一種黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w及其應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)蛋白，包括黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w小亞基、黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w中亞基和黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w大亞基。本發(fā)明提供黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w，其比野生型對(duì)底物(黃嘌呤)的親和力提高19％，轉(zhuǎn)化數(shù)提高115％，催化效率提高166％，耐溫性提高11℃，有利于與其他酶類聯(lián)用進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的應(yīng)用領(lǐng)域，尤其適合于樣品檢測(cè)，包括黃嘌呤和次黃嘌呤的檢測(cè)，與PNP酶聯(lián)用檢測(cè)無(wú)機(jī)磷酸，與PNP、XOD和POD酶聯(lián)用檢測(cè)腺苷脫氨酶，和5`-核苷酸酶的檢測(cè)，同時(shí)適合于工業(yè)化應(yīng)用，有利于提高酶催化效率、降低成本，更加有利于工業(yè)應(yīng)用過(guò)程。
【專利說(shuō)明】
一種黃嘌昤脫氫酶截?cái)囿w及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃噪呤氧化還原酶（Xanthine oxidoreductase，簡(jiǎn)稱X0R)是一種包含鐵硫簇、 鉬蝶呤輔基的黃素蛋白類氧化還原酶，它具有黃噪呤氧化酶（Xanthine oxidase,簡(jiǎn)稱 XOD，EC 1. 17. 3. 2)和黃嘌呤脫氫酶（Xanthine dehydrogenase，簡(jiǎn)稱 XDH，EC1. 17. 1. 4) 兩種不同的存在形式。X0R不僅能夠利用天然存在的諸如氧氣、NAD、硝酸鹽等物質(zhì)作為 電子受體，同時(shí)也可以利用諸如PMS和亞甲基藍(lán)等人工合成染料作為電子受體，催化氧 化包括嘌呤、蝶啶和醛類等多種雜環(huán)分子的sp2雜化的碳原子（李麗書，陳獻(xiàn)華，邵葉 波，劉璇，徐平，《黃嘌呤氧化還原酶的結(jié)構(gòu)、功能和作用》。因此，X0R具有重要的商業(yè) 應(yīng)用價(jià)值，被用于生產(chǎn)黃嘌呤氧化酶抗體和檢測(cè)黃嘌呤/次黃嘌呤和酶聯(lián)法檢測(cè)無(wú)機(jī) 磷等的臨床診斷試劑盒，以及酶法生物合成病毒唑等核苷類藥物和降解有機(jī)污染物等 (Agarwal, A. , A. Banerjee, and U. C. Banerjee, Xanthine oxidoreductase: a journey from purine metabolism to cardiovascular excitation-contraction coupling. Crit Rev Biotechnol，2011. 31 (3) : 264-80。孟疆輝，陳蔚梅，利用黃嘌呤氧化酶提高病毒唑轉(zhuǎn)化 率.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）.1999. 45 (6) : 838-840)。
[0003] XDH是生物體內(nèi)X0R基因轉(zhuǎn)錄翻譯的直接產(chǎn)物，是X0R在體內(nèi)的主要存在狀 態(tài)。X0D是由前體蛋白XDH經(jīng)過(guò)巰基氧化可逆轉(zhuǎn)變或者通過(guò)部分酶解斷裂不可逆轉(zhuǎn)變 而來(lái)，X0D可以利用分子0 2作為電子受體，但失去了 XDH所具有的利用NAD作為電子 受體的會(huì)泛力(NishinoTomoko, OkamotoKen, Kawaguchi Yuko, HoriHiroyuki, Matsumura Tomohiro, Eger Bryan T.,Pai,Emi1 F. , Nishino,Takeshi. Mechanism of the conversion of xanthine dehydrogenase to xanthine oxidase:identification of the two cysteine disulfide bonds and crystal structure of a non-convertible rat liver xanthine dehydrogenase mutant.The Journal of biological chemist ry，2005, 280(26) :24888-94)。在臨床診斷中，由于溶液中溶解氧含量受到溫度、壓力、鹽分 和有機(jī)物含量等因素影響，X0D在運(yùn)用于樣品檢測(cè)時(shí)，樣品中溶解氧量會(huì)對(duì)樣品測(cè)定結(jié)果造 成影響。同樣地，在規(guī)模化應(yīng)用X0D酶法催化或含X0D酶全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化生成核苷類藥物 以及降解雜化類有機(jī)污染物質(zhì)過(guò)程中，溶解氧的含量也會(huì)對(duì)催化轉(zhuǎn)化過(guò)程造成影響。XDH不 受溶解氧氣的影響，可以更好地滿足這些特定應(yīng)用需求。然而，目前市場(chǎng)上廣泛提供的X0R 是X0D，主要提取自牛奶奶油等動(dòng)物源材料和野生藤黃節(jié)桿菌等野生微生物，如Sigma公司 提供的牛奶X0D，日本Τ0Υ0Β0公司提供的細(xì)菌X0D。
