系統(tǒng)性紅斑狼瘡3’端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因及分析方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種系統(tǒng)性紅斑狼瘡3’端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因及分析方法和應(yīng)用。通過對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與健康對(duì)照組的外周血單個(gè)核細(xì)胞中3’端非編碼區(qū)基因長(zhǎng)度多態(tài)性進(jìn)行研究，并檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者mRNA差異表達(dá)水平，對(duì)研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)理以及臨床診斷和治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有重要的意義。上述分析方法以及得到的3’端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因可作為診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的中間結(jié)果，有利于探明3’端非編碼區(qū)長(zhǎng)度差異基因mRNA的表達(dá)水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)度及不同臨床病癥之間的關(guān)系，驗(yàn)證各種診斷標(biāo)記物及藥物靶點(diǎn)，并有助于開發(fā)新型系統(tǒng)性紅斑狼瘡靶向治療藥物。
【專利說明】
系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因及分析方法 和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及疾病病理研究領(lǐng)域，尤其是涉及一種系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng) 度差異基因及分析方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)是一種自身免疫性疾病?；颊呙庖吣褪軉适А⒚庖邚?fù)合物 沉積，因而自身抗體產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞因子失衡，炎癥反應(yīng)失控造成體內(nèi)多種器官和組織損 傷。系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種涉及多基因遺傳的復(fù)雜疾病，單個(gè)基因的異常對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼 瘡遺傳發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)起到的作用較小。目前一般認(rèn)為系統(tǒng)性紅斑狼瘡受遺傳、環(huán)境因素、性激素 紊亂等多方面影響。因此，研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)理尤其是基因表達(dá)差異具有重要 的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 基于此，有必要提供一種可用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)理研究的系統(tǒng)性紅斑狼瘡 3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因及分析方法和應(yīng)用。
[0004] 一種系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因的分析方法，包括如下步驟：
[0005] 對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和健康對(duì)照組分別提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA，得到 兩組測(cè)序樣本；
[0006] 對(duì)兩組測(cè)序樣本的總RNA分別進(jìn)行質(zhì)檢，若提取的總RNA無污染、完整且無明顯降 解，則進(jìn)行后續(xù)步驟；
[0007] 利用mRNA的3'端單端特異性對(duì)兩組總RAN進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建mRNAs的3'端非翻譯 區(qū)文庫(kù)；
[0008] 使用FastQC軟件對(duì)構(gòu)建的3'端非翻譯區(qū)文庫(kù)中堿基的有效reads數(shù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng) 估；
[0009] 對(duì)于有兩個(gè)或多個(gè)串聯(lián)的polyA位點(diǎn)而且在兩個(gè)樣本中都表達(dá)的基因，使用線性 趨勢(shì)檢測(cè)的方法進(jìn)行APA位點(diǎn)轉(zhuǎn)化事件檢驗(yàn)，獲得加長(zhǎng)的3'端非翻譯區(qū)基因與縮短的3' 端非翻譯區(qū)基因的多態(tài)性散點(diǎn)數(shù)據(jù)；
[0010] 使用在線DAVID工具進(jìn)行差異基因富集的G0功能分析，選取P值小于0. 1的G0 和KEGG pathway的為功能富集結(jié)果，得到系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與健康對(duì)照組的3'端非翻 譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因。
[0011] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述外周血單個(gè)核細(xì)胞采集自外周靜脈血，所述提取外周 血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA是先使用Ficoll密度梯度離心法從所述外周靜脈血分離出所述外 周血單個(gè)核細(xì)胞，然后使用Trizol法從所述外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取所述總RNA。
