方法，同時希望新方法能夠適合于進(jìn)行高通量的檢測。
[0005] 近來，研究顯示HPV VLP具有可非特異性包裹質(zhì)粒核酸的特點，因此可構(gòu)建攜帶報 告質(zhì)粒的HPV假病毒（HPV pseudovirus)用于體外有效模擬HPV感染過程，并可用于對 HPV中和抗體進(jìn)行快速檢測（Buck CB等，病毒學(xué)雜志，2004年，7 8卷：751-757頁）?；?HPV假病毒的中和抗體檢測方法相比其它傳統(tǒng)方法具有較為明顯的簡便、效率高的優(yōu)點，實 驗周期縮短，對于不同的HPV亞型具有較好的通用性。目前，基于HPV假病毒的中和抗體檢 測方法已得到日益廣泛的應(yīng)用。
[0006] 然而隨著研究的深入，對HPV中和抗體檢測提出了更高的要求，除了靈敏度和準(zhǔn) 確度好外，同時要求能夠更為快速、簡便，能夠更準(zhǔn)確地進(jìn)行客觀的量化檢測以提高重復(fù) 性。當(dāng)前基于HPV假病毒的中和抗體檢測方法：（1)以綠色熒光蛋白（GFP)為報告基因，構(gòu) 建帶有GFP報告基因表達(dá)元件的HPV假病毒，在感染293TT細(xì)胞后用熒光顯微鏡目測或流 式細(xì)胞儀（FACS)檢測發(fā)綠色熒光的細(xì)胞(被感染細(xì)胞)，通過檢測HPV中和抗體對假病毒 感染的阻斷能力評估其效價；（2)以分泌型堿性磷酸酶（SEAP)為報告基因，構(gòu)建帶有SEAP 報告基因表達(dá)元件的HPV假病毒，感染293TT細(xì)胞后通過離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，之后通過 SEAP化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行顯色，再用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀獲得結(jié)果，通過檢測HPV中和抗 體對假病毒感染的阻斷能力評估其效價。（3)以構(gòu)建有β-半乳糖苷酶報告質(zhì)粒的HPV假 病毒，感染293FT細(xì)胞，使用斑點檢測儀器Elispot檢測，每個孔中被Elispot所識別的藍(lán) 色細(xì)胞數(shù)即被感染細(xì)胞數(shù)量。
[0007] 在應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，上述第一種方法的操作較為復(fù)雜耗時，需要進(jìn)行細(xì)胞消化操作，然 后逐孔用FACS進(jìn)行檢測，1個96孔板的檢測過程通常需要2至3個小時，耗時費(fèi)力；第二 種方法的操作可使用類似酶標(biāo)儀的儀器進(jìn)行快速掃描判定，有利于批量檢測，但其試劑盒 成本較高，其主要檢測酶促顯色反應(yīng)程度，同時這種方法存在靈敏度的問題，細(xì)胞在被少量 感染時SEAP分泌量低就會存在讀值的陽性/陰性值比（P/N比)低的問題，會影響結(jié)果判定 因此為了提高P/N比，就需要使用更大量的假病毒，不利于提高實驗效率。
[0008] 本發(fā)明建立了一種簡單、準(zhǔn)確而靈敏的HPV中和抗體檢測方法，是一種高通量檢 測二價、三價或多價HPV病毒中和抗體的方法，可更好地滿足對二種、三種或更多不同型別 HPV中和抗體同時檢測實驗的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明目的是公開一種檢測人乳頭瘤病毒中和抗體的二價、三價或多價假病毒。
[0010] 本發(fā)明公開的二價、三價或多價假病毒包含HPV衣殼蛋白和編碼熒光蛋白的報告 質(zhì)粒。
[0011] 本發(fā)明公開的二價、三價或多價假病毒，其中所述HPV衣殼蛋白為結(jié)構(gòu)蛋白L1、L2 或L1+L2為野生型全長、或突變體或截短的蛋白。
