多孔結(jié)構(gòu)及其制造方法
【專利摘要】根據(jù)本發(fā)明的多孔結(jié)構(gòu)在其孔內(nèi)部具有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCT)的引物，并且因此不同于僅表面用于擴(kuò)增和檢測的一般結(jié)構(gòu)，甚至其內(nèi)部部分也可使用，從而使反應(yīng)性最大化。此外，相應(yīng)結(jié)構(gòu)中所包含引物種類的區(qū)別導(dǎo)致同時檢測數(shù)種靶核酸并且同時對其進(jìn)行實時分析，由此可用于多重實時PCR。
【專利說明】
多孔結(jié)構(gòu)及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本說明書中描述的公開內(nèi)容涉及包含引物的多孔結(jié)構(gòu)、所述多孔結(jié)構(gòu)的制造方法 以及使用所述多孔結(jié)構(gòu)的多重實時核酸擴(kuò)增方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法是通過克隆核酸的堿基 序列對其進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，并且有終點PCR(endpoint PCR)和實時PCR(real-time PCR)。迄 今，通常使用終點PCR，但是通過該方法，僅在PCR反應(yīng)完成之后才可檢測或量化所擴(kuò)增的核 酸，因此存在以下問題:在實驗之后需要單獨的所得物分析步驟(例如電泳)及用于此的設(shè) 備，需要2小時或更久的長時間并且不能實時地檢測或量化所擴(kuò)增的核酸。例如，需要由在 反應(yīng)完成之后獲得的PCR產(chǎn)物量化第一核酸，但是由于影響分析的多種因素而難以精確地 量化第一核酸，即使采用熒光染色等也是如此。在指數(shù)期測量核酸的精確量，但是由于通過 終點PCR不能進(jìn)行實時測量而難以通過其分析精確量。
[0003] 相比之下，實時PCR具有以下優(yōu)勢：由于每個周期測量所擴(kuò)增核酸的量而可精確地 量化第一靶核酸，并且特別地可通過監(jiān)測器實時地確認(rèn)處于指數(shù)期(其為擴(kuò)增發(fā)生的時段） 的反應(yīng)。特別地，疾病診斷領(lǐng)域中廣泛地使用多重實時核酸擴(kuò)增方法(多重實時PCR)，因為 其可在單個室中通過一次實驗確任多種生物標(biāo)志物并且對其進(jìn)行實時定量分析。
[0004] 然而，由于靶標(biāo)之間的干擾隨其測量數(shù)目的增加而增加，因此通過以下方法難以 進(jìn)行精確測量，所述方法為用于多重實時核酸擴(kuò)增并且使用探針的顏色和引物解鏈點的最 常用方法。因此，在需要通過同時且快速地分析很多不同種類核酸來精確地診斷疾病(例如 即時護(hù)理技術(shù)(P〇int-〇f-care technology，P0CT))的領(lǐng)域中難以使用多重實時核酸擴(kuò)增 方法。
[0005] [引用列表]
[0006] [專利文獻(xiàn)]
[0007] [專利文獻(xiàn)1]韓國專利登記號10-0794699
[0008] [專利文獻(xiàn)2]韓國專利申請公開號10-2008-0103548
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 技術(shù)問題
[0011] 本發(fā)明的一個目的是提供為用于多重實時核酸擴(kuò)增(多重實時PCR)之結(jié)構(gòu)的多孔 結(jié)構(gòu)、所述多孔結(jié)構(gòu)的制造方法以及通過使用該結(jié)構(gòu)可同時且精確地實時分析多種核酸的 多重實時核酸擴(kuò)增方法。
[0012] 問題的解決方案
[0013] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一個實施方案提供了包含孔的多孔結(jié)構(gòu)，
[0014] 所述多孔結(jié)構(gòu)包含作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向 引物一個或更多個方向上的引物，所述引物固定于所述孔的內(nèi)部。
[0015] 另外，本發(fā)明的一個實施方案提供了用于制造多孔結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括：
[0016]制備結(jié)構(gòu)形成溶液，其包含預(yù)聚物(pre-polymer)、致孔劑以及作為聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物中一個或更多個方向的引物；
