本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種雷公藤原生質(zhì)體的分離及瞬時轉(zhuǎn)化方法，特別涉及一種雷公藤原生質(zhì)體的分離純化方法和外源基因瞬時轉(zhuǎn)化的方法。

背景技術(shù)：

中藥雷公藤為根類藥材，來源于衛(wèi)矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)的根或根的木質(zhì)部，具有清熱解毒、祛風(fēng)通絡(luò)、舒筋活血、消腫止痛、殺蟲止血等功效。雷公藤的主要活性物質(zhì)為生物堿類、二萜類、三萜類、倍半萜類及糖類。具有抗炎、抗腫瘤、免疫抑制等作用，在現(xiàn)代臨床治療中主要應(yīng)用于類風(fēng)濕、抗腫瘤、腎小球疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病。近年來，雷公藤的研究引起了國內(nèi)外生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域?qū)＜业膹V泛關(guān)注，但是對于雷公藤原生質(zhì)體和瞬時轉(zhuǎn)化的研究尚屬空白，在一定程度上限制了雷公藤的功能基因及合成生物學(xué)等方面的深入研究。

原生質(zhì)體是指沒有細(xì)胞壁包被的“裸露”植物細(xì)胞，最外層由一層質(zhì)膜包圍，內(nèi)含細(xì)胞質(zhì)(包括基質(zhì)、細(xì)胞器和后含物等)和細(xì)胞核，具有細(xì)胞全能性，可以再生細(xì)胞壁，進(jìn)行連續(xù)分裂。原生質(zhì)體的應(yīng)用前景非常廣泛，可以用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究、細(xì)胞融合研究、遺傳育種研究以及細(xì)胞膜研究等領(lǐng)域。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種雷公藤原生質(zhì)體的分離方法。

本發(fā)明提供的雷公藤原生質(zhì)體的分離方法包括如下步驟：

1)用酶解液酶解雷公藤愈傷組織懸浮細(xì)胞，得到酶解后的雷公藤懸浮細(xì)胞；

2)收集所述酶解后的雷公藤懸浮細(xì)胞中的沉淀，即得到雷公藤原生質(zhì)體；

所述酶解液包括纖維素酶、果膠酶和離析酶。

上述方法中，

所述纖維素酶、所述果膠酶和所述離析酶的質(zhì)量比為4:1:1。其中，1個酶活力單位是指在特定條件(25℃，其它為最適條件)下，在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶量，或是轉(zhuǎn)化底物中1微摩爾的有關(guān)基團(tuán)的酶量。

上述方法中，

所述酶解液還包括甘露醇。

上述方法中，

所述甘露醇在所述酶解液中的濃度為0.3-0.7mol/L。

上述方法中，

所述酶解液由甘露醇、BSA、MES、CaCl2·2H₂O、纖維素酶、果膠酶、離析酶和水組成；

所述甘露醇在所述酶解液中的濃度為0.6mol/L；

所述BSA在所述酶解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6％；

所述MES在所述酶解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％；

所述CaCl₂·2H₂O在所述酶解液中的濃度為0.05mol/L；

所述纖維素酶在所述酶解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0％；

所述果膠酶在所述酶解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％；

所述離析酶在所述酶解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5％。

上述方法中，

所述收集為離心，所述離心的條件為(17-104)×g離心5min，所述離心的條件具體為67×g離心5min。

上述方法中，

所述酶解的時間為10h。

上述方法中，

所述雷公藤愈傷組織懸浮細(xì)胞來源于雷公藤愈傷組織。

上述方法中，

所述1)和所述2)之間還包括過濾的步驟；所述過濾為用滅菌的300目不銹鋼細(xì)胞篩過濾。

本發(fā)明的第二個目的是提供由上述方法分離得到的原生質(zhì)體。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述原生質(zhì)體的新用途。

本發(fā)明提供了上述原生質(zhì)體在外源基因表達(dá)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種外源基因表達(dá)的方法。