[0012] 本發(fā)明公開的二價、三價或多價假病毒，HPV型別為6、11、16、18、26、30、31、33、 34、35、39、45,51、52、53、56、58、59、66、67、68、69、70、72、73、82、85、或 97 型，優(yōu)選 6、11、 16、18、31、33、45、52、58 型。
[0013] 本發(fā)明公開的二價、三價或多價假病毒，HPV結(jié)構(gòu)蛋白L1和L2為構(gòu)建于同一表達(dá) 質(zhì)?；蛘叻謩e構(gòu)建于不同質(zhì)粒。
[0014] 本發(fā)明公開的二價、三價或多價假病毒，該假病毒包含的報告質(zhì)粒的報告基因為 綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白或藍(lán)色熒光蛋白等不同顏色中任二種、三種或 多種。
[0015] 本發(fā)明公開的二價、三價或多價假病毒，感染靶細(xì)胞后介導(dǎo)的報告質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物 產(chǎn)生的信號必須能夠被流式細(xì)胞儀或細(xì)胞成像型讀板儀所識別和檢測，即需要選擇其表達(dá) 產(chǎn)物能夠?qū)е庐a(chǎn)生合適信號的報告基因。本實施例中，選擇不同顏色的熒光報告基因包括 但不限于如下熒光蛋白報導(dǎo)基因。
[0016] 紅色焚光蛋白報告質(zhì)粒(報告載體）包括但不限于：pEFla-E2_Crimson、 pDsRedl-Cl、pDsRedl-Nl、pDsRED-Monomer-Nl、pDsRED2_ER、pDsRED2_Mito、pDsRED2_Nuc、 pDsRED2-Peroxi、pDsRED-Express-Nl、pLVX-DsRed-Monomer-Nl、p8RwB、pRwB、ptwB、pCIR〇
[0017] 黃色熒光蛋白報告載體包括但不限于：pEYFP-Cl、pEYFP-Nl、pEYFP-Golgi、 pEYFP-Mem、pEYFP-ER。
[0018] 綠色熒光蛋白報告載體包括但不限于：pEGFP-1、pEGFP-Cl、pEFFP-C2、 pEGFP-Nl、 pEGFP-N3、 pAcGF卟1、 pEGFP-Actin 、 pIRES2_EGFP 、 pLEGFP-Cl、 pLVX-IRES-ZsGreenl、 pLVX-AcGFPl-Nl、 pLEGFP-Nl、 pUB-GFP、 pEF-GFP、 pCAG-GFP、 pCMV-GFP、pCIneo-GFP、pCDNA3-GFP。
[0019] 本發(fā)明公開的二價、三價或多價假病毒，每型別假病毒分別含有唯一顏色熒光蛋 白的表達(dá)質(zhì)粒，各型別假病毒用量為根據(jù)測定假病毒的滴度調(diào)整至相同的細(xì)胞感染陽性 比。二價假病毒的簡單示意圖見附圖1，三價假病毒的簡單示意圖見附圖2。
[0020] 本發(fā)明另一個目的是公開一種檢測人乳頭瘤病毒中和抗體的多價假病毒的制備 方法。本發(fā)明公開的二價、三價或多價假病毒的制備方法如下： A.將含有HPV衣殼蛋白Ll、L2的基因表達(dá)質(zhì)粒和編碼熒光蛋白的基因的報告質(zhì)粒共 轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，分別表達(dá)三種不同型別假病毒，收獲假病毒；B.假病毒滴度用每毫升假病 毒液能感染的細(xì)胞數(shù)表示，取每種假病毒的用量為使各型假病毒滴度保持在同一水平，混 合制得二價、三價或多價HPV假病毒。
[0021] 上述方法中A步驟為將1)分別表達(dá)L1、L2的兩種基因表達(dá)質(zhì)粒，或L1+L2基因表 達(dá)質(zhì)粒，和2)含有編碼熒光蛋白的基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明公開的二價、三價或多價假病毒的優(yōu)選制備方法如下： 取編碼熒光蛋白的基因報告質(zhì)粒，與HPVL1L2質(zhì)粒按1-5 :1-5質(zhì)量比例溶解于培養(yǎng)基 中，轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染后48到72小時后收集細(xì)胞，加入裂解液裂解細(xì)胞，將裂解 液離心上清純化得HPV假病毒原液；分別測定各單價假病毒滴度，即每毫升假病毒液能感 染的細(xì)胞數(shù)，取每種假病毒的用量為使各型假病毒感染細(xì)胞數(shù)保持在同一水平，混合制得 二價、三價或多價HPV假病毒。