[0017]如下以液滴(droplet)形式形成結(jié)構(gòu):使油通過微通道的一個通道，所述微通道由 包括以直角相互交叉之截面的兩個通道組成，并使如上制備的結(jié)構(gòu)形成溶液通過另一通道 從而使所述結(jié)構(gòu)形成溶液分散在交叉截面的油相中；
[0018] 固化由此形成的結(jié)構(gòu)；以及
[0019] 通過從經(jīng)固化結(jié)構(gòu)中除去所述致孔劑在該結(jié)構(gòu)中形成孔。
[0020] 本發(fā)明的另一個實施方案提供了用于制造多孔結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括：
[0021] 制備結(jié)構(gòu)形成溶液，其包含預(yù)聚物、致孔劑以及作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之引物 的靶核酸的正向引物和反向引物一個或更多個方向上的引物；
[0022] 通過將如上制備的結(jié)構(gòu)形成溶液點樣在陣列上形成液滴形結(jié)構(gòu)；
[0023]固化該結(jié)構(gòu)；以及
[0024] 通過從經(jīng)固化結(jié)構(gòu)中除去所述致孔劑在該結(jié)構(gòu)中形成孔。
[0025] 本發(fā)明的又一個實施方案提供了用于多重實時核酸擴(kuò)增的設(shè)備，其包含：
[0026] -個或更多個上述的多孔結(jié)構(gòu)；以及
[0027] 陣列，其具有以凹陷(well)形式圖案化的表面以便布置所述多孔結(jié)構(gòu)。
[0028] 另外，本發(fā)明的一個實施方案提供了多重實時核酸擴(kuò)增方法，其包括：
[0029] 將一個或更多個上述的多孔結(jié)構(gòu)注入室中，所述室包含具有以凹陷形式圖案化之 表面的陣列，并將所述多孔結(jié)構(gòu)布置在陣列上；
[0030] 將包含一種或更多種靶核酸的溶液注入所述室中并將所述溶液引入所述多孔結(jié) 構(gòu)的孔中；以及
[0031 ]通過靶核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增靶核酸。
[0032]發(fā)明的有益效果
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的多孔結(jié)構(gòu)在孔內(nèi)部具有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物，因此不同于僅 使用表面的典型結(jié)構(gòu)，甚至該結(jié)構(gòu)的內(nèi)部在擴(kuò)增和檢測中也可得到利用，以使得反應(yīng)性最 大化。
[0034] 另外，所述多孔結(jié)構(gòu)用于多重實時核酸擴(kuò)增(多重實時PCR)，因為其可通過改變相 應(yīng)結(jié)構(gòu)中所包含引物的種類來同時檢測多種靶核酸并同時對其進(jìn)行實時分析，并且所述多 孔結(jié)構(gòu)可用于需要通過同時且快速地分析很多不同種類的核酸來精確地診斷疾病(例如即 時護(hù)理技術(shù)(P0CT))的領(lǐng)域。
[0035] 附圖簡述
[0036] [圖1]圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一個實施方案之多孔結(jié)構(gòu)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并且左側(cè)的球 形是根據(jù)本發(fā)明一個實施方案之多孔結(jié)構(gòu)的示意圖。具體地，右側(cè)4個方框中左上部的圖示 出了其中固定了作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物一個方 向上的引物(紅色）的構(gòu)造，右上部的圖示出了其中正發(fā)生與該引物結(jié)合之靶核酸的聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的構(gòu)造，左下部的圖示出了其中固定了正向引物和反向引物一個方向上的 引物并且該引物通過接頭(深藍(lán)色）固定的構(gòu)造，右下部的圖示出了其中正向引物(紅色)和 反向引物(淺藍(lán)色)二者通過接頭固定的構(gòu)造。
[0037] [圖2]圖2是這樣的示意圖，其示出了根據(jù)本發(fā)明一個實施方案之用于制造多孔結(jié) 構(gòu)的方法(左上部）、通過上述方法制造并且彼此具有不同種類靶標(biāo)之多孔結(jié)構(gòu)在陣列上的 布置（右上部）、在擴(kuò)增核酸的同時對核酸的實時檢測（右下部），以及對核酸的分析（左下 部)。
