一組用于三陰性乳腺癌預(yù)后的基因及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組用于三陰性乳腺癌預(yù)后的基因及其應(yīng)用，該組基因包括：基因GSTM1、BAG1、CD68、HDGFRP3、MAOB和TMEFF2。該組基因的應(yīng)用包括：用于三陰性乳腺癌預(yù)后的多重平行檢測(cè)液相基因芯片、用于三陰性乳腺癌預(yù)后的試劑盒和用于三陰性乳腺癌預(yù)后的基因的評(píng)價(jià)系統(tǒng)等。本發(fā)明能對(duì)中國人群的早期三陰性乳腺癌患者在手術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)和不復(fù)發(fā)的情況進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)后和分類，有效及時(shí)地指導(dǎo)臨床用藥。
【專利說明】
一組用于三陰性乳腺癌預(yù)后的基因及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種基因及其應(yīng)用，特別是涉及一組用于早期三陰性乳腺癌預(yù)后的基 因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是全球女性最為常見的惡性腫瘤和死亡原因。隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活 方式的改變，國內(nèi)特別是發(fā)達(dá)城市的乳腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出快速上升趨勢(shì)（以每年5%的 速度上升），年新發(fā)病人數(shù)接近18萬。在上海等特大城市，乳腺癌已經(jīng)躍居女性惡性腫瘤發(fā) 病率之首。由于目前民眾篩查意識(shí)的提高以及診療水平的提高，乳腺癌的死亡率隨之下降， 早期乳腺癌的5年存活率高達(dá)90%。
[0003] 三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受體ER、孕激 素受體PR和人表皮生長(zhǎng)因子受體（HER2)均為陰性的一種特殊類型乳腺癌，約占所有乳腺 癌的15-20%。根據(jù)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2008年可手術(shù)乳腺癌病例的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，TNBC約 占所有乳腺癌的18%。根據(jù)已有針對(duì)TNBC的研究顯示，激素受體陰性的乳腺癌分化較差， 組織學(xué)分級(jí)較高，容易復(fù)發(fā)且總生存率較低，對(duì)內(nèi)分泌藥物治療不敏感是TNBC乳腺癌的主 要臨床表現(xiàn)。TNBC不僅具有侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差的臨床特點(diǎn)，而且因缺少激素受體無法接受內(nèi) 分泌治療，缺乏HER-2基因位點(diǎn)而無法接受生物靶向治療，同時(shí)目前免疫組化條件下無法 再對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)分，同時(shí)對(duì)于三陰性乳腺癌，目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，成為了乳 腺癌治療的難點(diǎn)，其中一部分早期三陰性乳腺癌患者容易出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)、早期轉(zhuǎn)移以及容 易出現(xiàn)比較嚴(yán)重的肺、肝等重要臟器的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。根據(jù)目前的乳腺癌的共識(shí)，TNBC乳腺癌 的治療主要以化療為主。
[0004] 目前的最新的研究認(rèn)為三陰性乳腺癌可能是一大類乳腺癌的雜項(xiàng)，具有高度異質(zhì) 性，其預(yù)后差異性很大，傳統(tǒng)的病理臨床指標(biāo)尚無法區(qū)分出三陰性乳腺癌的預(yù)后。高通量的 全轉(zhuǎn)錄組基因芯片又因?yàn)槠鋬r(jià)格的昂貴，信息量的巨大，無法運(yùn)用到實(shí)際的臨床中。國外尚 沒有針對(duì)三陰性乳腺癌的芯片表達(dá)譜。同時(shí)由于目前回顧性研究中，用于芯片表達(dá)譜研究 的新鮮凍存標(biāo)本非常稀有，很難對(duì)于已經(jīng)具有完整隨訪信息的病例進(jìn)行研究。
[0005] 另外，目前美國已經(jīng)上市的Oncotype DX針對(duì)的是雌激素受體陽性的乳腺癌，根 據(jù)不同的打分標(biāo)準(zhǔn)可以為雌激素受體陽性的乳腺癌判斷預(yù)后以進(jìn)一步指導(dǎo)用藥。但是 Oncotype DX使用的是比較復(fù)雜的RT-PCR的技術(shù)，需要提取RNA，反轉(zhuǎn)錄的過程比較復(fù)雜， 會(huì)減少其效率，所以對(duì)三陰性患者并不適用。而Mammaprint有70個(gè)基因可以將患者分為 高危和低危風(fēng)險(xiǎn)組，對(duì)于乳腺癌重要的分子分型沒有限制。由于其存在過多的未知功能的 基因，在分析效率和實(shí)際運(yùn)用都有很大的限制，廣泛推廣運(yùn)用限制較大。而且Mammaprint 需要的樣本在臨床上獲取較難，需要新鮮凍存的標(biāo)本，進(jìn)一步限制了臨床運(yùn)用。