[0004] 研究表明，XDH主要有兩種：一種是以牛奶XDH為代表的真核XDH，由單一多肽鏈構(gòu) 成（α )2同源二聚體；另一種為莢膜紅細(xì)菌XDH為代表的細(xì)菌XDH，由（α β ) 2形態(tài)存在的異 源四聚體。作為轉(zhuǎn)錄翻譯的直接產(chǎn)物，牛奶XDH可以在體內(nèi)或者體外，經(jīng)過(guò)胰蛋白酶和糜蛋 白酶等蛋白酶的部分酶解或者氧化形成二硫鍵而轉(zhuǎn)化成為X0D。牛奶X0D利用分子氧作為 電子受體，其催化氧化黃嘌呤等底物的活性是牛奶XDH利用NAD作為電子受體催化氧化反 應(yīng)活性的10倍。而莢膜紅細(xì)菌XDH是一種純粹的XDH，經(jīng)過(guò)胰蛋白酶的部分酶解并不能轉(zhuǎn)變 形成XOD，同時(shí)這種經(jīng)過(guò)酶解斷裂形成的截?cái)囿wXDH的酶學(xué)性質(zhì)沒(méi)有得到改善。而莢膜紅細(xì) 菌XDH催化活性比牛奶XOD催化氧化黃嘌呤等底物能力至少高5倍（LeimkilhlerSilke，Ho dsonRachael, George Graham N, Rajagopalan K. V. Recombinant Rhodobacter capsulatus xanthine dehydrogenase,a useful model system for the characterization of protein variants leading to xanthinuria I in humans. Journal of Biological Chem istry，2003, 278(23) :20802-20811)。除高的催化活性外，已有的研究還比表明微生物來(lái)源 的XDH具有比真核XDH更高的溫度耐受性，更加適合于商業(yè)化應(yīng)用。然而，迄今為止除了牛 和雞來(lái)源XDH可以商業(yè)途徑獲取，比如美國(guó)MyBioSource公司提供的牛XDH，但是價(jià)格昂貴 且產(chǎn)量非常有限，尚未見(jiàn)到商品化微生物來(lái)源XDH。開(kāi)發(fā)高催化活性和高穩(wěn)定性的微生物 XDH是一項(xiàng)具有重要應(yīng)用前景的工作。
[0005] 前期研究獲取了 一種新的莢膜紅細(xì)菌XDH及其編碼基因，公開(kāi)在申請(qǐng)?zhí)枮?201410764840. 5的專利申請(qǐng)中，該莢膜紅細(xì)菌XDH是迄今為止報(bào)道的催化活性最高的XDH 之一，具有寬泛的溫度和pH作用范圍，展示了優(yōu)良的潛在應(yīng)用價(jià)值，是進(jìn)一步開(kāi)發(fā)催化效 率和溫度耐受性提高的新型酶的良好出發(fā)材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w。
[0007] 本發(fā)明提供的一種蛋白，為黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿wSplitl78,其由亞基甲、亞基乙和 亞基丙3個(gè)亞基組成：
[0008] 所述亞基甲的氨基酸序列為序列表中序列4或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序 列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的序列；
[0009] 所述亞基乙的氨基酸序列為序列表中序列5或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序 列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的序列；
[0010] 所述亞基丙的氨基酸序列為序列表中序列6或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序 列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的序列。
[0011] 上述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸 殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0012] 編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0013] 上述DNA分子包括所述亞基甲的編碼DNA分子、所述亞基乙的編碼DNA分子和所 述亞基丙的編碼DNA分子。
[0014] 所述亞基甲的編碼DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列3第22位至第558位；
[0015] 所述亞基乙的編碼DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列3第573位至第1430 位；
[0016] 所述亞基丙的編碼DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列3第1427位至第3760 位。
[0017] 上述DNA分子為如下中1)-4)中至少一種：
[0018] 1)編碼區(qū)為序列表中序列3第22位至第3760位核苷酸所示的DNA分子；
[0019] 2)編碼區(qū)為序列表中序列3的核苷酸所示的DNA分子；
[0020] 3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1或2所述蛋白 的DNA分子；
[0021] 4)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1或2所 述蛋白的DNA分子。
[0022] 上述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0· 1 % SDS 和 1 X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0023] 含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù) 的范圍。
[0024] 所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系不包括動(dòng)物和植物的繁殖材料。
[0025] 上述重組載體將序列表中序列3所示的DNA分子替換pTrc99A質(zhì)粒Ncol和 Hindlll酶識(shí)別位點(diǎn)間DNA片段得到的重組質(zhì)粒，命名為pTRS178,即為產(chǎn)莢膜紅細(xì)菌黃嘌 呤脫氫酶截?cái)囿w的重組質(zhì)粒，表達(dá)黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w。
[0026] 上述的蛋白在作為黃嘌呤脫氫酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0027] 上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備黃嘌呤脫 氫酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0028] 上述的蛋白或上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在 制備具有黃嘌呤脫氫酶活性的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0029] 或上述的蛋白或上述DNA分子或權(quán)利要求5所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系 或重組菌在降解黃嘌呤或次黃嘌呤中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0030] 上述應(yīng)用中，所述黃嘌呤脫氫酶具有如下1)_3)中至少一種特性：