[0038] [圖3]圖3是示出了根據(jù)本發(fā)明一個實施方案之用于制造多孔結(jié)構(gòu)的方法的示意 圖，具體地其示出了通過將多孔結(jié)構(gòu)形成溶液點樣在陣列上形成液滴形多孔結(jié)構(gòu)的步驟； 固化以液滴形制造且彼此具有不同種類靶標(biāo)的多孔結(jié)構(gòu)并從該多孔結(jié)構(gòu)中除去致孔劑的 步驟;以及擴(kuò)增核酸并同時對其進(jìn)行實時檢測的步驟。
[0039] [圖4]圖4(A)是這樣的示意圖，其示出了按照根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的方法通 過使用微通道制造液滴形結(jié)構(gòu)的過程，圖4(B)示出了真實拍攝的該過程的照片。
[0040] [圖5]圖5是這樣的示意圖，其示出了按照根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的方法通過將 結(jié)構(gòu)形成溶液點樣在陣列上制造液滴形結(jié)構(gòu)的方法，在此，該結(jié)構(gòu)的不同顏色表示相應(yīng)結(jié) 構(gòu)中包含不同種類的引物。
[0041] [圖6]圖6示出了室，其用于本發(fā)明的一個實施方案并且包含具有以凹陷形式圖案 化之表面的陣列以便布置多孔結(jié)構(gòu)。
[0042] [圖7]圖7是示出了多孔結(jié)構(gòu)的定量PCR結(jié)果的圖，所述多孔結(jié)構(gòu)按照根據(jù)本發(fā)明 一個實施方案的方法制造。
[0043] [圖8]圖8是示出了根據(jù)本發(fā)明一個實施方案之多孔結(jié)構(gòu)的照片的圖，使用CCD照 相機(jī)在定量PCR之前和之后拍攝所述照片。
[0044] [圖9]圖9示出了經(jīng)受從通道1至通道3順序電泳，然后進(jìn)行測量之根據(jù)本發(fā)明一個 實施方案的多孔結(jié)構(gòu)Chl-3的照片(左側(cè))和每個循環(huán)測量之熒光強(qiáng)度的圖。
[0045][圖10]圖10示出了使用CCD照相機(jī)在(a)qPCR之前、（b)qPCR期間（第42個循環(huán)）和 (c)qPCR之后拍攝的根據(jù)本發(fā)明一個實施方案之多孔結(jié)構(gòu)Chl-3的照片。
[0046] [圖11]圖11示出了每個循環(huán)測量之根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的多孔結(jié)構(gòu)Chl-3的 熒光強(qiáng)度的圖。
【具體實施方式】
[0047] 在下文，將對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0048]本發(fā)明的一個實施方案提供了包含孔的多孔結(jié)構(gòu)，并且所述多孔結(jié)構(gòu)包含作為聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物一個或更多個方向上的引物， 所述引物固定于所述孔的內(nèi)部。
[0049] 在此，所述引物可為10至100個堿基對(bp)，更特別地20至50個堿基對，但是引物 序列的種類和長度可基于靶核酸而改變，并且不受限制。
[0050] 根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的多孔結(jié)構(gòu)可以是其中固定了作為聚合酶反應(yīng)(PCR)弓丨 物之靶核酸的正向引物和反向引物二者的多孔結(jié)構(gòu)，或者其可以是其中固定了這些中僅一 個方向上的引物的多孔結(jié)構(gòu)。在固定正向引物和反向引物僅一個方向上的引物的情況下， 通過向利用多孔結(jié)構(gòu)之用于多重實時核酸擴(kuò)增(多重實時PCR)的設(shè)備中注入另一種引物來 增強(qiáng)反應(yīng)性，因為這另一種引物可在多孔結(jié)構(gòu)的孔中自由移動。
[0051] 例如，根據(jù)本發(fā)明一個實施方案多孔結(jié)構(gòu)的顆粒尺寸可為10WI1至500μπι，更特別 地，其顆粒尺寸可為100μπι至300μπι。所述多孔結(jié)構(gòu)的形狀不受限制，只要其是能夠在其內(nèi)部 具有孔的三維結(jié)構(gòu)即可，更特別地，示例可為球形形狀。作為用于多孔結(jié)構(gòu)的材料，可使用 能夠被固化的預(yù)聚物且不受限制，并且特別地，可使用親水性聚合物，例如聚乙二醇-二丙 烯酸酯(PEG-DA)或聚丙烯酰胺(PA)。另外，作為一個實施方案之多孔結(jié)構(gòu)的孔隙率可為相 對于所述多孔結(jié)構(gòu)總體積的10體積％至80體積％，更特別地50體積％至70體積％。當(dāng)孔隙 率不在上述范圍內(nèi)時，存在多孔特性可劣化或者結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可劣化的問題。