[0006] 因此，急需開發(fā)一種更加實(shí)用、簡(jiǎn)便且快速的用于檢測(cè)三陰性乳腺癌預(yù)后的基因 的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一組用于三陰性乳腺癌預(yù)后的基因及其應(yīng)用。本 發(fā)明針對(duì)的是乳腺癌治療中的難點(diǎn)即三陰性乳腺癌，尤其是針對(duì)于臨床病理提示早期的三 陰性乳腺癌，通過對(duì)于定制芯片的多重平行定量檢測(cè)技術(shù)，可對(duì)mRNA進(jìn)行多重平行定量研 究，并且所運(yùn)用的標(biāo)本可為病理科廣泛存在的石蠟切片，因此，本發(fā)明更具有臨床實(shí)用性、 高效、靈敏、易操作、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的第一方面，提供一組用于三陰性乳腺癌（包括早 期三陰性乳腺癌）預(yù)后的基因，其包括：基因 GSTM1、BAG1、CD68、HDGFRP3、ΜΑ0Β和TMEFF2。 該基因的組合能對(duì)中國人群的早期三陰性乳腺癌患者在手術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)和不復(fù)發(fā)的情 況進(jìn)行預(yù)后和分類，以便及時(shí)地進(jìn)行干預(yù)，有效指導(dǎo)臨床治療。
[0009] 因此，針對(duì)本發(fā)明的基因組，可提供一系列的應(yīng)用，如包括：以下的用于三陰性乳 腺癌預(yù)后的多重平行檢測(cè)液相基因芯片、用于三陰性乳腺癌預(yù)后的試劑盒和用于三陰性乳 腺癌預(yù)后的基因的評(píng)價(jià)系統(tǒng)等。另外，需要說明的是，本發(fā)明中所述的早期三陰性乳腺癌是 指早期三陰性乳腺癌（Τ^Ν。^)。
[0010] 本發(fā)明的第二方面，提供一種用于三陰性乳腺癌（包括早期三陰性乳腺癌）預(yù)后 的多重平行檢測(cè)（如多重平行定量檢測(cè)）液相基因芯片（該芯片是針對(duì)上述基因組進(jìn)行檢 測(cè)的，以便檢測(cè)基因 GSTM1、BAG1、CD68、HDGFRP3、ΜΑ0Β和TMEFF2)，包括探針；其中，所述探 針包括下列三組核苷酸序列之一：
[0011] (l)SEQ ID NO. 1 ~SEQ ID Ν0. 12 所示序列；
[0012] (2) SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 12所示序列中的每條序列的互補(bǔ)鏈；
[0013] (3)與SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 12所示的序列中的每條序列有至少70 %同源 性的序列。
[0014] 所述芯片還包括：SEQ ID N0. 13~SEQ ID N0. 16所示序列的探針。
[0015] 本發(fā)明的第三方面，提供一種用于三陰性乳腺癌（包括早期三陰性乳腺癌）預(yù)后 的試劑盒，包括下列三組核苷酸序列之一的探針：
[0016] (l)SEQ ID NO. 1 ~SEQ ID N0. 12 所示序列；
[0017] (2) SEQ ID Ν0· 1~SEQ ID Ν0· 12所示序列中的每條序列的互補(bǔ)鏈；
[0018] (3)與SEQ ID Ν0· 1~SEQ ID Ν0· 12所示的序列中的每條序列有至少70 %同源 性的序列。
[0019] 所述試劑盒還包括：SEQ ID N0. 13~SEQ ID N0. 16所示序列的探針。
[0020] 另外，該試劑盒還可包括用于檢測(cè)基因 GSTM1、BAG1、CD68、HDGFRP3、ΜΑ0Β和 TMEFF2 的其他相應(yīng)試劑，如 Proteinase K、Lysis Mixture 等。
[0021] 本發(fā)明的第四方面，提供一種用于三陰性乳腺癌（包括早期三陰性乳腺癌）預(yù)后 的基因的評(píng)價(jià)系統(tǒng)，包括：復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值模塊和評(píng)價(jià)模塊；
[0022] 所述復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值模塊，用于獲得復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值，其中，該復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值是將上述基因芯 片測(cè)得的樣本的基因 GSTM1、BAG1、CD68、HDGFRP3、ΜΑ0Β和TMEFF2的各自mRNA值與其在 Cox回歸中的效果估計(jì)值相乘而得到的值；
[0023] 所述評(píng)價(jià)模塊，用于將復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值模塊中獲得的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值，通過受試者工作特 征曲線（R0C)的最佳的臨界值（cutoff)，能將樣本分為預(yù)后好和預(yù)后差兩組。
[0024] 優(yōu)選地，所述復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值的計(jì)算公式可如下：