[0031] 1)所述黃嘌呤脫氫酶的亞基構(gòu)型為（α β 丫）2型；
[0032] 2)所述黃嘌呤脫氫酶的最適反應(yīng)溫度為40°C ;
[0033] 3)所述黃噪呤脫氫酶的最適pH值為8. 5。
[0034] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備黃嘌呤脫氫酶的方法。
[0035] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：誘導(dǎo)表達(dá)上述的重組菌，得到權(quán)利要求1所述 蛋白。
[0036] 本發(fā)明提供的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w為由大小為18. 9kDa、序列如序列4所示的小 亞基和大小為30. 3kDa、序列如序列5所不的中亞基和大小為83. 2kDa、序列如序列6所不 的大亞基組成，該黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w最適pH為8. 5, pH4. 5-10. 5范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適溫度為 40°C，25-60°C范圍內(nèi)穩(wěn)定，半失活溫度為63. 2°C，對(duì)黃嘌呤的KJ直為55±3 μ M，轉(zhuǎn)化數(shù)為 200. 08±4· 29s \最大比活力可達(dá)90. 14土 L 93U/mg蛋白，催化效率為3. 64s \ μΜ ^
[0037] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w，其與野生型黃嘌呤脫氫酶 相比，亞基構(gòu)型由（α 0)2改變成為（α β γ) 2;本發(fā)明提供的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w對(duì)底物 (黃嘌呤）的親和力提高19%，轉(zhuǎn)化數(shù)提高115%，催化效率提高166%。
[0038] 本發(fā)明提供的莢膜紅細(xì)菌黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w為首次報(bào)道的在XDH小亞基中選 擇型斷裂鐵硫簇和FAD結(jié)構(gòu)域，這與已經(jīng)報(bào)道的黃嘌呤脫氫酶及商品化黃嘌呤氧化酶有顯 著不同。另外，本發(fā)明提供的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w生產(chǎn)方法，從體內(nèi)源頭分段合成各亞基， 避免了體外蛋白酶的有限酶解過(guò)程，可以簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，有利于降低生產(chǎn)成本。
[0039] 本發(fā)明提供的莢膜紅細(xì)菌黃嘌呤脫氫酶斷裂體保留了野生型酶的不依賴于分子 氧（黃嘌呤脫氫酶利用NAD作為電子受體，不管是否存在氧氣均可以發(fā)生反應(yīng)）、寬泛的pH 作用范圍和耐受性、和寬泛的溫度作用范圍的特性，有利于與其他酶類聯(lián)用進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新 的應(yīng)用領(lǐng)域，尤其適合于樣品檢測(cè)，包括黃嘌呤和次黃嘌呤的檢測(cè)，與PNP酶聯(lián)用檢測(cè)無(wú)機(jī) 磷酸，與PNP、X0D和P0D酶聯(lián)用檢測(cè)腺苷脫氨酶，和5'-核苷酸酶的檢測(cè)，同時(shí)適合于工業(yè) 化應(yīng)用，包括降解病毒唑等核苷類藥物生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的次黃嘌呤等副產(chǎn)物和降解嘌呤、 蝶啶和醛類等多種含sp2雜化的碳原子的雜環(huán)分子類有機(jī)污染物等商業(yè)化應(yīng)用的需求。并 可以將本發(fā)明提供的黃嘌呤脫氫酶的應(yīng)用領(lǐng)域拓展至其它催化底物，例如其它嘌呤、蝶啶、 雜環(huán)分子和醛類在內(nèi)的多種底物的氧化反應(yīng)，和亞甲基藍(lán)、苯醌、高鐵氰化物和硝酸鹽等多 種類型的電子受體，進(jìn)一步將該黃嘌呤脫氫酶應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域。黃嘌呤脫氫酶截?cái)?體提高的催化活性和溫度耐受性，有利于減少酶的使用量、降低成本，更加有利于工業(yè)應(yīng)用 過(guò)程。
【附圖說(shuō)明】
[0040] 圖1為野生型莢膜紅細(xì)菌黃嘌呤脫氫酶的計(jì)算結(jié)構(gòu)與牛奶黃嘌呤脫氫酶晶體結(jié) 構(gòu)的結(jié)構(gòu)比對(duì)圖。
[0041] 圖2為純化的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿wSplitl78與野生型的natvie-PAGE(A)和 SDS-PAGE 電泳圖（B)。
[0042] 圖3為純化的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿wSplitl78與野生型的酶活（A)和穩(wěn)定性（B) 隨溫度變化圖。
[0043] 圖4為純化的重組黃嘌呤脫氫酶Splitl78與野生型的酶活㈧和穩(wěn)定性⑶隨 pH變化圖。
[0044] 圖5為黃嘌呤濃度對(duì)純化的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿wSplitl78與野生型酶催反應(yīng)速 度的影響；(A)初反應(yīng)速度與濃度關(guān)系圖；(B)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖。
[0045] 圖6為純化的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿wSplitl78降解黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸隨 時(shí)間變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0047] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、試劑盒等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0048] pTrc99A為中國(guó)質(zhì)粒載體菌株細(xì)胞株基因保藏中心Biovector Science Lab, Inc. 產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為 Biovectorl08321 (GenBank 登錄號(hào)為 M22744. 1，Amann, Ε·，Ochs, B. and Abel,K. J. Tightly regulated tac promoter vectors useful for the expression of unfused and fused proteins in Escherichia coli.Gene, 1988,69(2):301-315.) 〇