[0012] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述對(duì)兩組測(cè)序樣本的總RNA分別進(jìn)行質(zhì)檢是：當(dāng)使用瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA樣品的完整度，當(dāng)觀察到到28S和18S兩條清晰的條帶時(shí)，表明所 述提取的總RNA完整且無明顯降解；當(dāng)使用紫外分光光度計(jì)測(cè)得0D260/0D280在1. 8~2. 2 之間，說明無 DNA或蛋白質(zhì)污染。
[0013] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述分析方法還包括在構(gòu)建得到mRNAs的3'端非翻譯區(qū)文 庫(kù)之后，使用安捷倫2100生物分析儀檢測(cè)文庫(kù)片段主峰，并檢測(cè)是否存在雜吸收峰，以檢 測(cè)構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量的步驟。
[0014] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述使用FastQC軟件對(duì)構(gòu)建的3'端非翻譯區(qū)文庫(kù)中堿基 的有效reads數(shù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估是檢測(cè)單個(gè)樣品單端測(cè)序有效reads數(shù)是否大于10M，若大于 10M，則滿足質(zhì)量要求。
[0015] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述分析方法還包括從得到的所述3 '端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異 基因中選取部分或全部基因，使用RTQ-PCR技術(shù)驗(yàn)證系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與健康對(duì)照組的 3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異情況的步驟。
[0016] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，選取的3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因?yàn)镴un、UBE2J2及 CALM3〇
[0017] -種系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因，通過使用上述任一項(xiàng)所述的系 統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因的分析方法分析得到。
[0018] 在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因?yàn)镴un、UBE2J2及CALM3。
[0019] 上述分析得到的系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因可應(yīng)用在制備診斷 系統(tǒng)性紅斑狼瘡檢測(cè)試劑或檢測(cè)裝置中。
[0020] 本發(fā)明通過對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與健康對(duì)照組的外周血單個(gè)核細(xì)胞中3'端非 編碼區(qū)基因長(zhǎng)度多態(tài)性進(jìn)行研究，并檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者mRNA差異表達(dá)水平，對(duì)研究 系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)理以及臨床診斷和治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有重要的意義。但由于 系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種復(fù)雜的綜合病征，診斷時(shí)需要考慮多方面的因素，上述分析方法以 及得到的3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因只作為診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的中間結(jié)果，然而雖 為中間結(jié)果，卻有利于探明3'端非編碼區(qū)長(zhǎng)度差異基因 mRNA的表達(dá)水平與系統(tǒng)性紅斑狼 瘡疾病活動(dòng)度及不同臨床病癥之間的關(guān)系，驗(yàn)證各種診斷標(biāo)記物及藥物靶點(diǎn)，并有助于開 發(fā)新型系統(tǒng)性紅斑狼瘡靶向治療藥物。
【附圖說明】
[0021] 圖1為樣品總RNA的瓊脂糖凝|父電泳圖；
[0022] 圖2為健康對(duì)照組的文庫(kù)片段分布圖，橫坐標(biāo)表示核酸片段的長(zhǎng)度，縱坐標(biāo)表示 熒光值；
[0023] 圖3為SLE組的文庫(kù)片段分布圖，橫坐標(biāo)表示核酸片段的長(zhǎng)度，縱坐標(biāo)表示熒光 值；
[0024] 圖4為reads測(cè)序質(zhì)量分布圖，其中，橫軸表示reads上的堿基位置，縱軸表示測(cè) 序質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測(cè)序質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高表明測(cè)序的錯(cuò)誤率越小（錯(cuò)誤率=10-測(cè)序質(zhì)量分?jǐn)?shù)/10)， 圖中，紅色、黃色、綠色區(qū)域分別表示質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20以下，20~28, 28~40 ;黑色曲線表示 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均數(shù)，紅色短橫線表示中位數(shù)，黃色方框的上下端分別表示所有reads在該 位置上堿基質(zhì)量排名前25%和75%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，方框外部的上下兩條黑色短橫線則分別 表示前10 %和90 %的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；