[0025] FFPE_SC0RE = -0· 1636*GSTMl+0. 5272*BAG1+1. 6144*CD68-4· 4979*HDGFRP3-2. 13 37*MA0 B-3. 6536*TMEFF2
[0026] 其中，公式中的GSTM1表示利用上述基因芯片檢測(cè)得到的GSTM1基因的mRNA值；
[0027] BAG1表示利用上述基因芯片檢測(cè)得到的BAG1基因的mRNA值；
[0028] ⑶68表示利用上述基因芯片檢測(cè)得到的⑶68基因的mRNA值；
[0029] HDGFRP3表示利用上述基因芯片檢測(cè)得到的HDGFRP3基因的mRNA值；
[0030] ΜΑ0Β表示利用上述上述基因芯片檢測(cè)得到的ΜΑ0Β基因的mRNA值；
[0031] TMEFF2表示利用上述基因芯片檢測(cè)得到的TMEFF2基因的mRNA值。
[0032] 對(duì)于上述基因組，是經(jīng)以下的研究而獲得的：
[0033] 通過對(duì)復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2006年到2008年的乳腺癌標(biāo)本入手，在全基因表 達(dá)譜水平及公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選，從前期初步篩選得到的分子標(biāo)志基因與前期工作整合的 乳腺癌預(yù)后相關(guān)基因群，這些分子標(biāo)志基因的功能涉及生長(zhǎng)和增殖、細(xì)胞外基質(zhì)形成、趨化 因子受體、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及DNA修復(fù)等多個(gè)重要生物學(xué)過程。對(duì)三陰性乳腺癌的石蠟 標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，篩選出預(yù)后表達(dá)差異基因群。同時(shí)根據(jù)三陰性標(biāo)本預(yù)后好壞的標(biāo)本信息篩 選出如下基因在三陰性早期乳腺癌中具有預(yù)后價(jià)值，臨床意義如下：
[0034] 基因 GSTM1 :位于第1號(hào)染色體上，編碼人類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GSTM1_HUMAN蛋 白。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜結(jié)合的形式是由兩個(gè)不同的超基因家族編碼。參 與胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、激素的合成、細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)，并在癌癥化學(xué)治療保護(hù)和藥物抗 性中發(fā)揮重要功能。另外，其多態(tài)性還與疾病易感性相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，GSTM1在小葉原位癌 中表達(dá)較多。
[0035] 基因 BAG1 :位于第9號(hào)染色體上，可以編碼BAG家族分子伴侶調(diào)節(jié)器1，BAG1是一 種已經(jīng)被確認(rèn)的多功能結(jié)合蛋白，它具有與BCL-2形成復(fù)合物，而促進(jìn)抗細(xì)胞凋亡的能力。 但是BAG1并不屬于BCL-2家族。BAG1可以與多種激素受體相結(jié)合，從而調(diào)整它們的功能。 在乳腺組織中BAG-1的陽性表達(dá)量要高出乳腺良性腫瘤和正常乳腺組織。可以作為乳腺組 織癌變的早期診斷指標(biāo)。
[0036] 基因⑶68 :位于第17號(hào)染色體上，（白細(xì)胞分化抗原68)是一種糖蛋白結(jié)合的低 密度脂蛋白。在組織巨噬細(xì)胞的吞噬活動(dòng)中發(fā)揮作用，在細(xì)胞內(nèi)的溶酶體代謝和細(xì)胞外的 細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與病原菌的相互作用。結(jié)合組織和器官的特異性凝集素或選擇，使巨 噬細(xì)胞亞群歸巢到特定的位點(diǎn)。
[0037] 基因 HDGFRP3 :位于第15號(hào)染色體上，是編碼HDGR3_HUMAN蛋白的基因，是肝癌生 長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白3,腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)中出現(xiàn)上調(diào)，在多種組織中存在著表達(dá)。這個(gè)基 因可以增強(qiáng)DNA合成，可以在細(xì)胞增殖中起到作用。
[0038] 基因 ΜΑ0Β:單胺氧化酶B基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于黃素胺氧化酶家族。它 是一種酶，位于線粒體外膜。它催化的氧化脫氨的生物和異胺和神經(jīng)活性和血管活性胺在 中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織的代謝中起著重要的作用。