[0023] 本發(fā)明第三個目的是公開一種檢測被HPV病毒感染的細(xì)胞的方法，具體方法如 下： (1) 使被二價、三價或多價HPV假病毒感染的細(xì)胞帶有適于熒光檢測儀器，例如流式 細(xì)胞儀、細(xì)胞成像型讀板儀檢測的信號，但未被感染的細(xì)胞不帶有信號；和 (2) 通過熒光檢測儀器檢測該信號來檢測被不同型別HPV假病毒感染的細(xì)胞。
[0024] 上述方法中，用于被不同型別的HPV假病毒感染的細(xì)胞分別計數(shù)。
[0025] 本發(fā)明最后一個目的是公開一種檢測人乳頭瘤病毒中和抗體的方法，具體方法如 下： 將待檢測樣品與人乳頭瘤病毒假病毒共同培養(yǎng)于培養(yǎng)液293FT細(xì)胞中接觸，應(yīng)用熒光 檢測儀器檢測儀器(例如流式細(xì)胞儀、細(xì)胞成像型讀板儀)，通過檢測帶有由報告蛋白直接 或間接產(chǎn)生的信號的細(xì)胞，檢測被感染細(xì)胞的數(shù)量；測算樣品中是否有人乳頭瘤病毒中和 抗體和/或其滴度(效價)。
[0026] 所述待檢測樣品為來自待檢個體的分離的生物學(xué)樣品，優(yōu)選為血清；或來自組織 培養(yǎng)的生物學(xué)樣品、制備的單克隆抗體等。
【附圖說明】
[0027] 圖1二價假病毒的簡單示意圖，包括A顏色熒光的X型別假病毒與B顏色熒光的 Y型別假病毒。
[0028] 圖2用二價假病毒HPV16E2-HPV18GFP對陽性血清進(jìn)行中和抗體檢測其中包括細(xì) 胞對照 293FT control. 001 和假病毒對照 293FT HPV16E2-HPV18GFP. 001。
[0029] 圖3用二價假病毒HPV16E2-HPV18GFP對陽性血清進(jìn)行中和抗體檢測，血清樣品濃 度40倍開始4倍逐級稀釋共4個梯度（40、160、640、2560倍）的流式檢測圖。
[0030] 圖4用二價假病毒HPV16E2-HPV18GFP對陽性血清進(jìn)行中和抗體檢測，血清樣品濃 度10240倍開始4倍逐級稀釋共4個梯度（10240、40960、163840、655360倍)的流式檢測圖。
[0031] 圖5用單價假病毒HPV16E2對陽性血清進(jìn)行中和抗體檢測，細(xì)胞對照和假病毒 對照的流式檢測圖。
[0032] 圖6用單價假病毒HPV16E2對陽性血清進(jìn)行中和抗體檢測，血清樣品濃度40倍開 始4倍逐級稀釋共4個梯度（40、160、640、2560倍）的流式檢測圖。
[0033] 圖7用單價假病毒HPV16E2對陽性血清進(jìn)行中和抗體檢測，血清樣品濃度10240 倍開始4倍逐級稀釋共4個梯度（10240、40960、163840、655360倍）的流式檢測圖。
[0034] 圖8用單價假病毒HPV18GFP對陽性血清進(jìn)行中和抗體檢測，細(xì)胞對照和假病毒 對照的流式檢測圖。
[0035] 圖9用單價假病毒HPV18GFP對陽性血清進(jìn)行中和抗體檢測，血清樣品濃度40倍 開始4倍逐級稀釋共4個梯度（40、160、640、2560倍）的流式檢測圖。
[0036] 圖10用單價假病毒HPV18GFP對陽性血清進(jìn)行中和抗體檢測，血清樣品濃度10240 倍開始4倍逐級稀釋共4個梯度（10240、40960、163840、655360倍）的流式檢測圖。