[0052] 根據(jù)本發(fā)明另一個實施方案的多孔結(jié)構(gòu)可以是這樣的多孔結(jié)構(gòu):通過包含在末端 具有丙烯酰基的引物來當(dāng)引物末端的丙烯?；瘜W(xué)結(jié)合于多孔結(jié)構(gòu)時，將引物固定于多孔 結(jié)構(gòu)。另外，作為一個實施方案，引物可通過接頭連接于多孔結(jié)構(gòu)，并且在此情況下當(dāng)通過 接頭提高了引物的自由程度時，反應(yīng)性增強(qiáng)，所述引物的自由程度為引物可在孔中移動。接 頭的長度為例如5nm至100nm，或者20nm至50nm?？墒褂镁酆衔?例如聚乙二醇)或聚合物鏈 (例如烷基鏈)作為接頭，但是接頭的種類不受限制，只要其可與引物和多孔結(jié)構(gòu)化學(xué)結(jié)合 即可(參見圖1)。
[0053] 另外，作為本發(fā)明的一個實施方案，所述多孔結(jié)構(gòu)還可包含以下中的一個或更多 個:提供經(jīng)固定引物之信息的編碼物(encoder)和提供在孔中待擴(kuò)增之核酸的定量信息的 熒光標(biāo)志物。編碼物意指這樣的材料，其通過顏色、形狀等使固定在相應(yīng)多孔結(jié)構(gòu)中的固定 引物彼此區(qū)別開來，例如量子點呈現(xiàn)出不同顏色的熒光或者可使用具有特定形狀的金屬、 塑料、玻璃、硅酮等?；蛘?，可不使用編碼物而通過使用彼此具有不同尺寸的多孔結(jié)構(gòu)或者 指定相應(yīng)多孔結(jié)構(gòu)在陣列中的位置來將相應(yīng)多孔結(jié)構(gòu)中的引物彼此區(qū)別開來。
[0054] 熒光標(biāo)志物使實時地檢測靶核酸成為可能，因為其與靶核酸結(jié)合以提供熒光信 號。由于熒光標(biāo)志物可固定于多孔結(jié)構(gòu)并且在通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增靶核酸的情況下熒 光強(qiáng)度還提高，因此可通過檢測熒光強(qiáng)度來定量待擴(kuò)增的靶核酸。作為熒光標(biāo)志物，可使用 任一種而不受種類的限制，只要其通過與靶核酸互補性地結(jié)合而呈現(xiàn)出熒光即可。例如，可 使用基于花菁的染料，例如SYBR (DGreen I;在擴(kuò)增雙鏈核酸時與其結(jié)合而呈現(xiàn)出熒光 的內(nèi)部螯合劑（interchelator )，例如EtBr; 5 '端經(jīng)焚光物質(zhì)(FAM等)修飾并且3 '端經(jīng)猝滅 劑物質(zhì)(TAMRA等)修飾之核酸的TaqMan?探針，等。在此，TaqMan?探針通過在退火步驟中雜 交而與模板DNA特異性結(jié)合但該探針上的猝滅劑抑制熒光的產(chǎn)生，通過雜交與模板結(jié)合的 TaqMan?探針在延伸反應(yīng)時通過屬于Taq DNA聚合酶之5 ' -3'核酸外切酶的活性而分解，熒 光染料與探針分離，由此猝滅劑的抑制得以解除，并呈現(xiàn)出熒光?；蛘?，例如，還可使用寡核 苷酸探針(分子信標(biāo)探針(Molecular Beacon probe))，其形成發(fā)夾形二級結(jié)構(gòu)，并且其中 核酸的兩端經(jīng)熒光物質(zhì)(FAM、TAMRA等)和猝滅劑物質(zhì)(DABCYL等)修飾。在此，分子信標(biāo)探針 以分離狀態(tài)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并且當(dāng)熒光物質(zhì)和猝滅劑物質(zhì)彼此靠近存在時，抑制熒光的產(chǎn) 生。該探針在退火步驟中通過雜交與模板在互補區(qū)特異性結(jié)合，此時隨著熒光物質(zhì)與猝滅 劑物質(zhì)的距離增加，猝滅劑物質(zhì)的抑制得到解除，由此探針上的熒光染料呈現(xiàn)出熒光。與此 同時，未通過雜交結(jié)合的分子信標(biāo)探針由于其維持發(fā)夾結(jié)構(gòu)而不會呈現(xiàn)出熒光。
[0055] 本發(fā)明的另一個實施方案是用于制造如上所述之多孔結(jié)構(gòu)的方法，并且提供了用 于制造多孔結(jié)構(gòu)的以下方法(參見圖2)，其包括：