[0039] 基因 TMEFF2 (transmembrance protein with EGF-1 ike and two follistatin-like domains):其編碼了一種tomoregulin-2的蛋白質(zhì)，是一類與神經(jīng)發(fā) 育相關(guān)的基因，于1999年首次被克隆。TMEFF2中的表皮生長(zhǎng)因子（EGF)樣功能域和EGF/ Neuregulin家族生長(zhǎng)因子具有較高的同源性。TMEFF2表達(dá)的受到雄激素的調(diào)控，并且被 c-Myc蛋白抑制，可能具有抑癌基因的功能。
[0040] 本發(fā)明中，使用的多重平行定量檢測(cè)技術(shù)，是一種三明治結(jié)構(gòu)的核酸雜交方法，該 方法米用bDNA分子放大捕獲的目標(biāo)RNA信號(hào)。它可以分析各種樣本（組織、細(xì)胞、血液、 FFPE樣本、純化的RNA或DNA等），只需用特定裂解液裂解樣本即可，對(duì)樣本量下限無要求， 特別適合需要對(duì)微量樣本做多基因定量的研究實(shí)驗(yàn)。它融合轉(zhuǎn)錄本和DNA拷貝數(shù)變異無需 核酸的抽提純化，無需PCR，僅通過與探針的雜交和信號(hào)放大，即可進(jìn)行基因定量，避免了很 多人為因素的干擾，可以快速得到準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。適用于保存多年的石蠟切片樣本。
[0041] 本發(fā)明用于三陰性乳腺癌預(yù)后的基因，通過分子雜交，擴(kuò)增放大的手段進(jìn)行多重 平行檢測(cè)，對(duì)回顧性三陰性乳腺癌組織樣本中基因的表達(dá)改變狀況進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)中國 人群的早期三陰性乳腺癌患者在手術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)和不復(fù)發(fā)的情況進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)后和分類， 有效及時(shí)地指導(dǎo)臨床用藥。
【附圖說明】
[0042] 下面結(jié)合附圖與【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明：
[0043] 圖1是訓(xùn)練集的聚類分析圖；
[0044] 圖2是驗(yàn)證集的聚類分析圖；
[0045] 圖3是訓(xùn)練集的曲線下面積（AUC)-受試者工作特征曲線（ROC)，AUC = 0. 818 (95% 的可信區(qū)間為 0. 659-0. 977);
[0046] 圖4是訓(xùn)練集的曲線下面積（AUC)-受試者工作特征曲線（ROC)，AUC = 0· 974(95%的可信區(qū)間為 0· 615-0. 974);
[0047] 圖5是訓(xùn)練集的Kaplan-Meier生存曲線，其中，P值=0· 003 ;
[0048] 圖6是驗(yàn)證集的Kaplan-Meier生存曲線，其中，P值=0.020。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 本實(shí)施例以中國乳腺癌人群為研究對(duì)象，以乳腺癌病理組織為樣本，以多重平行 檢測(cè)液相基因芯片工具，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
[0050] 其中，以下試驗(yàn)中所用的試劑如未特別說明，則為商業(yè)化試劑。
[0051] 另外，所有的乳腺癌組織標(biāo)本均來自復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科所收治的可 手術(shù)乳腺癌患者的標(biāo)本，病理分期為?\ 2N。i的早期乳腺癌，確定為乳腺浸潤(rùn)性癌標(biāo)本，其免 疫組化ER及PR為陰性、HER21+或者2+Fish檢測(cè)為陰性的患者。結(jié)合前期乳腺癌預(yù)后相關(guān) 基因群的工作，采用10折交叉驗(yàn)證（10-fold cross validation)來選擇和評(píng)估模型。用交 叉驗(yàn)證的目的是為了得到可靠穩(wěn)定的模型。10折交叉驗(yàn)證（10-f〇ld cross validation)， 將數(shù)據(jù)集分成十份，輪流將其中9份做訓(xùn)練1份做測(cè)試，篩選出可判斷乳腺癌預(yù)后的基因表 達(dá)譜。中位隨訪71個(gè)月。每一例均取原發(fā)組織的石蠟包埋組織，經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)癌細(xì)胞 超過50%。
[0052] 具體實(shí)驗(yàn)如下：
[0053] (一）樣本收集和臨床信息采集
[0054] 收集復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科中回顧性的組織標(biāo)本，采集臨床信息，臨床信 息包括：治療方案選擇、完整臨床病史、組織病理分型、組織學(xué)分級(jí)、有無脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié) 情況、激素受體情況、免疫組化指標(biāo)、治療情況、隨訪資料等，并建立數(shù)據(jù)庫。收集了從2006 年至今的明確的三陰性乳腺癌組織標(biāo)本，均為手術(shù)之前未接受過任何治療的標(biāo)本，新輔助 化療的病例被排除，所有的病例術(shù)后的病理學(xué)檢測(cè)均為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少于等于3個(gè)轉(zhuǎn)移的可 手術(shù)乳腺癌（TpN^)。選擇的病例為明確出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或原處轉(zhuǎn)移的標(biāo)本。局部復(fù)發(fā)的患 者具有細(xì)胞學(xué)明確診斷的。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者多發(fā)的僅通過影像學(xué)確定，單發(fā)的需要病理學(xué) 確診。