[0037] 本發(fā)明【具體實施方式】如下 實施例1. HPV結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 從Genbank公開的HPV L1和L2基因序列中選取如下序列號的基因：HPV6 Ll、L2的 基因序列（GenbankAF092932. 1 號）、HPV11 LI、L2 的基因序列（Genbank 號 HE574705. 1)、 HPV16 L1、L2 的基因序列（Genbank 號 NC_001526. 2)、HPV18 L1、L2 的基因序列（Genbank 號 GQ180792. 1)、HPV33 LI、L2 的基因序列（Genbank 號 M12732. 1)、HPV58 LI、L2 的基因序列 (Genbank 號 KC86〇27l. 1)〇
[0038] 采用基因合成的方法分別合成上述基因片段，選擇如下哺乳動物表達(dá)系 統(tǒng)的表達(dá)載體構(gòu)建質(zhì)粒：pCMVp-NEO-BAN、pSSB-H2、pBI CMV1 Clontech、pBK-CMV、 pBudCE4. 1、pCAGGS、pCEP4、pCI、pCI-neo、pcDNA3. l/Hygro (+/-)，本發(fā)明具體實施例選 取pCMVp-NE〇-BAN，與HPV16、HPV18和HPV58型別的LI、L2基因片段連接，構(gòu)建如下表 達(dá)載體：pCMVp-NE0-BAN-16LlL2, pCMVp-NE0-BAN-18LlL2, pCMVp-NE0-BAN-58LlL2 ;選取 Invitrogen的哺乳動物表達(dá)載體pCEP4,與HPV6、HPV11、HPV33型別的Ll、L2基因片段連 接，構(gòu)建如下表達(dá)載體：pCEP4-6LlL2, pCEP4-llLlL2, pCEP4-33LlL2。
[0039] 實施例2. HPV16L1L2假病毒的制備 1. 取編碼熒光蛋白的基因報告質(zhì)粒pEFla-E2-Crimson，HPV質(zhì)粒 pCMVp-NE0-BAN-16LlL2按1 :1質(zhì)量比例溶解于培養(yǎng)基中，加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine2000 (或其它）溶解于培養(yǎng)基中，混勻，室溫靜置得混合液；將混合液加入到 預(yù)先接種好的匯合度達(dá)50-70%的293FT細(xì)胞中，搖勻，放C02培養(yǎng)箱，37 °C，5%C02濃度培 養(yǎng)。
[0040] 2.培養(yǎng)6-24小時后，吸去培養(yǎng)液，緩慢加入37°C預(yù)熱好的DMEM完全培養(yǎng)基，放回 C02培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時。
[0041] 3.棄去培養(yǎng)上清，用37°C預(yù)熱的PBS洗滌細(xì)胞一次，加入0. 05%的胰酶消解5 分鐘，加入37°C預(yù)熱的完全培養(yǎng)基終止，用移液管吹打使細(xì)胞懸浮后，轉(zhuǎn)入15ml離心管， lOOOrpm (201xg)離心，棄去上清，加入DPBS-Mg洗滌細(xì)胞一次，離心去上清，加入DPBS-Mg 重懸后離心再次去上清。
[0042] 4.加入與細(xì)胞沉淀等體積的細(xì)胞裂解液(含有0. 5%Brij58,0. 2%Benzonase， 0.2%Plasmid Safe，lxAntibiotic-antimycotic 的 DPBS-Mg)，混懸細(xì)胞，放 37°C培養(yǎng)箱， 孵育24小時。
[0043] 5.取出裂解后細(xì)胞管至冰浴放置5分鐘，加入0. 17倍體積的5M氯化鈉溶液(使終 濃度至850mM)，混勻后冰浴10-20分鐘，5000xg離心10分鐘。
[0044] 6.小心吸取上清，分裝至1.5ml硅化處理過的離心管，標(biāo)記好名稱、批次等， 置-80 °C凍存。
[0045] 實施例3. HPV其它型別L1L2假病毒的制備 取編碼熒光蛋白的基因報告質(zhì)粒pEF-GFP，HPV質(zhì)粒pCMVp-NE0-BAN-18LlL2,按照實施 例2的方法制備綠色熒光蛋白HPV18型假病毒。