[0056] 制備結(jié)構(gòu)形成溶液，所述結(jié)構(gòu)形成溶液包含預(yù)聚物、致孔劑以及作為聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物一個或更多個方向上的引物；
[0057]如下形成液滴形結(jié)構(gòu)：使油通過微通道的一個通道，所述微通道由包括以直角相 互交叉之截面的兩個通道組成，并使如上制備的結(jié)構(gòu)形成溶液通過另一通道從而使所述結(jié) 構(gòu)形成溶液分散在交叉截面的油相中；
[0058] 固化由此形成的結(jié)構(gòu)；以及
[0059] 通過從經(jīng)固化結(jié)構(gòu)中除去致孔劑在該結(jié)構(gòu)中形成孔。
[0060] 作為一個實施方案，在形成液滴形結(jié)構(gòu)的步驟中，可如下使結(jié)構(gòu)形成溶液有效地 分散在交叉截面的油相中：使油持續(xù)地通過一個通道并使由此制備的結(jié)構(gòu)形成溶液間斷地 通過另一通道。在此，油的流量特別地為50至1500μ1/小時或者100至1200μ1/小時，更特別 地為200至400μ1/小時，并且結(jié)構(gòu)形成溶液的流量特別地為5至ΙΟΟΟμΙ/小時或者10至500μ 1/小時，更特別地可將其調(diào)整為50至150μ!7小時。通過調(diào)整油和結(jié)構(gòu)形成溶液的相應(yīng)流量 及其比例可調(diào)整通過通道之液滴的顆粒尺寸，由此可調(diào)整待制造之多孔結(jié)構(gòu)的顆粒尺寸。 例如，在其中油和結(jié)構(gòu)形成溶液以相應(yīng)的流量范圍通過通道的情況下，可制備顆粒尺寸為 10至500μπι，更特別地42至200μπι的液滴。另外，通過如上所述調(diào)整相應(yīng)的流量可容易地制造 具有不同顆粒尺寸的多孔結(jié)構(gòu)，并且由此可不使用編碼物而通過利用顆粒尺寸的差異來區(qū) 別或鑒定多孔結(jié)構(gòu)中包含的引物。
[0061] 在此，油將剪切力添加于分散相之多孔結(jié)構(gòu)形成溶液的流動以使其形成為液滴 形，并且使該液滴穩(wěn)定而不再聚集。結(jié)構(gòu)形成溶液通過之根據(jù)一個實施方案的通道可具有 通路在緊接交叉截面之后變窄的形狀，在此情況下當(dāng)溶液通過通道時，其有效地形成為液 滴(參見圖6(B))。
[0062] 作為一個實施方案，可使用碳氟化合物(fluorocarbon，F(xiàn)C)油、礦物油，娃酮油、十 六烷、己烷、甲苯、苯、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、乙醚等作為油。
[0063] 另外，本發(fā)明的又一個實施方案是用于制造多孔結(jié)構(gòu)的方法，并且提供了用于制 造多孔結(jié)構(gòu)的以下方法(參見圖3)，其包括：
[0064] 制備結(jié)構(gòu)形成溶液，所述結(jié)構(gòu)形成溶液包含預(yù)聚物、致孔劑以及作為聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物一個或更多個方向上的引物；
[0065] 通過將如上制備的結(jié)構(gòu)形成溶液點樣在陣列上形成液滴形結(jié)構(gòu)；
[0066]固化該結(jié)構(gòu)；以及
[0067] 通過從經(jīng)固化結(jié)構(gòu)中除去致孔劑在該結(jié)構(gòu)中形成孔。
[0068] 更特別地，作為陣列，可使用具有以凹陷形式圖案化之表面的陣列以便布置多孔 結(jié)構(gòu)。根據(jù)一個實施方案，可通過將多孔結(jié)構(gòu)形成溶液點樣在陣列上的恒定位置制造多孔 結(jié)構(gòu)，并且由此可通過在陣列上的位置來使相應(yīng)多孔結(jié)構(gòu)中包含的不同引物彼此區(qū)別開 來，而無需分別使用編碼物。
[0069] 在此，"預(yù)聚物"意指其聚合反應(yīng)或縮聚反應(yīng)在適當(dāng)階段停止以有利于模制聚合物 的預(yù)聚物，并且其意指處于未被固化狀態(tài)以在本發(fā)明情況下容易地模制的聚合物。
[0070] 根據(jù)一個實施方案的結(jié)構(gòu)形成溶液包含作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之引物的靶核 酸的正向引物和反向引物中僅一個方向上的引物，并且在此情況下可向利用多孔結(jié)構(gòu)之用 于多重實時核酸擴(kuò)增(多重實時PCR)的設(shè)備中單獨地引入另一引物。