[0055] -共挑選出60例的石蠟切片的標(biāo)本。這60例標(biāo)本隨機(jī)分為兩組，其中，30例標(biāo)本 作為訓(xùn)練集（訓(xùn)練集中預(yù)后好19例，預(yù)后差11例），30例標(biāo)本作為驗(yàn)證集（驗(yàn)證集中預(yù)后 好19例，預(yù)后差11例）。
[0056] (二）對(duì)于上述60例石蠟切片的標(biāo)本，重新進(jìn)行免疫組化蛋白ER、PR、HER2和 ki67,標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0057] ER和PR抗體使用商用的抗體，Dako(克隆號(hào)ER 1D5 1:35和PR 636 1:50)。ER 和PR陰性的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)是乳腺癌核細(xì)胞陽性〈1 %。兩個(gè)獨(dú)立的病理科醫(yī)生共同評(píng)判ER和 PR的陰性。對(duì)于HER2陽性的判定，使用的是單克隆抗體（Dako,克隆號(hào)PN2A 1:400)，HER-2 陽性需要是腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜陽性，陽性比例超過10%。HER2也進(jìn)行0到3+的半定量的評(píng) 判，需要根據(jù)膜染色強(qiáng)度。〇分（〇)認(rèn)為是沒有染色；1分（1+)被認(rèn)為是染色強(qiáng)度弱，細(xì)胞 膜染色不完整；2分（2+)細(xì)胞膜染色強(qiáng)度弱到中等，至少染色比例超過10% ;3分（3+)染 色強(qiáng)度均勻一致，超過30 %的比例）。在研究中，HER2免疫組化3+被認(rèn)為是HER2有擴(kuò)增， 2+的結(jié)果需要根據(jù)HER2/neu基因擴(kuò)增FISH檢查的結(jié)果進(jìn)一步判定，HER2陰性我們定義為 免疫組化HER21+，以及HER22+且FISH陰性。
[0058] 將免疫組化ER及PR為陰性、HER21+或者HER22+且Fish檢測(cè)為陰性的患者，確 認(rèn)為三陰性乳腺癌患者。
[0059] (三）多重平行定量檢測(cè)技術(shù)標(biāo)本的準(zhǔn)備,可按常規(guī)的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)所述的條件進(jìn)行， 具體可如下。
[0060] 1)石蠟包埋切片組織勻漿液的制備
[0061] 1.測(cè)量玻片上組織的面積，取5片玻片用干凈的刮刀將玻片上的FFPE樣本（即 上述石蠟切片樣本）刮入1. 5mL的離心管中。按照下表1加入相應(yīng)體積的勻漿液和蛋白酶 K(10mg/mL)。其中，勾衆(zhòng)液來自商業(yè)化試劑盒（Quantigene multiplex assay kit) 〇
[0062] 表1勻漿液和蛋白酶K的用量
[0063]
[0064] 2.短暫地漩渦震蕩樣本后，將樣本置于65± 1°C水浴6小時(shí)，期間每過一個(gè)小時(shí)漩 禍震湯lmin。
[0065] 3.室溫下最大速度離心樣品5min，沉淀細(xì)胞碎片，然后，將勻漿液轉(zhuǎn)移至新的離 心管中，避免石蠟和碎片殘留，如有必要重復(fù)操作來去掉碎片。
[0066] 4.立即使用組織勻漿液或保存于-80°C冰箱中。
[0067] 2)樣本多重平行宙量檢測(cè)(液相基因芯片）實(shí)驗(yàn)步驟
[0068] 1.將所需試劑從冰箱取出，置于室溫融化平衡lOmin。組織勻漿液，如果是冷凍 的，首先將其從-80°C冰箱取出并室溫融化之后，置于37±1°C 30分鐘。孵育后，振蕩混勻 樣本。放置于室溫中。
[0069] 2.將Lysis Mixture置于37± 1°C水浴預(yù)熱30分鐘，并輕柔混勻。
[0070] 3.根據(jù)所用樣本數(shù)，結(jié)合下表2中所列配制工作液。
[0071] 表2工作液的組分
[0072]
[0073] 其中，上述組分中的 Lysis Mixture、Blocking Reagent、Proteinase K和 Capture Beads 來自商業(yè)化的試劑盒（Quantigene multiplex assay kit) 〇
[0074] 2.0Probe Set(SEQ ID NO. 1-16所示的探針）中所涉及的探針為針對(duì)基因 GSTM1、 BAG1、CD68、HDGFRP3、MA0B和TMEFF2的捕獲探針和雜交探針以及內(nèi)參基因 （ACTB和PPIA) 的捕獲探針和雜交探針（表3)。其中，每種探針的濃度為1 μ g/mL。
[0075] 表3探針
[0076]

[0078] 4.在96孔雜交板上，每孔加入60 μ L工作液以及40 μ L相應(yīng)的樣本（上述石蠟包 埋切片組織刮除標(biāo)本的勻漿液），覆膜后，54± 1°C 600rpm振蕩避光雜交18-22小時(shí)。