[0046] 取編碼熒光蛋白的基因報告質(zhì)粒pEYFP-Mem，HPV質(zhì)粒pCMVp-NE0-BAN-58LlL2,按 照實施例2的方法制備黃色熒光蛋白HPV58型假病毒。
[0047] 取編碼熒光蛋白的基因報告質(zhì)粒pEFla-E2-Crimson，HPV質(zhì)粒PCEP4-6L1L2,按照 實施例2的方法制備紅色熒光蛋白HPV6型假病毒。
[0048] 取編碼熒光蛋白的基因報告質(zhì)粒pEF-GFP，HPV質(zhì)粒PCEP4-11L1L2,按照實施例2 的方法制備綠色熒光蛋白HPV11型假病毒。
[0049] 取編碼熒光蛋白的基因報告質(zhì)粒pEYFP-Mem，HPV質(zhì)粒PCEP4-33L1L2,按照實施例 2的方法制備黃色熒光蛋白HPV33型假病毒。
[0050] 實施例4.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各型別HPV假病毒滴度 1.收集對數(shù)生長期的293FT細(xì)胞，用血球計數(shù)器計數(shù)并用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞濃 度至 1. 5X105個/ml。
[0051] 2.在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μ 1 293FT細(xì)胞，在37°C 5% C02培養(yǎng)箱中 孵育6小時。
[0052] 3.稀釋HPV假病毒從1000倍開始稀釋，對倍稀釋8個梯度，按照每孔100微升加 入假病毒稀釋液，培養(yǎng)72小時后，用流式細(xì)胞儀檢測每孔的細(xì)胞感染率，做線性回歸，計算 出感染率達(dá)到10-20%的假病毒稀釋倍數(shù)。計算1 _升假病毒感染的細(xì)胞數(shù)作為假病毒滴 度。
[0053] 實施例5. HPV三價假病毒的制備及檢測中和抗體滴度 1.配制三價假病毒：按照假病毒滴度，取一定體積的各型別假病毒，使得混合后感染 細(xì)胞的數(shù)量或比例相同，稀釋，混合配制得三價假病毒。
[0054] 2.稀釋待測血清：將待測血清用完全培養(yǎng)基按40倍開始4倍逐級稀釋8個梯度， 按照每梯度60微升血清，做兩個平行。
[0055] 3.待測血清和病毒的預(yù)混：取新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入60 μ 1血清稀釋液 和60 μ 1假病毒稀釋液，輕拍四周混勻，同時設(shè)完全培養(yǎng)液替代血清稀釋液的假病毒對照 孔和無血清無假病毒的細(xì)胞對照孔。
[0056] 4.待測血清和假病毒混合液的預(yù)孵育：將96孔培養(yǎng)板4°C冰箱放置1小時。
[0057] 5.從96孔培養(yǎng)板各孔中吸取100 μ L的假病毒和待測血清組合物加入提前6小時 已鋪好細(xì)胞的培養(yǎng)板對應(yīng)孔中，輕拍培養(yǎng)板四周混勻。
[0058] 6.將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C/5%0)2培養(yǎng)箱中孵育。72小時后，從培養(yǎng)箱中取出細(xì) 胞培養(yǎng)板。
[0059] 7.放入能檢測細(xì)胞成像型多色讀板儀中，讀取每孔表達(dá)不同熒光細(xì)胞的數(shù)量。
[0060] 或用胰酶消化每孔內(nèi)細(xì)胞，重懸于PBS溶液中，用流式細(xì)胞儀檢測每孔細(xì)胞不同 熒光通道下細(xì)胞感染率。
[0061] 8.計算待測血清中和抗體滴度。中和滴度計算方式：求取樣品及對照各復(fù)孔均值，與 假病毒對照孔對比，樣品孔熒光抑制達(dá)到50%所對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即為該支血清的中和滴 度值。若待測樣品為單克隆抗體，則以熒光抑制率達(dá)到50%的對應(yīng)單克隆抗體含量(微克） 作為該抗體中和滴度。