[0025] 圖5為對(duì)照組與SLE組的3'UTR長(zhǎng)度多態(tài)性散點(diǎn)圖，該散點(diǎn)圖是將tandem APA位 點(diǎn)switch指數(shù)（TSI)對(duì)應(yīng)SLE樣品和健康對(duì)照樣品表達(dá)水平比值的對(duì)數(shù)作圖，其中，橫軸 代表TSI，正的TSI值表明SLE組樣品中傾向使用較長(zhǎng)的3'UTR，具有明顯的tandem 3'UTR 長(zhǎng)度變化的基因（FDR〈0. 01)用不同顏色標(biāo)出：使用較長(zhǎng)3'UTR的基因標(biāo)記為藍(lán)色，使用較 短3' UTR的基因標(biāo)記為紅色，Y軸代表SLE樣品和健康對(duì)照組樣品表達(dá)水平比值的對(duì)數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非編碼區(qū)長(zhǎng)度差異基因 及其分析方法和應(yīng)用做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0027] 材料與方法
[0028] 1.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者及健康對(duì)照組的選取
[0029] 2013年9月~10月期間在桂林市第181醫(yī)院SLE患者9人，均為女性，年齡25~ 58歲，平均年齡44. 8+9. 40歲，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)（ARA) 1997年修訂的SLE診斷 標(biāo)準(zhǔn)。健康對(duì)照組9人，年齡24~48歲，平均年齡40. 2+7. 19歲，健康對(duì)照組本人及其直 系親屬無自身免疫性疾病史，且采血前一周無身體不適癥狀，未服用激素或其他藥物。本研 究通過本單位醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審查，所有被采血者知情且同意。
[0030] 2.樣品提取
[0031] 使用EDTA抗凝管采集9例健康對(duì)照組和9例SLE患者（皮膚和腎臟受累型） 的外周靜脈血，每人3ml，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC)， Trizol (Cat. no. 15596-026，Invitrogen公司）法提取各樣品總RNA，每組的9例樣品均勾 混合成一個(gè)樣品池，因而，共得到兩組樣品。
[0032] 可理解，在其他實(shí)施例中，該外周靜脈血樣品也可以直接取自醫(yī)院或相關(guān)研究結(jié) 構(gòu)的血庫(kù)。
[0033] 3.RNA 質(zhì)檢
[0034] 總RNA主要包括2~3 %的信使RNA (mRNA)、15~20 %的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和80~85 % 的核糖體RNA。總RNA真核：28s+18s，當(dāng)28sRNA為18sRNA量的1~2倍時(shí)，表明RNA較完 整，否則表示RNA已發(fā)生降解。使用微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop ND-1000，Nanodrop公 司）檢測(cè)樣品RNA總量>3 yg(其中l(wèi)yg用于樣品質(zhì)檢，0.5 yg用于3'端非編碼區(qū)（以 下簡(jiǎn)稱為3' UTR)文庫(kù)的制備，0. 5 μ g用于實(shí)驗(yàn)備份，1 μ g用于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證），0D260/280值 在1. 8~2. 2之間，說明樣品無 DNA或蛋白質(zhì)污染。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA樣品 完整度，結(jié)果如圖1所示，可見28S、18S和5S3個(gè)條帶，且28S和18S條帶清晰，表明所抽提 的總RNA較完整無明顯降解，可用于進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄使用。
[0035] 4.文庫(kù)制備與質(zhì)檢
[0036] 利用mRNA的3'端單端特異性對(duì)兩組總RAN進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建mRNAs的3'端非翻譯 區(qū)文庫(kù)。
[0037] 構(gòu)建文庫(kù)后，使用安捷倫2100生物分析儀（Agilent Bioanalyzer 2100,Agilent 公司）檢測(cè)文庫(kù)片段主峰，并檢測(cè)是否存在雜吸收峰，雜峰會(huì)影響測(cè)序有效數(shù)據(jù)量。使用 StepOne? Real-Time PCR System(Applied Biosystems⑧）檢測(cè)文庫(kù)濃度 >lng/μ L。圖 2和圖3顯示兩組文庫(kù)片段大小都分布在350bp左右（180-680bp)，同下表1檢測(cè)數(shù)據(jù)一起 說明制備的文庫(kù)質(zhì)量合格。
[0038] 表1 3'UTR文庫(kù)質(zhì)檢數(shù)據(jù)
[0039]
[0040] 5.測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與質(zhì)量評(píng)估
[0041] 使用軟件FastQC (Version 0. 9)對(duì)堿基質(zhì)量分別進(jìn)行評(píng)估。圖4所示的reads測(cè) 序質(zhì)量分布結(jié)果表明測(cè)序數(shù)據(jù)滿足單個(gè)樣品單端測(cè)序有效reads數(shù)大于10M的質(zhì)量要求。
[0042] 5. ISLE患者3' UTR長(zhǎng)度差異情況及功能分析