[0079] 5.雜交完畢后，將雜交板中的液體，轉(zhuǎn)入相應(yīng)的磁力分離板的對(duì)應(yīng)孔中。
[0080] 6.將磁力分離板置于手持磁力架上。每個(gè)反應(yīng)孔加入洗滌緩沖液（來自 Quantigene multiplex assay kit) 100 μ L 洗滌 20s，重復(fù)三次。
[0081] 7.加入預(yù)擴(kuò)增工作液（來自 Quantigene multiplex assay kit) 100 μ L，覆膜后， 50±1°C 600rpm振蕩避光溫浴1小時(shí)。
[0082] 8.重復(fù)步驟6。
[0083] 9.加入擴(kuò)增工作液（來自 Quantigene multiplex assay kit) 100 μ L，覆膜后， 50±1°C 600rpm振蕩避光溫浴1小時(shí)。
[0084] 10.重復(fù)步驟6。
[0085] 11.加入 Label Probe 工作液（來自 Quantigene multiplex assay kit) 100 μ L， 覆膜后，50±1°C 600rpm振蕩避光溫浴1小時(shí)。
[0086] 12.重復(fù)步驟6。
[0087] 13.加入 SAPE 工作液（來自 Quantigene multiplex assay kit) 100 μ L，覆膜后， 室溫600rpm振蕩避光溫浴0. 5小時(shí)。
[0088] 14.將磁力分離板置于手持磁力架上，每個(gè)反應(yīng)孔加入SAPE洗滌緩沖液（來自 Quantigene multiplex assay kit) 100 μ L 洗滌 20s，重復(fù)三次。
[0089] 15.加入 130 μ L SAPE 洗滌緩沖液（來自 Quantigene multiplex assay kit)于 每個(gè)反應(yīng)孔中，800rpm振蕩1分鐘后，置于Bioplex 100液體芯片分析系統(tǒng)，讀取熒光值數(shù) 據(jù)。
[0090] 其中，上述芯片檢測(cè)中，雜交反應(yīng)儀器：Labnet wortemp 56 ;雜交反應(yīng)清洗儀器： Bioplex ProII wash station ;焚光數(shù)據(jù)讀取儀器：Luminex 100〇
[0091] 多重平行定量檢測(cè)所使用的石蠟標(biāo)本是儲(chǔ)存在病理科，挑選的石蠟標(biāo)本都是經(jīng)過 病理科高年資的醫(yī)生重新復(fù)讀HE染色切片，保證所選擇的石蠟標(biāo)本是所有標(biāo)本中，惡性腫 瘤所占比例最高，同時(shí)至少滿足50%的要求。對(duì)于不滿足的標(biāo)本予以剔除。
[0092] (四)多重平行宙量檢測(cè)（液相基閔芯片)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)
[0093] 通過Bioplex 100液體芯片分析系統(tǒng)讀取上述檢測(cè)得到的相關(guān)基因的熒光值，并 用內(nèi)參基因（ACTB和PPIA)的幾何平均值對(duì)每個(gè)待測(cè)基因進(jìn)行均一化分析，以得到每個(gè)樣 本每個(gè)基因的表達(dá)量。
[0094] (五）數(shù)據(jù)處理：
[0095] 將已有的標(biāo)本病例采用隨機(jī)抽樣法對(duì)兩種組織樣本分別進(jìn)行抽樣隨機(jī)分為兩組， 一組為訓(xùn)練集（訓(xùn)練集30例），一組作為獨(dú)立的驗(yàn)證集（驗(yàn)證集30例）。
[0096] 通過結(jié)合前期乳腺癌預(yù)后相關(guān)基因群的工作，采用10折交叉驗(yàn)證（10-fold cross validation)來選擇和評(píng)估模型。利用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，構(gòu)建復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算模型，通 過訓(xùn)練集構(gòu)建三陰性患者的基因譜，然后通過獨(dú)立的驗(yàn)證集進(jìn)行驗(yàn)證。所有統(tǒng)計(jì)分析過程 通過SPSS軟件（IBM SPSS 19)以及Weka3. 6. 10完成，以雙側(cè)P〈0. 05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著界值。
[0097] 多重平行定量檢測(cè)技術(shù)通過Bioplex 100液體芯片分析系統(tǒng)讀取相關(guān)基因的熒 光值，并用內(nèi)參基因的幾何平均值對(duì)每個(gè)待測(cè)基因進(jìn)行均一化分析，以得到每個(gè)樣本每個(gè) 基因的表達(dá)量。由于將同樣的訓(xùn)練集建立模型，所有的單因素生存分析及多因素生存分 析均使用重復(fù)抽樣（Bootstrapping) 1000次進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證。獨(dú)立驗(yàn)證集進(jìn)行外部驗(yàn)證。 Kaplan-Meier生存分析進(jìn)行分組因素水平間的線性趨勢(shì)檢驗(yàn)，以雙側(cè)P〈0. 05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯 著界值。
[0098] (六）數(shù)據(jù)結(jié)果