[0049] 重組質(zhì)粒pTrc99A-RcXDHNHis為將序列8所示的DNA分子插入pTrc99A載體Ncol 和Hind III雙酶切位點(diǎn)得到的載體。
[0050] 含pTrc99A-RcXDHNHis重組質(zhì)粒的工程化大腸桿菌DH5 α :將重組質(zhì)粒 pTrc99A-RcXDHNHis轉(zhuǎn)入工程化大腸桿菌DH5 α中，得到重組菌。
[0051] 鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)一 Qiagen?鎮(zhèn)柱親和樹(shù)脂為Qiagen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品 目錄號(hào)為30210。
[0052] 黃嘌呤和次黃嘌呤為Sigma公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為Sigma X7375_10g和 Sigma H9377〇
[0053] Stratagene定點(diǎn)突變?cè)噭┖袨榘步輦惞続gilent Technologies產(chǎn)品，產(chǎn)品目 錄號(hào)為200518。
[0054] 下述實(shí)施例中的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿wSplitl78(以下簡(jiǎn)稱截?cái)囿w，或Splitl78) 均是指實(shí)施例1制備的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w；
[0055] 實(shí)施例1、黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w及編碼基因的獲得
[0056] -、黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w及其編碼基因的獲得
[0057] 1、野生型黃嘌呤脫氫酶理論計(jì)算模型的構(gòu)建
[0058] 以蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中解析的莢膜紅細(xì)菌黃嘌呤脫氫酶晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID: 2W3S)為模板，分別構(gòu)建野生型黃嘌呤脫氫酶大亞基和小亞基的同源模型；該操作借助于 Swiss-Model 服務(wù)器（http://www. swissmodel. expasy. org/interactive)完成，也可以米 用SPDBV軟件（http://spdbv. vital-it. ch)在本地電腦上構(gòu)建同源模型。
[0059] 借助于SPDBV軟件，將2W3S PDB文件和野生型的大小兩個(gè)亞基的理論模型PDB文 件導(dǎo)入；借助于軟件所帶結(jié)構(gòu)比對(duì)功能，將大小亞基組裝進(jìn)2W3S模版；只保留2W3S中各氧 化還原中心原子及底物類似物分子和野生型的大小亞基，進(jìn)行能量最小化優(yōu)化。優(yōu)化后的 結(jié)構(gòu)即為野生型的理論計(jì)算模型。
[0060] 2、野生型黃嘌呤脫氫酶的理論計(jì)算模型與牛奶XDH晶體結(jié)構(gòu)比對(duì)
[0061] 借助于Pymol工具，將經(jīng)過(guò)蛋白酶有限裂解的牛奶XDH的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID :3AX9) 和步驟一中所得野生型的理論計(jì)算模型進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)。結(jié)果如下圖1所示。
[0062] 圖1表明野生型黃嘌呤脫氫酶與牛奶XDH總體結(jié)構(gòu)基本一致，大亞基部分可以更 好的疊合，主要的區(qū)別在于小亞基部分。其中，牛奶XDH在對(duì)應(yīng)于野生型黃嘌呤脫氫酶柔環(huán) 1〇〇Ρ 167 177的部位斷裂掉。Loop 167 177鏈接野生型黃嘌呤脫氫酶中包含[2Fe_2S]簇的結(jié)構(gòu)域 和包含F(xiàn)AD的結(jié)構(gòu)域。L〇〇p 167 177的C端（第177位氨基酸）鏈接另一柔環(huán)，并與牛XDH中 相對(duì)應(yīng)的位置一致，而N端（第167位氨基酸）鏈接一 alpha螺旋，并且與牛XDH對(duì)應(yīng)位置 偏差較大。因此，為盡可能地減少對(duì)酶結(jié)構(gòu)和活性的干擾，本發(fā)明選擇L〇〇p 167 177的C端，即 177位氨基酸進(jìn)行斷裂設(shè)計(jì)。
[0063] 二、產(chǎn)莢膜紅細(xì)菌黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w的重組質(zhì)粒PTRS178的構(gòu)建
[0064] 1、提取模板質(zhì)粒
[0065] 用接種環(huán)挑取一環(huán)保藏于_80°C超低溫冰箱的含pTrc99A-RcXDHNHis重組質(zhì)粒的 工程化大腸桿菌DH5 α，在含有1〇〇 μ g/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，然后倒 置于37°C培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)16h ;挑取單菌落接種于5ml含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，于37°C、220rpm搖床中培養(yǎng)過(guò)夜；用質(zhì)粒提取試劑盒（Tiangen公司，產(chǎn)品代 碼DP103)提取質(zhì)粒DNA ;
[0066] 2、設(shè)計(jì)并合成如下引物