[0043] 測(cè)序大部分的reads均定位到人類參考基因組上，其中大多數(shù)reads唯一定位到 核基因組上。對(duì)于有兩個(gè)或多個(gè)串聯(lián)polyA位點(diǎn)而且在兩個(gè)樣品里都表達(dá)的基因，使用線 性趨勢(shì)檢驗(yàn)的方法進(jìn)行APA位點(diǎn)轉(zhuǎn)化（switch)事件檢驗(yàn)，獲得加長(zhǎng)的3'UTR基因與縮短的 3' UTR基因之間的多態(tài)性散點(diǎn)圖，如圖5所示。
[0044] 差異基因富集的G0功能采用在線（web)工具DAVID (http: //david. abcc. ncifcrf. gov)實(shí)現(xiàn)；選取P值小于0· 1的GO和KEGG通路（KEGG pathway)的為功能富集 結(jié)果。樣品配對(duì)中3' UTR長(zhǎng)度差異基因共有904個(gè)，富集的GO和KEGG pathway的功能富 集的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。
[0045] 表2對(duì)照組與SLE組配對(duì)中差異3'UTR基因富集的G0功能和KEGG pathway的數(shù) 目統(tǒng)計(jì)
[0046]
[0047] 上述分析得到的3' UTR長(zhǎng)度差異基因（如Jun、UBE2J2、CALM3等）可以用于制備 診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡檢測(cè)試劑或檢測(cè)裝置，以為診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡提供中間結(jié)果支持， 結(jié)合其他數(shù)據(jù)或檢測(cè)結(jié)果，最終判斷為是否是患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
[0048] 5. 2差異基因表達(dá)量及其G0和KEGG pathway富集分析
[0049] 由于所用測(cè)序方法只對(duì)mRNAs的3'末端進(jìn)行測(cè)序，因此，在基因表達(dá)量進(jìn)行估計(jì) 時(shí)，定位到基因上的reads數(shù)目即代表該基因在該樣品中的表達(dá)量。將表達(dá)的基因按照3 倍差異分為上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)的兩組。篩選出FDR〈0. 01的差異表達(dá)基因共1597個(gè)。樣 品配對(duì)中差異表達(dá)基因富集的GO和KEGG pathway的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。
[0050] 表3對(duì)照組與SLE組樣品配對(duì)中差異表達(dá)基因富集的G0功能和KEGG pathway的 數(shù)目統(tǒng)計(jì)
[0051]
[0052] 6.驗(yàn)證
[0053] 采用RTQ-PCR技術(shù)，選取其中3個(gè)3'UTR長(zhǎng)度差異基因：Jun、UBE2J2、CALM3jiE SLE患者組和健康對(duì)照組的PBMC中mRNA的3'UTR長(zhǎng)度變化情況。結(jié)果顯示這3個(gè)基因均 有良好的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，表明反應(yīng)體系穩(wěn)定，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，引物是特異的，無雜帶、 無雜信號(hào)，驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相符，即Jun、CALM3傾向有縮短的3' UTR，UBE2J2傾向有變 長(zhǎng)的3' UTR。
[0054] 本實(shí)施例以外周血單核細(xì)胞（PBMC)用于SLE的研究對(duì)象，不僅易于獲取，并且較 少受到醫(yī)學(xué)倫理限制，更重要的是PBMC是SLE發(fā)病的主要效應(yīng)組分，比人為制作的疾病動(dòng) 物模型更直接地反應(yīng)疾病發(fā)生發(fā)展，而且更客觀地判斷某種檢測(cè)手段臨床應(yīng)用的可行性。
[0055] SLE患者T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞高度活化，并且自發(fā)凋亡的淋巴細(xì)胞比例顯著增 高，有可能超過巨噬細(xì)胞的清除能力。另一方面，吞噬功能障礙，也會(huì)使得凋亡細(xì)胞不能及 時(shí)被清除以致大量自身抗原釋放，誘發(fā)自身免疫。SLE臨床表現(xiàn)多樣，包括紅斑、光敏感、關(guān) 節(jié)炎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害、血管損害、腎臟損害等。本實(shí)施例方法中KEGG信號(hào)通路（KEGG pathway)分析顯示：SLE組樣品中表達(dá)上調(diào)基因涉及細(xì)胞周期、吞噬作用、造血細(xì)胞系、肌 動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控、霍亂弧菌感染、抗原加工和呈遞、溶酶體、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞 成熟、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（白細(xì)胞介素10、組蛋白酶G(cath印sin G)、腫瘤壞死因子等12個(gè)相 關(guān)基因）、粘著連接等16條KEGG通路；下調(diào)的基因涉及致心律失常性右室心肌病、肥厚型 心肌病、造血細(xì)胞系、擴(kuò)張型心肌病等6條KEGG通路。與健康對(duì)照組相比，SLE組中3' UTR 長(zhǎng)度差異基因富集的KEGG信號(hào)通路分析顯示：傾向使用較長(zhǎng)3' UTR的基因涉及泛素介導(dǎo) 的蛋白水解、蛋白出口 2條KEGG通路；傾向使用較短3 ' UTR的基因涉及細(xì)胞內(nèi)吞、Notch信 號(hào)傳導(dǎo)途徑、趨化因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、粘著連接等24 條KEGG通路。這些信號(hào)通路都與SLE患者臨床癥狀以及并發(fā)癥密切相關(guān)。對(duì)于SLE這種 復(fù)雜疾病，研究3' UTR長(zhǎng)度多態(tài)性可能是探究發(fā)病機(jī)制的一個(gè)新視點(diǎn)。