本發(fā)明提供的外源基因表達(dá)的方法包括如下步驟：將外源基因轉(zhuǎn)化上述原生質(zhì)體中，實現(xiàn)外源基因的表達(dá)。

上述方法中，所述外源基因為gfp基因。

本發(fā)明的第五個目的是提供上述酶解液。

上述酶解液在原生質(zhì)體分離中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明提供了一種雷公藤原生質(zhì)體的分離方法。本發(fā)明的雷公藤原生質(zhì)體的分離方法的最佳分離條件是：酶解液配比為2.0％纖維素酶+0.5％果膠酶+0.5％離析酶；甘露醇濃度0.6mol/L，酶解時間10h，67×g轉(zhuǎn)速離心5min。通過實驗證明：用本發(fā)明的方法提取得到的原生質(zhì)體經(jīng)過純化后，原生質(zhì)體產(chǎn)量為4.24×10⁵/g FW，活力為94.5％。本發(fā)明還通過PEG4000介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法成功將外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到本發(fā)明提取的原生質(zhì)體中并順利表達(dá)，成功的建立了雷公藤懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系。本發(fā)明為深入開展雷公藤的功能基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，同時也為雷公藤進(jìn)行基因編輯、亞細(xì)胞定位、基因過表達(dá)和干擾等研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為酶解液配比對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響。圖1A為酶解液配比對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響；圖1B為酶解液配比對原生質(zhì)體活力的影響。

圖2為酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響。圖2A為酶解時間對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響；圖2B為酶解時間對原生質(zhì)體活力的影響。

圖3為甘露醇濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響。圖3A為甘露醇濃度對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響；圖3B為甘露醇濃度對原生質(zhì)體活力的影響。

圖4為處理轉(zhuǎn)速對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響。圖4A為處理轉(zhuǎn)速對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響；圖4B為處理轉(zhuǎn)速對原生質(zhì)體活力的影響。

圖5為原生質(zhì)體形態(tài)。圖5A為可見光下純化后的原生質(zhì)體形態(tài)；圖5B為臺盼藍(lán)染色后無活力的原生質(zhì)體形態(tài)。

圖6為激光共聚焦掃描顯微鏡明場下的原生質(zhì)體及GFP圖片。圖6A為激光共聚焦掃描顯微鏡明場下的原生質(zhì)體；圖6B為激光共聚焦掃描顯微鏡488nm激發(fā)光下原生質(zhì)體的GFP熒光圖片；圖6C為激光共聚焦掃描顯微鏡488nm激發(fā)光下原生質(zhì)體葉綠體自發(fā)熒光圖片；圖6D為激光共聚焦掃描顯微鏡下原生質(zhì)體GFP熒光與自發(fā)熒光疊加圖片。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

下述實施例中所用儀器包括：離心機(SIGMA)、激光共聚焦掃描顯微鏡(VisiTech)、超凈工作臺、顯微鏡、恒溫培養(yǎng)振蕩器，循環(huán)水式多用真空泵、電子天平、高溫高壓滅菌鍋。

下述實施例中的W5溶液為0.125mol/L CaCl₂、0.154mol/L NaCl、5mmol/L KCl、2mmol/L MES，KOH調(diào)至pH5.6，高溫高壓滅菌。

下述實施例中的MMG溶液為15mmol/L MgCl₂、0.1％MES、0.4mol/L甘露醇，KOH調(diào)至pH5.6，高溫高壓滅菌。

下述實施例中的PEG溶液為40％PEG4000、0.2mol/L甘露醇、0.1mol/L CaCl₂(現(xiàn)配現(xiàn)用，最多可于4℃保存五天)。

下述實施例中的WI溶液為0.5mol/L甘露醇、4mmol/L MES、20mmol/L KCl，KOH調(diào)至pH5.6，高溫高壓滅菌。

下述實施例中的試劑的購買處和產(chǎn)品目錄號如下：纖維素酶(R-10，YAKULT，150703-02)，果膠酶(Y-23，YAKULT)，離析酶(R-10，YAKULT)，甘露醇(D-Mannitol，Solarbio，1126F034)，牛血清白蛋白(BSA，Roche)，嗎啉乙磺酸(MES，賽克林，C10035338)，二水合氯化鈣(CaCl₂·2H₂O，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20130130)，聚乙二醇(PEG4000，Solarbio，1226B034)，氯化鈉(NaCl，北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司，20140301)，氯化鉀(KCl，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20120925)，磷酸鹽緩沖液(PBS，gibco，1760235)，臺盼藍(lán)染液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，5BR00130)。