[0067] 采用Stratagene定點(diǎn)突變?cè)噭┖校ò步輦惞?，Agilent Technologies，產(chǎn)品目 錄號(hào)為200518)策略，以pTrC99A-RCXDHNHis全質(zhì)粒為模板，通過(guò)長(zhǎng)片段引物在特定位置引 入堿基序列。所設(shè)計(jì)引物如下，
[0068] 上游引物：
[0069] 5? -AGCCTAAGG AGGA AACAGACC K\^C(XXKXKVFCCT(K；C(VAAA(XXKK}GATG -3'（序列 1)
[0070] (下劃線所示序列為終止密碼子，粗體斜體部分為RBS序列，粗體下劃線部分序列 為起始密碼子，斜體部分為與pTrc99A-R CXDHNHis中野生型黃嘌呤脫氫酶基因互補(bǔ)配對(duì)序 列）
[0071] 下游引物：
[0072] 5 ' -GGG CM；? GGTCTGTT TCCK CCTTAGGCTGTCTGCCCCCGCACGCCCGAGGATATTTC-3 '（序 列2)
[0073] (粗體下劃線所示序列為起始密碼子互補(bǔ)序列，斜體部分RBS序列互補(bǔ)序列，下劃 線部分序列為終止密碼子互補(bǔ)序列，斜體部分為與pTrc99A-R CXDHNHis中野生型黃嘌呤脫 氫酶基因互補(bǔ)配對(duì)序列）
[0074] 3、PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增
[0075] 以步驟一提取的pTrc99A_RcXDHNHis為模板，以上述二合成的上游引物和下游引 物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到8845bpPCR產(chǎn)物，即為線性片段化的含有Splitl78截短體編 碼基因的重組質(zhì)粒pTRS 178。
[0076] 25 μ 1 PCR 反應(yīng)體系：lng pTrc99A-RcXDHNHis, 2. 5 μ 1 上游引物，2. 5 μ 1 下游引 物，5 μ 1 5x Q5Reaction buffer，5 μ 15x Q5High GC enhancer，2 μ 1 dNTPs (各 2. 5mM)， 0· 5U Q5DNA polymerase，ddH20 補(bǔ)齊至 25 μ l〇
[0077] PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?8°C預(yù)變性 lmin，98°C 10s，62°C 5s，72°C 4. 5min，循環(huán) 30 次，最 后 72°C退火 lOmin。
[0078] 4、重組質(zhì)粒pTRS178的構(gòu)建
[0079] 將上述獲得的PCR產(chǎn)物加入10U Dpnl酶，于37°C水浴溫浴lh以消解掉甲基化的 模板質(zhì)粒。經(jīng)消化的PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含氨 芐青霉素（l〇〇μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基，倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h。挑選陽(yáng)性克隆 提取質(zhì)粒測(cè)序，結(jié)果質(zhì)粒為將序列表中序列3所示的DNA分子替換pTrc99A質(zhì)粒Ncol和 Hindlll酶識(shí)別位點(diǎn)間DNA片段得到的重組質(zhì)粒，命名為pTRS178,即為產(chǎn)莢膜紅細(xì)菌黃嘌 呤脫氫酶截?cái)囿w的重組質(zhì)粒，表達(dá)黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w。
[0080] 序列表中序列3所示的DNA分子，自第22位至第3760位為黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w 的編碼基因，第3757位至第4695位為黃嘌呤脫氫酶伴侶蛋白的編碼基因，該黃嘌呤脫氫酶 伴侶蛋白的氣基酸序列如序列7所不，大小為33. 4kDa。
[0081] 黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w的編碼基因中，序列3第22位至第558位為黃嘌呤脫氫酶截 斷體的小亞基的編碼基因序列，該小亞基的氣基酸序列如序列4所不，大小為約18. 9kDa ; 第573位至第1430位為黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w的中亞基的編碼基因序列，該中亞基的氨基酸 序列如序列5所示，大小為30. 3kDa ;其中第1427位至第3760位為黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w的 大亞基的編碼基因序列，該大亞基的氨基酸序列如序列6所示，大小為83. 2kDa。
[0082] 黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w與野生型黃嘌呤脫氫酶相比，是將野生型的大小為49kDa的 小亞基從178位和179位中間進(jìn)行斷裂，生成大小分別為18. 9kDa和30. 3kDa的兩個(gè)亞基。
[0083] 黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w的編碼基因（序列3)與野生型黃嘌呤脫氫酶編碼基因（序 列8)相比，區(qū)別在于序列3比對(duì)8多了一段長(zhǎng)度為20bp的核苷酸序列（序列1中第5至 24位核苷酸），序列3為在序列8中563位和564位堿基中間插入一段長(zhǎng)度為20bp的核苷 酸序列（序列1中第5至24位核苷酸）得到的序列。
[0084] 三、黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w的純化
[0085] 1、將上述二得到的PTRS178轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，得到重組菌，挑取重組菌單菌 落，接種于5ml含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、220r/min條件下 培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，按照1 %的接種量轉(zhuǎn)接于500ml含100 μ g/mL氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、220r/min條件下培養(yǎng)，待菌液培養(yǎng)至0D_為0. 6左右，加入終濃 度為lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，同樣條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)16h。