[0071] 此外，可如下制造多個彼此包含不同引物的多孔結(jié)構(gòu):通過使用本發(fā)明的制造方 法基于靶核酸的種類來注入不同種類的引物。另外，所述結(jié)構(gòu)形成溶液還可包含以下中的 一個或更多個:提供經(jīng)固定引物之信息的編碼物和提供待擴(kuò)增核酸之定量信息的熒光標(biāo)志 物。
[0072] 作為一個實施方案，制備結(jié)構(gòu)形成溶液的步驟還包括通過改變該溶液中所包含致 孔劑的尺寸來調(diào)整將在多孔結(jié)構(gòu)中形成之孔的尺寸。在此，例如，可使用聚乙二醇(PEG)，并 且特別地可使用 PEG200、PEG300、PEG400、PEG600、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG3000、 PEG3350、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG12000、PEG20000、PEG35000、PEG40000 等(生產(chǎn)商:Sigma Aldrich)作為致孔劑。
[0073] 所述微通道可如下制造:通過光刻法在晶片上將基底圖案化成通道形狀，然后鑄 造其模具。在此，作為通過鑄造模具制造之微通道的材料，可使用任何材料而不受限制，只 要其是基于硅酮的聚合物即可，例如可使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
[0074]此外，作為本發(fā)明的一個實施方案，多孔結(jié)構(gòu)的固化為使得多孔結(jié)構(gòu)得到固化同 時維持其固化之前的形狀，固化方法不受限制只要可維持形狀即可，并且可使用光學(xué)、化學(xué) 或熱固化方法。
[0075]本發(fā)明的另一個實施方案提供了用于多重實時核酸擴(kuò)增的設(shè)備，其包含：
[0076] 一個或更多個上述多孔結(jié)構(gòu)；以及
[0077] 陣列，其具有以凹陷形式圖案化的表面以便布置所述多孔結(jié)構(gòu)。
[0078] 用于根據(jù)一個實施方案之具有以凹陷形式圖案化的表面的陣列的材料可為玻璃、 塑料、聚合物、硅酮等，并且其種類不受限制。作為一個實施方案，用于多重實時核酸擴(kuò)增的 設(shè)備可在各個凹陷中包含多個多孔結(jié)構(gòu)，所述多孔結(jié)構(gòu)包含針對各種不同靶核酸的引物或 者引物和編碼物以同時檢測多種靶核酸。
[0079]另外，本發(fā)明的另一個實施方案是多重實時核酸擴(kuò)增方法，并且提供了多重實時 核酸擴(kuò)增方法，其包括：
[0080] 將一個或更多個根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔結(jié)構(gòu)注入室中，所述室包含具有以凹 陷形式圖案化之表面的陣列，并將所述多孔結(jié)構(gòu)布置在陣列上；
[0081] 將包含一種或更多種靶核酸的溶液注入用于多重實時核酸擴(kuò)增之設(shè)備的室中并 將溶液引入多孔結(jié)構(gòu)的孔中；以及
[0082] 通過靶核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增靶核酸。
[0083] 根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的多孔結(jié)構(gòu)包含作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之引物的靶 核酸的正向引物和反向引物僅一個方向上的引物，并且含有靶核酸的溶液包含另一種引 物。作為一個實施方案，含有靶核酸的溶液還包含含有鎖核酸(locked nucleic acid，LNA) 的引物(例如3 ' -鎖核酸引物）、Taq聚合酶等。
[0084] 此外，作為一個實施方案，伴隨進(jìn)行實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的步驟，本發(fā)明還包括同 時定量分析一個或更多個多孔結(jié)構(gòu)的每個中聚合的核酸的步驟，因此如上所述可在擴(kuò)增不 同種類靶核酸的同時對其進(jìn)行實時檢測和定量分析。
[0085] 實施方案
[0086]在下文，將參考本發(fā)明的實驗實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。說明性地提出這些 實驗例僅是為了更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但是對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言將明顯的是，本發(fā) 明的范圍不受這些實驗實施例的限制。