[0099] 1、經(jīng)過前期篩選和優(yōu)化，有 6 個(gè) mRNA (GSTM1，BAG1，CD68，HDGFRP3，ΜΑ0Β 和 TMEFF2) 納入模型構(gòu)建。利用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸方程，建立了基于以上分子的模型，模型結(jié)果如下：
[0100] FFPE_SC0RE (復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值）
[0101] = -0· 1636*GSTMl+0. 5272*BAG1 + 1. 6144*CD68-4. 4979*HDGFRP3-2. 1337*MA OB-3. 6536*
[0102] TMEFF2
[0103] 其中，公式中的GSTM1表示利用上述多重平行定量檢測(cè)得到的GSTM1基因的mRNA 值；
[0104] BAG1表示利用上述多重平行定量檢測(cè)得到的BAG1基因的mRNA值；
[0105] ⑶68表示利用上述多重平行定量檢測(cè)得到的⑶68基因的mRNA值；
[0106] HDGFRP3表示利用上述多重平行定量檢測(cè)得到的HDGFRP3基因的mRNA值；
[0107] ΜΑ0Β表示利用上述多重平行定量檢測(cè)得到的ΜΑ0Β基因的mRNA值；
[0108] TMEFF2表示利用上述多重平行定量檢測(cè)得到的TMEFF2基因的mRNA值。
[0109] 也就是說，用上述多重平行定量檢測(cè)中獲得的mRNA的讀值和其在Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回 歸中的效果估計(jì)值相乘，所得到的評(píng)分就是三陰性乳腺癌患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值。
[0110] 2、通過聚類樹狀圖，可以看到訓(xùn)練集標(biāo)本中復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的樣本和無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的樣 本各自聚成一類，說明這6個(gè)基因可以很好地把三陰性乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)和不復(fù)發(fā)樣本區(qū)分 開，聚類樹狀圖上面是樣本編號(hào)，右列是本發(fā)明探針?biāo)槍?duì)的6個(gè)差異基因的名稱，再下面 是表達(dá)圖譜，黑色表示基因上調(diào)（相對(duì)于該基因的平均數(shù)），白色表示下調(diào)，根據(jù)訓(xùn)練集的 模型，用驗(yàn)證集進(jìn)行驗(yàn)證，分類的準(zhǔn)確性達(dá)到80% (如圖1-2所示）。
[0111] 3、通過訓(xùn)練集中多重平行檢測(cè)中獲得的mRNA的讀值和其在Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸中 的效果估計(jì)值相乘所得到的三陰性乳腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值（FFPE_SC0RE)，根據(jù)模型評(píng)分，計(jì) 算出訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中每位患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值（FFPE_SC0RE)，訓(xùn)練集的曲線下面積（AUC) 為0. 818、95 %的可信區(qū)間為（0. 659-0. 977)，并根據(jù)R0C得到最佳的cutoff值，將其劃分 為高危組和低危組。通過Kaplan-Meier曲線，可以看到無論是訓(xùn)練集還是驗(yàn)證集，高危組 和低危組均能很好的區(qū)分不同的預(yù)后，對(duì)于無疾病進(jìn)展時(shí)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（訓(xùn)練集P = 0· 003,驗(yàn)證集P = 0· 020)(如圖3-6所示）。
[0112] 4、我們把復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值和其他臨床有意義的預(yù)后指標(biāo)（月經(jīng)狀態(tài)、腋窩淋巴結(jié)陽性 個(gè)數(shù)、腫瘤大小、核分級(jí)、有無脈管癌栓、手術(shù)治療方式）放入進(jìn)行多因素回歸分析，可以看 到無論是在訓(xùn)練集還是驗(yàn)證集中，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值是獨(dú)立于其它預(yù)后因素的預(yù)后指標(biāo)，其P值 均小于0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中，訓(xùn)練集中的結(jié)果如表4所示，驗(yàn)證集中的結(jié)果如表5所 示。另外，表4-5中，B =回歸系數(shù)的估計(jì)值，SE =估計(jì)值的標(biāo)準(zhǔn)誤，Wald =估計(jì)值的Wald 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量值，df =自由度，Sig =顯著性水平即P值，Exp (B)=各因子或啞變量的效果的 估計(jì)值。