[0062] 實施例6 .應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測二價假病毒感染血清的中和抗體滴度 取編碼焚光蛋白的基因報告質(zhì)粒pEFla-E2_Crimson，HPV質(zhì)粒pCI-neo promega -16L1L2,按照實施例2的方法制備紅色熒光蛋白HPV16E2型假病毒。
[0063] 取編碼熒光蛋白的基因報告質(zhì)粒pEF-GFP，HPV質(zhì)粒pCI-neo promega -16L1L2， 按照實施例2的方法制備綠色熒光蛋白HPV18GFP型假病毒。
[0064] 收集對數(shù)生長期的293FT細(xì)胞，用血球計數(shù)器計數(shù)并用DMEM完全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞 濃度至1.5X10 5個/ml。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μΙ 293FT細(xì)胞，在37°C 5% C02培養(yǎng)箱中孵育6小時。
[0065] 稀釋HPV16E2型和HPV18GFP假病毒從1000倍開始稀釋，對倍稀釋8個梯度，按照 每孔100微升假病毒，培養(yǎng)72小時后，用流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter EPICS XL)檢測孔 中表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞比率，計算1毫升假病毒感染的細(xì)胞數(shù)作為假病毒滴度。
[0066] 按照假病毒滴度，取16和18型別假病毒，使得感染的細(xì)胞數(shù)相同；稀釋，混合配 制得二價假病毒 293FT HPV16E2-HPV18GFP。
[0067] 稀釋待測血清：將陽性血清用完全培養(yǎng)基按40倍開始4倍逐級稀釋8個梯度，按 照每梯度60微升血清，做兩個平行孔。
[0068] 待測血清和病毒的預(yù)混：取新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入60 μ 1血清稀釋液和 60 μ 1假病毒稀釋液，輕拍四周混勻，同時設(shè)完全培養(yǎng)液替代血清稀釋液的假病毒對照孔和 無血清無假病毒的細(xì)胞對照孔。
[0069] 待測血清和假病毒混合液的預(yù)孵育：將96孔培養(yǎng)板4°C冰箱放置1小時。
[0070] 從96孔培養(yǎng)板各孔中吸取100 μ L的假病毒和待測血清組合物及對照，貼壁緩緩 加入提前6小時已鋪好細(xì)胞的培養(yǎng)板對應(yīng)孔中，輕拍培養(yǎng)板四周混勻。
[0071] 將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C /5%C02培養(yǎng)箱中孵育。72小時后，從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞 培養(yǎng)板。
[0072] 用流式細(xì)胞儀（BD FACSCalibur)檢測孔中不同型別假病毒的細(xì)胞感染率，具體見 附圖。（用細(xì)胞成像型讀板儀檢測時為讀取每孔表達(dá)不同熒光的細(xì)胞數(shù))。
[0073] 計算待測血清中和抗體滴度。中和滴度計算方式：求取樣品及對照各復(fù)孔感染率 或感染細(xì)胞數(shù)均值，對比假病毒對照孔計算各稀釋度下樣品孔熒光抑制率，計算達(dá)到50% 抑制所對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即為該支血清的中和滴度值。待測陽性血清兩個型別HPV中和抗 體滴度檢測結(jié)果如下表。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測人乳頭瘤病毒中和抗體的二價、三價或多價HPV假病毒，其特征在于該假 病毒包含HPV衣殼蛋白和編碼熒光蛋白的報告質(zhì)粒。