實施例1、一種雷公藤懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體的分離純化方法及其活性檢測

一、雷公藤懸浮細(xì)胞的制備

雷公藤懸浮細(xì)胞來源于愈傷組織，具有大量的細(xì)胞間隙，細(xì)胞壁易被酶解，具有生長速度快、次生代謝物積累迅速等優(yōu)點，是制備原生質(zhì)體的理想材料。具體制備方法如下：

1、愈傷組織的獲得

將雷公藤幼嫩枝條滅菌處理，扦插培育出無菌苗，再取無菌苗的新生葉，切成0.5cm×0.5cm左右小塊，接種在含0.5mg/L 2,4-D(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，DH101-1)的MS瓊脂培養(yǎng)基(Caisson Labs，MSP22-50LT)上，25℃，暗培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織。

2、愈傷組織的繼代培養(yǎng)

選取白色有光澤、質(zhì)地疏松、長勢良好的愈傷組織于0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，DH135-2)+0.5mg/L IBA(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，II172)的MS瓊脂培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，25℃，暗培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)3代以上，選取生長良好、質(zhì)地疏松、生長情況一致或相似的愈傷組織，用鑷子夾成小塊，壓碎，以每瓶1.0g的愈傷組織量轉(zhuǎn)接入含100mL 0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L KT+0.5mg/L IBA的MS液體培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，放于搖床上，25℃，黑暗，120rpm懸浮培養(yǎng)，20天繼代一次，獲得雷公藤懸浮細(xì)胞。

二、原生質(zhì)體的分離及其活性檢測

選取繼代培養(yǎng)10-12天的雷公藤懸浮細(xì)胞作為原生質(zhì)體提取材料。采取不同的酶解液配比、甘露醇濃度、酶解時間及處理轉(zhuǎn)速分離雷公藤原生質(zhì)體并檢測原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力，選出最優(yōu)處理條件參數(shù)。具體步驟如下：

1、酶解液配比對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

(1)酶解液的配制：將甘露醇、BSA、MES、CaCl₂·2H₂O、纖維素酶、果膠酶、離析酶和超純水混勻，溶質(zhì)及其濃度為：0.5mol/L甘露醇、0.6％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA、0.1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))MES、0.05mol/L CaCl₂·2H₂O，KOH調(diào)至pH5.6，得到酶解液，根據(jù)酶解液中的纖維素酶、果膠酶、離析酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不同，將酶解液分為如下5組：

1組：1.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))纖維素酶+0.3％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))果膠酶+0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))離析酶；

2組：2.0％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))纖維素酶+0.3％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))果膠酶+0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))離析酶；

3組：2.0％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))纖維素酶+0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))果膠酶+0.5％離析酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；

4組：2.0％纖維素酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù))+0.7％果膠酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù))+0.5％離析酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；

5組：2.5％纖維素酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù))+0.3％果膠酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù))+0.5％離析酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；

將上述5組不同的酶解液分別在55℃水浴鍋中活化10min，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，待下一步試驗使用。

(2)原生質(zhì)體的分離

取0.5g雷公藤懸浮細(xì)胞，吸干培養(yǎng)基，盡量壓碎，按照10mL/g的量分別加入步驟(1)中5組酶解液中酶解，25℃，50rpm黑暗振搖酶解12h；用滴管抽吸懸浮細(xì)胞混懸液數(shù)次，以促進(jìn)原生質(zhì)體的釋放；用滅過菌的300目不銹鋼細(xì)胞篩過濾，得到濾液；濾液在67×g條件下離心5分鐘，棄上清，收集原生質(zhì)體。

(3)原生質(zhì)體的純化

向步驟(2)中分離得到的原生質(zhì)體中加入5ml W5溶液，重懸清洗原生質(zhì)體，離心5分鐘，棄上清，再分別用5ml、2ml的W5溶液各洗滌一次。棄去上清液，加入1ml MMG溶液重懸，即可獲得純化的原生質(zhì)體。