[0113] 由上述實(shí)驗(yàn)可知，本發(fā)明能對(duì)中國人群的早期三陰性乳腺癌預(yù)后的復(fù)發(fā)和不復(fù)發(fā) 的情況進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)后和分類，為及時(shí)指導(dǎo)臨床用藥奠定基礎(chǔ)。
[0114] 表4方程中的變量
[0115]
[0116] 表5方程中的變量
[0117]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一組用于三陰性乳腺癌預(yù)后的基因，其特征在于，包括：基因 GSTM1、BAG1、⑶68、 HDGFRP3、MOB 和 TMEFF2。2. -種用于三陰性乳腺癌預(yù)后的多重平行檢測(cè)液相基因芯片，其特征在于：包括探 針； 其中，所述探針包括下列三組核苷酸序列之一： (1) SEQ ID NO. 1 ~SEQ ID NO. 12 所示序列； (2) SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 12所示序列中的每條序列的互補(bǔ)鏈； (3) 與SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 12所示的序列中的每條序列有至少70 %同源性的 序列。3. 如權(quán)利要求2所述的芯片，其特征在于：所述芯片還包括：SEQ ID NO. 13~SEQ ID NO. 16所示序列的探針； 所述三陰性乳腺癌包括：早期三陰性乳腺癌。4. 一種用于三陰性乳腺癌預(yù)后的試劑盒，其特征在于，包括下列三組核苷酸序列之一 的探針： (1) SEQ ID NO. 1 ~SEQ ID NO. 12 所示序列； (2) SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 12所示序列中的每條序列的互補(bǔ)鏈； (3) 與SEQ ID NO. 1~SEQ ID NO. 12所示的序列中的每條序列有至少70 %同源性的 序列。5. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括：SEQ ID NO. 13~SEQ ID NO. 16所示序列的探針； 所述三陰性乳腺癌包括：早期三陰性乳腺癌。6. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括：蛋白酶K。7. -種用于三陰性乳腺癌預(yù)后的基因的評(píng)價(jià)系統(tǒng)，其特征在于，包括：復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值模 塊和評(píng)價(jià)模塊； 所述復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值模塊，用于獲得復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值，其中，該復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值是將權(quán)利要求2所述 的基因芯片測(cè)得的樣本的基因 GSTM1、BAG1、CD68、HDGFRP3、MA0B和TMEFF2的各自mRNA值 與其在Cox回歸中的效果估計(jì)值相乘而得到的值； 所述評(píng)價(jià)模塊，用于將復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值模塊中獲得的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值，通過受試者工作特征曲 線的最佳的臨界值，能將樣本分為預(yù)后好和預(yù)后差兩組。8. 如權(quán)利要求7所述的評(píng)價(jià)系統(tǒng)，其特征在于：所述三陰性乳腺癌包括：早期三陰性乳 腺癌； 所述復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)值的計(jì)算公式如下： FFPE_SCORE = -0. 1636*GSTMl+0. 5272*BAG1+1. 6144*CD68-4. 4979*HDGFRP3-2. 1337*M AOB-3. 6536*TMEFF2 其中，公式中的GSTM1表示利用權(quán)利要求2所述的基因芯片檢測(cè)得到的GSTM1基因的 mRNA 值； BAG1表示利用權(quán)利要求2所述的基因芯片檢測(cè)得到的BAG1基因的mRNA值； ⑶68表示利用權(quán)利要求2所述的基因芯片檢測(cè)得到的⑶68基因的mRNA值； HDGFRP3表示利用權(quán)利要求2所述的基因芯片檢測(cè)得到的HDGFRP3基因的mRNA值； MAOB表示利用上述權(quán)利要求2所述的基因芯片檢測(cè)得到的MAOB基因的mRNA值； TMEFF2表示利用權(quán)利要求2所述的基因芯片檢測(cè)得到的TMEFF2基因的mRNA值。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105986024SQ201510091976
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月27日
【發(fā)明人】邵志敏, 黃曉燕, 徐曉晶
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院, 上海伯豪生物技術(shù)有限公司