[0056] SLE多發(fā)于育齡期女性，男女患病率之比約為1 : 9,此病具有高度的遺傳傾向性 及家族聚集性，同胞的患病風(fēng)險(xiǎn)是正常人的8倍以上，同卵雙生子的發(fā)病一致率為40%，異 卵雙生子為4%，中國(guó)漢族人群的遺傳度為43. 6%，但并不呈孟德爾模式遺傳。SLE的免疫 異常與多條免疫信號(hào)通路（如NF- κ B信號(hào)通路、Toll-like受體信號(hào)通路、JAK/STAT信號(hào) 通路等）紊亂密切相關(guān)。通過3'單端特異測(cè)序，實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得大量可能與SLE發(fā)病機(jī)制有 關(guān)的基因，以下是對(duì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所挑選的3個(gè)基因的介紹。
[0057] Jun是一種轉(zhuǎn)錄因子，識(shí)別并結(jié)合七聚體基序5' -TGA[CG]TCA-3'。磷酸化能增強(qiáng) 其轉(zhuǎn)錄活性，屬于bZIP類家庭，與HIVEP3、SMAD3/SMAD4、TCF20、C0PS5等反應(yīng)，能間接導(dǎo)致 DSIPI磷酸化，抑制API與其靶DNA的結(jié)合。c-Jun調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和動(dòng)脈損傷 后新內(nèi)膜的形成。Jun蛋白能與雌激素受體協(xié)同作用，調(diào)節(jié)生理過程，在細(xì)胞吞噬，細(xì)胞增 殖、分化、凋亡和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。例如，c-Jun的下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Jun涉及 人皮膚成纖維細(xì)胞的感應(yīng)UV照射的Smad7的基因表達(dá)，也與紅斑狼瘡轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。激活 c-jun途徑可能是他克莫司治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的效應(yīng)靶點(diǎn)。
[0058] UBE2J2催化泛素與其他蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，參與蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)泛素化，屬于泛 素結(jié)合酶家族。其在選擇性降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊的膜蛋白等方面起作用。
[0059] CALM3屬于鈣調(diào)蛋白家族，在整個(gè)間期細(xì)胞分布，有絲分裂過程中會(huì)集中在紡錘體 微管。其與CEP97、CEP110、TTN/肌聯(lián)蛋白和SRY等相互作用，與細(xì)胞凋亡、血小板聚集、雌 激素效應(yīng)、腦損傷有關(guān)，可能是SLE易感性的危險(xiǎn)因素。
[0060] SLE是一種復(fù)雜的多基因疾病，并非所有攜帶易感基因的人都會(huì)發(fā)病。除遺傳因素 外，表觀遺傳機(jī)制在SLE的發(fā)病機(jī)制中也起著重要作用。miRNA通過與靶mRNA的3'端不 翻譯區(qū)（3'UTR)不完全互補(bǔ)結(jié)合，阻遏轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，調(diào)控基 因表達(dá)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果中差異基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)，推測(cè)3'UTR長(zhǎng)度的縮短，可能導(dǎo)致一些miRNA 結(jié)合位點(diǎn)的缺失，miRNA的負(fù)調(diào)控作用減弱，從而使一些基因表達(dá)上調(diào)。除了 3'UTR長(zhǎng)度多 態(tài)性在SLE易感基因變異方面的影響，3' UTR可能也通過miRNA以及DNA的甲基化等表觀 遺傳學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與SLE發(fā)病。
[0061] 本發(fā)明通過對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與健康對(duì)照組的外周血單個(gè)核細(xì)胞中3'端非 編碼區(qū)基因長(zhǎng)度多態(tài)性進(jìn)行研究，并檢測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者mRNA差異表達(dá)水平，對(duì)研究 系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)理以及臨床診斷和治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有重要的意義。但由于 系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種復(fù)雜的綜合病征，診斷時(shí)需要考慮多方面的因素，上述分析方法以 及得到的3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因只作為診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的中間結(jié)果，然而雖 為中間結(jié)果，卻有利于探明3'端非編碼區(qū)長(zhǎng)度差異基因 mRNA的表達(dá)水平與系統(tǒng)性紅斑狼 瘡疾病活動(dòng)度及不同臨床病癥之間的關(guān)系，驗(yàn)證各種診斷標(biāo)記物及藥物靶點(diǎn)，并有助于開 發(fā)新型系統(tǒng)性紅斑狼瘡靶向治療藥物。