2. 如權(quán)利要求1所述的二價、三價或多價HPV假病毒，其特征在于其中所述HPV衣殼蛋 白為結(jié)構(gòu)蛋白L1+L2的野生型全長、或突變體或截短的蛋白。3. 如權(quán)利要求1所述的二價、三價或多價假病毒，其特征在于HPV型別為6、11、16、 18、26、30、31、33、34、35、39、45,51、52、53、56、58、59、66、67、68、69、70、72、73 、82、85、或 97 型，優(yōu)選 6、11、16、18、31、33、45、52、58 型。4. 如權(quán)利要求1、2或3所述的二價、三價或多價假病毒，其特征在于所述報告質(zhì)粒的表 達(dá)產(chǎn)物為綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白中任二種、三種或多 種。5. 如權(quán)利要求4所述的二價、三價或多價假病毒，其特征在于優(yōu)選綠色熒光蛋白，紅色 熒光蛋白或黃色熒光蛋白。6. 如權(quán)利要求5所述的二價、三價或多價假病毒，其特征在于每型別假病毒分別含有 唯一顏色熒光蛋白的報告質(zhì)粒，各型別假病毒用量為根據(jù)測定假病毒的滴度調(diào)整至達(dá)到相 同的細(xì)胞感染陽性比。7. 如權(quán)利要求5或6所述的二價、三價或多價假病毒的制備方法，其特征在于該方 法為：A.將含有HPV衣殼蛋白的基因表達(dá)質(zhì)粒和編碼熒光蛋白的基因的報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293FT細(xì)胞，分別表達(dá)不同型別假病毒衣殼蛋白，其自發(fā)地包裹含報道基因的質(zhì)粒并組裝成 病毒顆粒，制得假病毒；B.假病毒滴度用每毫升假病毒液能感染的細(xì)胞數(shù)表示，取每種假 病毒的用量為使各型假病毒感染細(xì)胞比例達(dá)到同一水平，約10-25%，優(yōu)選15-20%的感染比 例，混合制得二價、三價或多價HPV假病毒。8. 如權(quán)利要求7所述的的制備方法，其特征在于該方法中A步驟為將1)L1、L2兩種基 因表達(dá)質(zhì)粒，或L1+L2基因表達(dá)質(zhì)粒，和2)含有編碼熒光蛋白的基因共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。9. 一種檢測被HPV假病毒或病毒感染細(xì)胞的方法，包括： 使被二價、三價或多價HPV假病毒感染的細(xì)胞帶有適于熒光檢測儀器，例如流式細(xì)胞 儀、細(xì)胞成像型讀板儀檢測的信號，但未被感染的細(xì)胞不帶有信號；和 通過熒光檢測儀器檢測該信號來檢測被不同型別HPV假病毒感染的細(xì)胞。10. 如權(quán)利要求9所述的方法，用于被不同型別的HPV假病毒感染的細(xì)胞分別計數(shù)。11. 一種檢測人乳頭瘤病毒中和抗體的方法，其特征在于該方法包括如下步驟： 將待檢測樣品梯度稀釋液與人乳頭瘤病毒假病毒共同培養(yǎng)于培養(yǎng)液293FT細(xì)胞中接 觸，應(yīng)用熒光檢測儀器(例如流式細(xì)胞儀、細(xì)胞成像型讀板儀)，通過檢測帶有由報告蛋白直 接或間接產(chǎn)生的信號的細(xì)胞，檢測被感染細(xì)胞的比例或數(shù)量；測算樣品中是否有人乳頭瘤 病毒中和抗體和/或其滴度(效價)。12. 如權(quán)利要求11所述方法，其中所述待檢測樣品為來自待檢個體的分離的生物學(xué)樣 品為：血清，單克隆抗體，或來自組織培養(yǎng)的生物學(xué)樣品。
【文檔編號】C12N15/85GK105985934SQ201510506938
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年8月18日
【發(fā)明人】銀飛, 陳健平, 張海江, 王艷, 劉永江
【申請人】北京康樂衛(wèi)士生物技術(shù)股份有限公司