[0086] 2、將步驟1得到的菌液9000r/min、4°C離心，收集沉淀，得到誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌， 沉淀用50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7. 5)洗滌一次后，重懸于100ml同樣的緩沖液中，得到 菌懸液，將菌懸液通過(guò)高壓細(xì)胞破碎機(jī)JN-10HC (廣州聚能生物科技有限責(zé)任公司）破胞， 流速10L/H，4°C，壓力為150MPa，破胞液于12 000r/min 4°C下離心30min，上清液為粗酶 液。
[0087] 3、金屬螯合層析法純化黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w
[0088] (1)在上述2獲得的粗酶液中加入終濃度為300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪 唑，并用0. 22 μ m濾膜過(guò)濾，得到濾液；
[0089] (2)將總體積為40ml的濾液上樣QiageP鎳柱親和樹(shù)脂，依次用含10mmol/L、 30mmol/L和50mmol/L咪唑的50mmol/L pH 7. 5磷酸緩沖液洗滌雜蛋白，每次洗脫的體積至 少為20個(gè)柱體積，然后用含120mmol/L咪唑的50mmol/L pH 7. 5磷酸緩沖液洗脫，收集洗 脫液為目的重組酶，以上洗脫的流速均為2. 5ml/min。
[0090] (3)將洗脫的目的重組酶通過(guò)分子截留量為lOKDa的Millipore超濾管，用 50mmol/L pH 7. 5Tris鹽酸緩沖溶液反復(fù)換洗三次以除去鹽分及咪唑成份后，得到濃縮酶 液，再將其重懸于50mmol/L pH 7. 5Tris鹽酸緩沖液中，得到黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w。
[0091] 采用上述的方法中，將pTrc99A-RCXDHNHis轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，并按照上 述方法純化，得到野生型黃嘌呤脫氫酶。
[0092] 將黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE)和變性 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，圖2A為Native-PAGE結(jié)果，野生 型代表野生型黃嘌呤脫氫酶，Splitl78代表黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w；圖2B為SDS - PAGE結(jié) 果，結(jié)果表明，黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w由大小約為18. 9kDa的小亞基、大小約為30. 3kDa的中 亞基和大小約為83. 2kDa的大亞基這三種亞基組成，而野生型黃嘌呤脫氫酶由大小約為 49. 2kDa的小亞基和約為83. 2kDa的大亞基這兩種亞基組成?；钚誀顟B(tài)的黃嘌呤脫氫酶截 斷體與野生型大小一致，均約為270kDa左右?？梢酝茢喑?，截?cái)囿w為（α β γ)2型組成，而 野生型為（α β)2。
[0093] 實(shí)施例2、黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w在作為黃嘌呤脫氫酶的表征
[0094] 1、黃嘌呤脫氫酶酶活性的測(cè)定方法
[0095] 2mL酶活性的測(cè)定反應(yīng)體系如表1所示。
[0096] 表1黃嘌呤脫氫酶酶活測(cè)定的2mL反應(yīng)體系組成
[0097]
[0098] 將表1中的2mL反應(yīng)體系中除黃嘌呤脫氫酶水溶液外的其余試劑混勻后置于40°C 水浴溫浴5min，然后加入100 μ L黃嘌呤脫氫酶水溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。在40°C條件下邊反應(yīng)邊 記錄反應(yīng)3-5min內(nèi)0D295吸光值變化，計(jì)算反應(yīng)曲線最初線性部分的吸光度隨時(shí)間變化速 率（△ 0D295/min)，吸光度隨時(shí)間變化速率（△ 0D295/min)反映的是黃嘌呤脫氫酶水溶液生成 尿酸的速率。
[0099] 按照下述公式計(jì)算所檢測(cè)的黃嘌呤脫氫酶的酶活和比酶活。
[0100] 酶活（U/ml) = A〇D295/minXl. 6Xdf (公式 1)
[0101] 比酶活（U/mg) = (U/ml) X 1/C (公式 2)
[0102] 公式1中1. 6為采用消光系數(shù)法將上述2ml反應(yīng)體系中尿酸從吸光度變化轉(zhuǎn)化為 摩爾濃度的計(jì)算系數(shù)，該系數(shù)計(jì)算方法為：
[0104] 其中：Vt為反應(yīng)總體積（2. 0ml)，Vs為反應(yīng)體系中酶液體積（0. 1ml)，12. 5為
[0105] 測(cè)定條件下尿酸的摩爾消光系數(shù)（cm2/ μ mol)，1. 0cm為測(cè)定比色杯光程。
[0106] 公式1中df為酶液稀釋倍數(shù)。
[0107] 公式2中C為酶液的濃度，單位為mg/ml。
[0108] 酶活力單位⑶定義：在測(cè)定溫度和pH值條件下每分鐘轉(zhuǎn)化生成1 μ mol尿酸所 需要的酶量。
[0109] 2、最適溫度和溫度耐受性的測(cè)定
[0110] 檢測(cè)由實(shí)施例1中制備的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w是否具有黃嘌呤脫氫酶活性及其 最適溫度和溫度耐受性，以野生型黃嘌呤脫氫酶為對(duì)照。
[0111] 將上述1的方法中的黃嘌呤脫氫酶分別替換為實(shí)施例1中制備的黃嘌呤脫氫酶截 斷體和野生型黃嘌呤脫氫酶。
[0112] 最適溫度的測(cè)定通過(guò)將表1的200 μ 1反應(yīng)體系分別置于25-80°C區(qū)間范圍內(nèi)測(cè)定 酶活，方法同步驟1，僅將水浴溫度替換為25-80°C區(qū)間，相對(duì)酶活用殘余酶活相對(duì)于最大 酶活的百分比來(lái)表示，最適溫度用相對(duì)酶活的最大值對(duì)應(yīng)的溫度表示。
[0113] 實(shí)施例1制備的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w催化活性隨反應(yīng)溫度變化曲線如圖3A所示， 表明，黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w具有黃嘌呤脫氫酶活性，且其最適反應(yīng)溫度為40°C，與野生型一 致。