[0087][實施例1]多孔結(jié)構(gòu)的制造 1
[0088]下面將對根據(jù)本發(fā)明一個實施方案之用于制造多孔結(jié)構(gòu)的方法進(jìn)行描述。
[0089] 微通道的制造
[0090] 首先，使用光刻術(shù)在硅晶片SU-8(商品名：2050;制造商:MiCr〇Chem)上將通道圖案 化成使得具有兩個通道以直角相互交叉的截面的形狀，從而制造模具。隨后，將如下制備的 預(yù)聚物溶液倒入使用SU-8制造的模具中：以10:1混合聚二甲基硅氧烷(PDMS)溶液與固化劑 (商品名：SYJLGAMD⑩184;生產(chǎn)商:D0W HITECH SILICON)。在真空室中從預(yù)聚物中除去 氣體，持續(xù)60分鐘，將預(yù)聚物在爐中于80°C下固化90分鐘并與模具分離，從而制造出PDMS微 通道。在此，該通道的寬度為120μηι，并且其高度為100μπι。
[0091] 多孔結(jié)構(gòu)形成溶液的制備
[0092] 首先，通過混合94·5mL蒸餾水、3mL的100XTE緩沖液和2·5mL的10%(Tween)-20稀 釋溶液來制備l〇〇ml的3Χ ΤΕΤ溶液(具有Tween 20的3Χ ΤΕ緩沖液）。此后，通過混合400μ1聚 乙二醇600(PEG 600)和200μ1 PEG700DA(生產(chǎn)商：Sigma Aldrich)作為致孔劑，以及50μ1 Darocur(生產(chǎn)商：Sigma Aldrich)和350μ1 ΤΕΤ作為光敏引發(fā)劑來制備總共lmL的水凝膠溶 液。隨后，將6μ1 ImM之用于與靶核酸結(jié)合的引物與54μ1 TE緩沖液混合以獲得總共100μΜ (60μ1)，并將其與水凝膠溶液(540μ1)混合，從而制備引物終濃度為10μΜ的水凝膠預(yù)聚物溶 液(600μ1)〇
[0093] 在此，靶核酸的種類為沙門氏菌屬(salmonella)食物中毒性細(xì)菌(微生物資源中 心KCTC#2515)，并且分別制備以下溶液:包含以下正向引物作為引物的多孔結(jié)構(gòu)形成溶液、 包含以下反向引物作為引物的多孔結(jié)構(gòu)形成溶液，和包含這二者作為引物的多孔結(jié)構(gòu)形成 溶液。在此，熒光標(biāo)志物為SYBR?Green 1(生產(chǎn)商：InVitr〇gen)。
[0094] -正向引物：AAT TAT CGC CAC GTT CGG GCA ATT CGT TA(SEQ ID N0.1)，
[0095] -反向引物：TCA ΑΤΑ ΑΤΑ CCG GCC TTC AAA TCG GCA TC(SEQ ID N0.2)。 _6] 多孔結(jié)構(gòu)的制造
[0097] 通過流動聚焦（f low-focusing)方法制造液滴形結(jié)構(gòu)，其中將含有1 . 8 % Krytox?表面活性劑(生產(chǎn)商:Dupont)的碳氟化合物(FC)油持續(xù)地注入由此制造的兩個 交叉微通道的一個通道中，并將由此制備的水凝膠預(yù)聚物溶液間斷地注入另一通道中以使 其分散在交叉截面中的油中。
[0098] 在此，如表1中所示調(diào)整FC油(連續(xù)相)和水凝膠預(yù)聚物溶液(分散相）的流量，使得 相應(yīng)的結(jié)構(gòu)具有71至131μπι的不同顆粒尺寸。
[0099] [表1]
[0101] 圖4(A)是示出了根據(jù)上述方法通過使用微通道形成液滴形結(jié)構(gòu)的過程的示意圖， 并且圖4(B)示出了真實拍攝的制造過程的照片，其中FC油的流量為300μ1/小時，而水凝膠 預(yù)聚物溶液的流量為1〇〇μ1/小時。
[0102] 此后，將由此制造的液滴形結(jié)構(gòu)用紫外光(UV)以6至SmW/cm2輻照20分鐘以固化。 將該結(jié)構(gòu)用200μ1純FC油清洗兩次，并用200μ1具有Tween 20的TE緩沖液清洗五次以除去致 孔劑，從而制造以60%的孔隙率在結(jié)構(gòu)中形成之孔的多孔結(jié)構(gòu)。
[0103] [實施例2]多孔結(jié)構(gòu)的制造2
[0104] 接下來，將對根據(jù)本發(fā)明另一個實施方案的多孔結(jié)構(gòu)制造進(jìn)行描述。
[0105] 通過與上述實施例1中相同的方法制備多孔結(jié)構(gòu)形成溶液的水凝膠預(yù)聚物溶液。 此后，將彼此包含不同引物（正向引物、反向引物以及正向和反向引物）的水凝膠預(yù)聚物溶 液點樣在陣列的每個孔上，從而形成液滴形結(jié)構(gòu)，所述陣列具有以凹陷形式圖案化的表面 以便布置多孔結(jié)構(gòu)。