(4)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力檢測

原生質(zhì)體的產(chǎn)量的檢測方法為：用MMG溶液將步驟(3)獲得的純化的原生質(zhì)體稀釋5倍，將稀釋的原生質(zhì)體懸浮液滴在血球計數(shù)板上。待原生質(zhì)體將計數(shù)室充滿，在顯微鏡下觀察并計數(shù)(四個大格中的原生質(zhì)體數(shù)目)。每個樣品重復(fù)計數(shù)三次。

每克雷公藤懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體產(chǎn)量(個/g FW)計算公式：{原生質(zhì)體總個數(shù)/(4×材料質(zhì)量)}×稀釋倍數(shù)×10⁴。

原生質(zhì)體的活力的檢測方法(采用臺盼藍(lán)染色法)：用MMG溶液將步驟(3)獲得的純化的原生質(zhì)體稀釋5倍，將配好的臺盼藍(lán)染液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，5BR00130)，按體積比1：10加入到稀釋后的原生質(zhì)體懸浮液中染色，選取4個有代表性的視野進(jìn)行統(tǒng)計。原生質(zhì)體活力的計算方法為：未被臺盼藍(lán)染色的原生質(zhì)體占該視野下原生質(zhì)體總數(shù)的百分比。

將得到的原生質(zhì)體進(jìn)行產(chǎn)量和活力檢測，結(jié)果如圖1A和圖1B。比較1、2、5組，三組的纖維素酶濃度依次增加，其中第二組的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力最高，分別可以達(dá)到1.86×10⁵/g FW和67.8％。纖維素酶濃度過低不能充分解離細(xì)胞壁，而纖維素濃度過高則會使細(xì)胞膜破裂，影響原生質(zhì)體活性，故纖維素的最佳濃度為2.0％；比較2、3、4組，三組的果膠酶濃度依次增加，結(jié)果顯示第四組產(chǎn)量和活力最高，分別可以達(dá)到3.08×10⁵/g FW和80.15％，與其他組存在顯著性差異，故果膠酶的最佳濃度為0.5％。綜上，雷公藤懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體分離的最佳酶液配比為2.0％纖維素酶+0.5％果膠酶+0.5％離析酶。

2、酶解時間比對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

(1)酶解液的配制：將甘露醇、BSA、MES、CaCl₂·2H₂O、纖維素酶、果膠酶、離析酶和超純水混勻，溶質(zhì)及其濃度分別為：0.5mol/L甘露醇、0.6％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA、0.1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))MES、0.05mol/L CaCl₂·2H₂O、2.0％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))纖維素酶、0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))果膠酶、0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))離析酶，KOH調(diào)至pH5.6，得到酶解液。將上述酶解液在55℃水浴鍋中活化10min，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，待下一步試驗使用。

(2)原生質(zhì)體的分離

取0.5g雷公藤懸浮細(xì)胞，吸干培養(yǎng)基，盡量壓碎，按照10mL/g的量分別加入步驟(1)中的酶解液中酶解，25℃，50rpm黑暗振搖分別酶解6h、8h、10h、12h、14h和16h；用滴管抽吸懸浮細(xì)胞混懸液數(shù)次，以促進(jìn)原生質(zhì)體的釋放；用滅過菌的300目不銹鋼細(xì)胞篩過濾，得到濾液；濾液在67×g條件下離心5分鐘，棄上清，分別收集原生質(zhì)體。

(3)原生質(zhì)體的純化

分別向步驟(2)中分離得到的原生質(zhì)體中加入5ml W5溶液，重懸清洗原生質(zhì)體，離心5分鐘，棄上清，再分別用5ml、2ml的W5溶液各洗滌一次。棄去上清液，加入1ml MMG溶液重懸，即可獲得純化的原生質(zhì)體。