[0114] 溫度耐受性的測(cè)定是通過(guò)將實(shí)施例1制備的重組黃嘌呤脫氫酶在25_80°C區(qū)間不 同溫度下分別處理30min，然后采用步驟1中的方法測(cè)定殘余酶活，相對(duì)酶活用殘余酶活性 相對(duì)于未經(jīng)過(guò)處理的重組黃嘌呤脫氫酶的酶活性的百分比來(lái)表示。以相對(duì)殘余酶活為縱坐 標(biāo)，以處理溫度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行S型曲線（Sigmoidal)曲線擬合，求出相對(duì)殘余酶活為50% 時(shí)對(duì)應(yīng)的處理溫度，記為半失活溫度（Τ 5(]3°)，用以表征溫度耐受性。
[0115] 實(shí)施例1制備的重組黃嘌呤脫氫酶溫度耐受性的測(cè)定結(jié)果如圖3B所示，表明，在 25-60°C以下，重組黃嘌呤脫氫酶保持穩(wěn)定，比野生型耐受更高的溫度，對(duì)應(yīng)的T M3°值比野 生型高11°C。
[0116] 3、最適pH和pH耐受性的測(cè)定
[0117] 最適pH值通過(guò)測(cè)定pH 4. 0-11.0范圍內(nèi)的相對(duì)酶活，用最大酶活對(duì)應(yīng)的pH值表 示。具體是將表1中反應(yīng)體系中最終濃度為〇. 05M的pH 8. 5Tris鹽酸緩沖溶液分別替換 為pH 4. 0-5. 8的0· 05M乙酸緩沖體系、pH 5. 8-8. 0的0· 05M磷酸緩沖體系、pH 7. 5-9. 0的 0. 05M的Tris鹽酸緩沖體系和pH 9. 0-11. 0的0. 05M的碳酸鈉緩沖體系進(jìn)行測(cè)定。以野生 型黃嘌呤脫氫酶為對(duì)照。
[0118] 結(jié)果如圖4A所示，表明，黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w的最適pH值為8. 5,與野生型一致。
[0119] pH耐受性的測(cè)定是通過(guò)將黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w置于pH 4.0-11.0區(qū)間不同pH值 0. 05M緩沖溶液（pH 4. 0-5. 8為0. 05M乙酸緩沖體系；pH 5. 8-8. 0為0. 05M磷酸緩沖體系； pH 7. 5-9. 0為Tris鹽酸緩沖體系；pH 9. 0-11. 0為碳酸鈉緩沖體系）中，于室溫放置16h。 然后采用步驟1中的方法測(cè)定殘余酶活，相對(duì)酶活用殘余酶活性相對(duì)于未經(jīng)過(guò)處理的黃嘌 呤脫氫酶的酶活性的百分比來(lái)表示。
[0120] 結(jié)果如圖4B所示，表明，在pH4. 5-10. 5范圍內(nèi)，黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w保持穩(wěn)定。
[0121] 4、酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)
[0122] 按照步驟1的方法測(cè)定實(shí)施例1的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w的酶活力。在最適pH8. 5 和最適溫度40°C條件下，0. 001_5mM黃嘌呤濃度范圍內(nèi)測(cè)定的最初反應(yīng)速度，符合米氏動(dòng) 力學(xué)方程。
[0123] 測(cè)定結(jié)果如圖5所示，A為初反應(yīng)速度隨黃嘌呤濃度變化圖，B為對(duì)應(yīng)的雙倒數(shù)曲 線圖，表明，黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w對(duì)黃嘌呤的1為55±3 μΜ，kcat值為200. 08±4. 29s \比 酶活可達(dá)90.14±1.931]/1^，催化效率為3.6481.以1 1。同等條件下測(cè)定的野生型黃嘌呤 脫氫酶的K"為68 ± 20 μ M，k cat值為93. 03 ± 10. 5s \最大比活力為41. 91 ±4. 73U/mg蛋白， 催化效率為1.37s \ μΜ1。因此，與野生型相比，本發(fā)明提供的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w對(duì)底物 (黃嘌呤）的親和力提高19%，轉(zhuǎn)化數(shù)提高115%，催化效率提高166%。
[0124] 5、黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w在降解黃嘌呤和次黃嘌呤以及處理含該類底物的材料中 的應(yīng)用
[0125] 參照表1中黃嘌呤脫氫酶反應(yīng)體系的構(gòu)建方法，構(gòu)建如下a)至d)四組反應(yīng)體系：
[0126] a) 50mM Tris-HCl緩沖溶液（pH 7. 5)，分別含終濃度為ImM的EDTA，0.1 mM的氧嗪 酸鉀，0.1 mM的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+)，0.1 mM的黃嘌呤和0. 4975mg/L實(shí)施例1制備 的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w；
[0127] b) 50mM Tris-HCl緩沖溶液（pH 7. 5)，分別含終濃度為ImM的EDTA，0.1 mM的氧嗪 酸鉀，0.1 mM的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+)，0.1 mM的次黃嘌呤，和0. 4975mg/L實(shí)施例1 制備的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w；
[0128] c) 50mM Tris-HCl緩沖溶液（pH 8. 5)，分別含終濃度為ImM的EDTA，0.1 mM的氧嗪 酸鉀，0.1 mM的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+)，0.1 mM的黃嘌呤，和0. 4975mg/L實(shí)施例1制 備的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w；
[0129] d) 50mM Tris-HCl緩沖溶液（pH 8. 5)，分別含終濃度為ImM的EDTA，0.1 mM的氧嗪 酸鉀，0.1 mM的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+)，0.1 mM的次黃嘌呤，和0. 4975mg/L實(shí)施例1 制備的黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w；