[0062] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因的分析方法，其特征在于，包括如 下步驟： 對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和健康對(duì)照組分別提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA，得到兩組 測(cè)序樣本； 對(duì)兩組測(cè)序樣本的總RNA分別進(jìn)行質(zhì)檢，若提取的總RNA無污染、完整且無明顯降解， 則進(jìn)行后續(xù)步驟； 利用mRNA的3'端單端特異性對(duì)兩組總RAN進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建mRNAs的3'端非翻譯區(qū)文 庫(kù)； 使用FastQC軟件對(duì)構(gòu)建的3'端非翻譯區(qū)文庫(kù)中堿基的有效reads數(shù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估； 對(duì)于有兩個(gè)或多個(gè)串聯(lián)的polyA位點(diǎn)而且在兩個(gè)樣本中都表達(dá)的基因，使用線性趨勢(shì) 檢測(cè)的方法進(jìn)行APA位點(diǎn)轉(zhuǎn)化事件檢驗(yàn)，獲得加長(zhǎng)的3'端非翻譯區(qū)基因與縮短的3'端非 翻譯區(qū)基因的多態(tài)性散點(diǎn)數(shù)據(jù)； 使用在線DAVID工具進(jìn)行差異基因富集的GO功能分析，選取P值小于0. 1的GO和KEGG pathway的為功能富集結(jié)果，得到系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與健康對(duì)照組的3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度 差異基因。2. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因的分析方法，其 特征在于，所述外周血單個(gè)核細(xì)胞采集自外周靜脈血，所述提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的總RNA 是先使用Ficoll密度梯度離心法從所述外周靜脈血分離出所述外周血單個(gè)核細(xì)胞，然后 使用Trizol法從所述外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取所述總RNA。3. 如權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因的分析方法，其特 征在于，所述對(duì)兩組測(cè)序樣本的總RNA分別進(jìn)行質(zhì)檢是：當(dāng)使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 樣品的完整度，當(dāng)觀察到到28S和18S兩條清晰的條帶時(shí)，表明所述提取的總RNA完整且無 明顯降解；當(dāng)使用紫外分光光度計(jì)測(cè)得0D260/0D280在1. 8~2. 2之間，說明無 DNA或蛋白 質(zhì)污染。4. 如權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因的分析方法，其特 征在于，還包括在構(gòu)建得到mRNAs的3'端非翻譯區(qū)文庫(kù)之后，使用安捷倫2100生物分析儀 檢測(cè)文庫(kù)片段主峰，并檢測(cè)是否存在雜吸收峰，以檢測(cè)構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量的步驟。5. 如權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因的分析方法，其特 征在于，所述使用FastQC軟件對(duì)構(gòu)建的3'端非翻譯區(qū)文庫(kù)中堿基的有效reads數(shù)進(jìn)行質(zhì) 量評(píng)估是檢測(cè)單個(gè)樣品單端測(cè)序有效reads數(shù)是否大于10M，若大于10M，則滿足質(zhì)量要求。6. 如權(quán)利要求5所述的系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因的分析方法，其 特征在于，還包括從得到的所述3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因中選取部分或全部基因，使用 RTQ-PCR技術(shù)驗(yàn)證系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與健康對(duì)照組的3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異情況的步 驟。7. 如權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因的分析方法，其特 征在于，選取的3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因?yàn)镴un、UBE2J2及CALM3。8. -種系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因，其特征在于，通過使用如權(quán)利要 求1~7中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因的分析方法分析得 到。9. 如權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因，其特征在于，所 述3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因?yàn)镴un、UBE2J2及CALM3。10. 如權(quán)利要求8或9所述的系統(tǒng)性紅斑狼瘡3'端非翻譯區(qū)長(zhǎng)度差異基因在制備診斷 系統(tǒng)性紅斑狼瘡檢測(cè)試劑或檢測(cè)裝置中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105986014SQ201510057183
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月2日
【發(fā)明人】眭維國(guó), 戴勇, 鄭燦
【申請(qǐng)人】眭維國(guó), 戴勇