(4)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力檢測

檢測方法同步驟1中的(4)。

將得到的原生質(zhì)體進(jìn)行產(chǎn)量和活力檢測，結(jié)果見圖2A和圖2B。從圖中可以看出：隨酶解時間的增加，原生質(zhì)體的產(chǎn)量隨之提高，但原生質(zhì)體的活力在10h時最高，達(dá)82.2％。酶解時間過短不能使原生質(zhì)體完全分離出來，提取效率低，而酶解時間過長，細(xì)胞壓力過大，容易破碎，鏡下檢測死細(xì)胞和碎片增多，活細(xì)胞所占比例小，不利于后續(xù)實驗的開展。因此，10h為雷公藤能懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體的最佳酶解時間。

3、甘露醇濃度比對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

(1)酶解液的配制：將甘露醇、BSA、MES、CaCl₂·2H₂O、纖維素酶、果膠酶、離析酶和超純水混勻，溶質(zhì)及其濃度分別為：0.6％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA、0.1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))MES、0.05mol/L CaCl₂·2H₂O、2.0％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))纖維素酶、0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))果膠酶、0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))離析酶，KOH調(diào)至pH5.6，得到酶解液，根據(jù)酶解液中甘露醇濃度的不同分為如下5組：

1組：0.3mol/L甘露醇；

2組：0.4mol/L甘露醇；

3組：0.5mol/L甘露醇；

4組：0.5mol/L甘露醇；

5組：0.7mol/L甘露醇；

將上述酶解液分別在55℃水浴鍋中活化10min，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，待下一步試驗使用。

(2)原生質(zhì)體的分離

取0.5g雷公藤懸浮細(xì)胞，吸干培養(yǎng)基，盡量壓碎，按照10mL/g的量分別加入步驟(1)中5組酶解液中酶解，25℃，50rpm黑暗振搖酶解12h；用滴管抽吸懸浮細(xì)胞混懸液數(shù)次，以促進(jìn)原生質(zhì)體的釋放；用滅過菌的300目不銹鋼細(xì)胞篩過濾，得到濾液；濾液在67×g條件下離心5分鐘，棄上清，收集原生質(zhì)體。

(3)原生質(zhì)體的純化

向步驟(2)中分離得到的原生質(zhì)體中加入5ml W5溶液，重懸清洗原生質(zhì)體，離心5分鐘，棄上清，再分別用5ml、2ml的W5溶液各洗滌一次。棄去上清液，加入1ml MMG溶液重懸，即可獲得純化的原生質(zhì)體。

(4)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力檢測

檢測方法同步驟1中的(4)。

將得到的原生質(zhì)體進(jìn)行產(chǎn)量和活力檢測，結(jié)果見3A和圖3B。由圖可見，當(dāng)甘露醇濃度為0.5mol/L時原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，而此時活力卻不是最高的，當(dāng)甘露醇濃度為0.6mol/L時雖然產(chǎn)量比0.5mol/L稍低，但此時原生質(zhì)體活力最高。溶液滲透壓低于原生質(zhì)體的滲透壓會導(dǎo)致細(xì)胞脹破死亡；當(dāng)甘露醇濃度過高時原生質(zhì)體失水皺縮，且不利于原生質(zhì)體的釋放。雖然0.5mol/L與0.6mol/L兩個處理組中存活的原生質(zhì)體總數(shù)相近，但由于具存活的原生質(zhì)體才能進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)化，相較而言，甘露醇濃度為0.6mol/L是更有利于下一步實驗的開展。所以，分離原生質(zhì)體的最佳甘露醇濃度為0.6mol/L。

4、處理轉(zhuǎn)速對原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響

(1)酶解液的配制：將甘露醇、BSA、MES、CaCl₂·2H₂O、纖維素酶、果膠酶、離析酶和超純水混勻，溶質(zhì)及其濃度分別為：0.5mol/L甘露醇、0.6％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA、0.1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))MES、0.05mol/L CaCl₂·2H₂O、2.0％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))纖維素酶、0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))果膠酶、0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))離析酶，KOH調(diào)至pH5.6，得到酶解液。將上述酶解液在55℃水浴鍋中活化10min，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，待下一步試驗使用。