[0130] 分別將a)和b)反應(yīng)體系中除黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w外的所有試劑加入并混勻，置 于35°C水浴中溫浴5min，然后加入黃嘌呤脫氫酶啟動(dòng)反應(yīng)，利用帶有加熱模塊的分光光度 計(jì)將反應(yīng)溫度控制在35°C條件下，邊反應(yīng)邊記錄反應(yīng)3-5min內(nèi)295nm下吸光值變化，繪制 吸光度（A0D 295)的增加隨時(shí)間變化的關(guān)系曲線、并計(jì)算反應(yīng)曲線最初線性部分的吸光度隨 時(shí)間的變化速率（A 〇D295/min)，從而檢測(cè)底物黃嘌呤和次黃嘌呤的降解情況。
[0131] 采用同樣的操作方法，將c)和d)置于40°C溫浴，然后加入重組黃嘌呤脫氫酶啟動(dòng) 反應(yīng)，記錄40°C反應(yīng)條件下△ 0D295變化，檢測(cè)底物黃嘌呤和次黃嘌呤的降解情況。
[0132] a)至d)反應(yīng)體系中吸光度（A〇D295)的增加值隨時(shí)間的曲線如圖6A所示。
[0133] 作為對(duì)照，分別用0. 3665mg/L野生型黃嘌呤脫氫酶替代黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w構(gòu) 建上述a)至d)四組反應(yīng)體系，采用相同的測(cè)定方法，檢測(cè)各反應(yīng)體系中底物黃嘌呤和次黃 嘌呤的降解解情況。野生型所構(gòu)建的反應(yīng)體系中吸光度（A0D 295)的增加值隨時(shí)間的曲線 如圖6B所示。
[0134] 圖6A表明，黃嘌呤脫氫酶截?cái)囿w在pH 7.5和35°C、pH 8.5和40°C下均可以有 效降解黃嘌呤和次黃嘌呤。a)至d)反應(yīng)體系下的最大吸光度變化速度（Δ(?295/π?η)分 別為 0· 0187、0· 056、0· 0364 和 0· 0736,對(duì)應(yīng)的降解速率分別為 0· 0299 μπιο?. L Lmin \ 0· 0896 μ mol. L、min \ 0· 0582 μ mol. L、min 1 和 0· 1178 μ mol. L、min \ 對(duì)應(yīng)的比活力分 別為3. 01U/mg，9. 01U/mg，5. 85U/mg和11. 83U/mg，相比較于同等條件下測(cè)定的野生型對(duì)應(yīng) 的比活力分別為2.641]/11^，8.241]/11^，5.081]/11^和10.581]/11^(圖68)，分別提高了14%， 9%，15% 和 12%〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蛋白，由亞基甲、亞基乙和亞基丙3個(gè)亞基組成： 所述亞基甲的氨基酸序列為序列表中序列4或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序列經(jīng) 過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的序列； 所述亞基乙的氨基酸序列為序列表中序列5或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序列經(jīng) 過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的序列； 所述亞基丙的氨基酸序列為序列表中序列6或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序列經(jīng) 過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的序列。2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子包括所述亞基甲的編 碼DNA分子、所述亞基乙的編碼DNA分子和所述亞基丙的編碼DNA分子。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的DNA分子，其特征在于： 所述DNA分子為如下中1)-4)中至少一種： 1) 編碼區(qū)為序列表中序列3第22位至第3760位核苷酸所示的DNA分子； 2) 編碼區(qū)為序列表中序列3的核苷酸所示的DNA分子； 3) 在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1或2所述蛋白的 DNA分子； 4) 與1)或2)限定的DNA分子具有90 %以上的同一性且編碼權(quán)利要求1或2所述蛋 白的DNA分子。5. 含有權(quán)利要求2-4中任一所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組 菌。6. 權(quán)利要求1所述的蛋白在作為黃嘌呤脫氫酶中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求2-4中任一所述DNA分子或權(quán)利要求5所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞 系或重組菌在制備黃嘌呤脫氫酶中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2-4中任一所述DNA分子或權(quán)利要求5所述重組 載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備具有黃嘌呤脫氫酶活性的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1所述的蛋白或權(quán)利要求2-4中任一所述DNA分子或權(quán)利要求5所述重組 載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在降解黃嘌呤或次黃嘌呤中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述黃嘌呤脫氫酶具有如下1)-3)中 至少一種特性： 1) 所述黃嘌呤脫氫酶的亞基構(gòu)型為（α β 丫）2型； 2) 所述黃嘌呤脫氫酶的最適反應(yīng)溫度為40°C ; 3) 所述黃噪呤脫氫酶的最適pH值為8. 5。10. -種制備黃嘌呤脫氫酶的方法，包括如下步驟：誘導(dǎo)表達(dá)權(quán)利要求5所述的重組 菌，得到權(quán)利要求1所述蛋白。
【文檔編號(hào)】A62D101/28GK105985935SQ201510048275
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年1月30日
【發(fā)明人】邢新會(huì), 王成華, 張翀
【申請(qǐng)人】清華大學(xué), 清華大學(xué)無(wú)錫應(yīng)用技術(shù)研究院