(2)原生質(zhì)體的分離

取0.5g雷公藤懸浮細(xì)胞，吸干培養(yǎng)基，盡量壓碎，按照10mL/g的量分別加入步驟(1)中的酶解液中酶解，25℃，50rpm黑暗振搖酶解12h；用滴管抽吸懸浮細(xì)胞混懸液數(shù)次，以促進(jìn)原生質(zhì)體的釋放；用滅過菌的300目不銹鋼細(xì)胞篩過濾，得到濾液；將濾液在不同處理轉(zhuǎn)速：17×g、37×g、67×g、104×g條件下離心5分鐘，棄上清，分別收集原生質(zhì)體。

(3)原生質(zhì)體的純化

分別向步驟(2)中分離得到的原生質(zhì)體中加入5ml W5溶液，重懸清洗原生質(zhì)體，離心5分鐘，棄上清，再分別用5ml、2ml的W5溶液各洗滌一次。棄去上清液，加入1ml MMG溶液重懸，即可獲得純化的原生質(zhì)體。

(4)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力檢測

檢測方法同步驟1中的(4)。

將得到的原生質(zhì)體進(jìn)行產(chǎn)量和活力檢測，結(jié)果見圖4A和圖4B。比較四組數(shù)據(jù)，當(dāng)轉(zhuǎn)速為67×g時產(chǎn)量可以達(dá)到2.17×10⁵g/FW；活力最高可達(dá)78.4％，產(chǎn)量和活力均為最高水平。當(dāng)轉(zhuǎn)速過低時不利于原生質(zhì)體的沉降，碎片和原生質(zhì)體不能得到有效分離；當(dāng)轉(zhuǎn)速過高時，會對原生質(zhì)體造成機械損傷，同樣不利于原生質(zhì)體的分離純化。綜上，分離純化原生質(zhì)體的最佳轉(zhuǎn)速為67×g。

三、原生質(zhì)體分離純化方法的有效性驗證

1、酶解液的配制：將甘露醇、BSA、MES、CaCl₂·2H₂O、纖維素酶、果膠酶、離析酶和超純水混勻，溶質(zhì)及其濃度分別為：0.6mol/L甘露醇、0.6％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA、0.1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))MES、0.05mol/L CaCl₂·2H₂O、2.0％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))纖維素酶、0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))果膠酶、0.5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))離析酶，KOH調(diào)至pH5.6，得到酶解液。將上述酶解液在55℃水浴鍋中活化10min，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，待下一步試驗使用。

2、原生質(zhì)體的分離

取0.5g雷公藤懸浮細(xì)胞，吸干培養(yǎng)基，盡量壓碎，按照10mL/g的量加入步驟1中的酶解液中酶解，25℃，50rpm黑暗振搖酶解10h；用滴管抽吸懸浮細(xì)胞混懸液數(shù)次，以促進(jìn)原生質(zhì)體的釋放；用滅過菌的300目不銹鋼細(xì)胞篩過濾，得到濾液；濾液在67×g條件下離心5分鐘，棄上清，收集原生質(zhì)體。

3、原生質(zhì)體的純化

向步驟2中分離得到的原生質(zhì)體中加入5ml W5溶液，重懸清洗原生質(zhì)體，離心5分鐘，棄上清，再分別用5ml、2ml的W5溶液各洗滌一次。棄去上清液，加入1ml MMG溶液重懸，即可獲得純化的原生質(zhì)體。

4、原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力檢測

檢測方法同步驟二的1中的(4)。

獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量高達(dá)4.24×10⁵/g FW，活力可達(dá)94.5％，原生質(zhì)體形態(tài)及臺盼藍(lán)染色后的原生質(zhì)體形態(tài)見圖5A和圖5B。

實施例2、雷公藤懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體在外源基因瞬時轉(zhuǎn)化表達(dá)中的應(yīng)用

利用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法對雷公藤懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體的瞬時轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究，具體步驟如下：

1、將實施例一的步驟三中獲得的純化的原生質(zhì)體的濃度調(diào)到約為5×10⁵個/mL，得到原生質(zhì)體溶液；

2、將200μl的原生質(zhì)體溶液、20μg的E3025質(zhì)粒(E3025質(zhì)粒自帶GFP編碼序列，E3025質(zhì)粒的核苷酸序列如序列1所示)和220μL PEG溶液輕敲混勻，得到轉(zhuǎn)化混合物，在黑暗條件下誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化混合物20min，得到轉(zhuǎn)化混合液；

3、室溫下用880μL W5溶液稀釋轉(zhuǎn)化混合液，然后輕柔顛倒搖動離心管使之混合完好以終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。67×g離心2min，收集沉淀，去上清；

4、用W5溶液重復(fù)清洗步驟3收集的沉淀一次，收集沉淀，去上清；

5、用1mL WI溶液輕柔重懸步驟4收集的沉淀于多孔組織培養(yǎng)皿中，25℃黑暗靜置培養(yǎng)。

6、18h后取出，67×g離心2min，去掉部分上清，對其進(jìn)行濃縮，取適量制片，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況。

結(jié)果如圖6A、圖6B、圖6C和圖6D。由于原生質(zhì)體來源于黑暗培養(yǎng)的雷公藤懸浮細(xì)胞，因此其細(xì)胞中不含葉綠素，激光共聚焦掃描顯微鏡488nm激發(fā)光下只能觀察到GFP綠色熒光，證明編碼GFP的E3025質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到原生質(zhì)體中，并順利表達(dá)，雷公藤懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系成功建立。

序列表

<110>首都醫(yī)科大學(xué)

<120>一種雷公藤原生質(zhì)體的分離及瞬時轉(zhuǎn)化方法

<160>1

<210>1

<211>4612bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccac ccataatacc cataatagct 420

gtttgccaac cggtcaacat gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag 480

atacagtctc agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa 540

acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg 600

aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct 660

ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 720

acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca 780

cacttgtcta ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga 840

cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 900

actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat cattgcgata 960

aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 1020

ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 1080

gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc 1140

cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac gtcgagagtt ctcaacacaa 1200

catatacaaa acaaacgaat ctcaagcaat caagcattct acttctattg cagcaattta 1260

aatcatttct tttaaagcaa aagcaatttt ctgaaaattt tcaccattta cgaacgatag 1320

ccatggtccg gactcagatc tcgagctcaa gcttcgaatt ctgcagtcga cggtaccgcg 1380

ggcccgggat ggtagatctg actagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa 1440

ttcttgttga attagatggt gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg 1500

aaggtgatgc aacatacgga aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac 1560

ctgttccgtg gccaacactt gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcaagat 1620

acccagatca tatgaagcgg cacgacttct tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc 1680

aggagaggac catcttcttc aaggacgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt 1740

ttgagggaga caccctcgtc aacaggatcg agcttaaggg aatcgatttc aaggaggacg 1800

gaaacatcct cggccacaag ttggaataca actacaactc ccacaacgta tacatcatgg 1860

ccgacaagca aaagaacggc atcaaagcca acttcaagac ccgccacaac atcgaagacg 1920

gcggcgtgca actcgctgat cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc 1980

ttttaccaga caaccattac ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa 2040

agagagacca catggtcctt cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg 2100

atgaactata caaagctagc cactaatcta gagtccgcaa aaatcaccag tctctctcta 2160

caaatctatc tctctctatt tttctccaga ataatgtgtg agtagttccc agataaggga 2220

attagggttc ttatagggtt tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta 2280

tttgtatttg taaaatactt ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt 2340

gacgcggccg cacccataat acccataata gctgtttgcc agtaatcatg gtcatagctg 2400

tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata 2460

aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca 2520

ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc 2580

gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 2640

cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 2700

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 2760

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 2820

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 2880

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 2940

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt 3000

aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 3060

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 3120

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 3180

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 3240

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 3300

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 3360

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 3420

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 3480

tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact 3540

tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 3600

cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta 3660

ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta 3720

tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc 3780

gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat 3840

agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 3900

atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg 3960

tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca 4020

gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta 4080

agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg 4140

cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 4200

ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg 4260

ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt 4320

actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga 4380

ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc 4440

atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 4500

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt 4560

attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 4612