[0106] 此后，將由此制造的液滴形結(jié)構(gòu)用紫外光(UV)以190.6mW/cm2輻照5秒以固化。將 該結(jié)構(gòu)用200μ1具有Tween 20的TE緩沖液清洗五次以除去致孔劑，從而制造在結(jié)構(gòu)中形成 的孔并且顆粒尺寸為120μπι的多孔結(jié)構(gòu)。
[0107] [實施例3]使用多孔結(jié)構(gòu)的多重實時核酸擴(kuò)增
[0108] 下面將對根據(jù)本發(fā)明一個實施方案之使用多孔結(jié)構(gòu)來實時擴(kuò)增靶核酸的方法進(jìn) 行描述。
[0109] 首先，制備室，其包含具有以凹陷形式圖案化之表面的陣列以便布置多孔結(jié)構(gòu)（圖 6)。此后，將通過上述實施例1或2的方法制造并且彼此包含不同引物(正向引物、反向引物 以及正向和反向引物）的多孔結(jié)構(gòu)注入該室中以使其安全地布置在每個凹陷中。在此，將未 安全布置在每個凹陷中但殘留在凹陷周圍的結(jié)構(gòu)清洗掉。隨后，向該室中引入8μ1 PCR Mastermix(包含聚合酶和核苷酸，生產(chǎn)商:Nano-Bio System Lab. )、5.4μ1蒸餾水(去離子 水)和ΙμL沙門氏菌屬DNA模板（lx 106個拷貝的質(zhì)粒DNA)，并且在多孔結(jié)構(gòu)僅包含正向引物 和反向引物之一的情況下，向該室中注入包含另一種引物的PCR溶液。
[0110] 此后，允許根據(jù)以下溫度循環(huán)進(jìn)行總聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，從而擴(kuò)增核酸。在此， 進(jìn)行PCR反應(yīng)，總共40個循環(huán)，并且每當(dāng)每個循環(huán)完成時，通過測量所擴(kuò)增核酸中熒光標(biāo)志 物呈現(xiàn)出的熒光強(qiáng)度5秒進(jìn)行定量分析。
[0111] -預(yù)變性：95°C，8秒，
[0112] -變性：95°C，3秒，
[0113] -退火和延伸:72°C，6秒。
[0114] 圖7是示出了多孔結(jié)構(gòu)定量PCR(qPCR)結(jié)果的圖，所述多孔結(jié)構(gòu)通過與實施例1之 制造方法相同的方法制造，僅固定正向引物和反向引物的正向引物，并且顆粒尺寸為120μ m，如該圖中所示，可以看出PCR正常發(fā)生。
[0115] [實驗實施例1]基于固定于多孔結(jié)構(gòu)之引物的種類的定量PCR效率比較 [0116]進(jìn)行以下實驗以基于待固定于多孔結(jié)構(gòu)之引物的種類比較定量PCR的效率。
[0117] 多孔結(jié)構(gòu)以相同的方式制造，不同之處在于：多孔結(jié)構(gòu)Chl-3通過實施例2的方法 制造，多孔結(jié)構(gòu)Chi僅固定有正向引物，并且多孔結(jié)構(gòu)Ch2固定有正向引物和反向引物二者。 Ch3中僅包含PCR溶液而不包含本發(fā)明的多孔結(jié)構(gòu)，并且Ch3用作對照。在此，多孔結(jié)構(gòu)中包 含的引物量為1〇〇μΜ，并且多孔結(jié)構(gòu)的顆粒尺寸為600μπι。
[0118] 此后，通過上述實施例3的方法進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，總共40個循環(huán)，并且使 用CCD(電荷耦合裝置)照相機(jī)在qPCR之前和之后拍攝的多孔結(jié)構(gòu)照片示于圖8中。另外，圖9 中示出了經(jīng)受從通道1至通道3的順序電泳，然后進(jìn)行測量之多孔結(jié)構(gòu)Chl-3的照片（左側(cè)） 和每個循環(huán)測量之熒光強(qiáng)度的圖。
[0119] 由實驗結(jié)果可以看出，僅固定有正向引物的多孔結(jié)構(gòu)Chi的核酸擴(kuò)增系數(shù) (factor)更為優(yōu)異，因為其熒光強(qiáng)度顯著高于固定有兩種引物之多孔結(jié)構(gòu)Ch2的熒光強(qiáng)度， 如圖8和圖9中所示。這意味著:與在其中固定兩種引物的情況相比，在其中固定一種引物的 情況下，引物的自由程度更高并且因此反應(yīng)性更高。
[0120] 另外，在圖9左側(cè)所示的電泳結(jié)果中，可以看出Chi和Ch2沒有條帶，而Ch3存在條 帶。這是因為:在Chi和Ch2中引物固定于多孔結(jié)構(gòu)，因此當(dāng)上樣在凝膠上時沒有出現(xiàn)條帶。
[0121] [實驗實施例2]基于引物固定于多孔結(jié)構(gòu)的條件(存在或不存在接頭）的定量PCR 效率比較
[0122] 進(jìn)行以下實驗以基于引物固定于多孔結(jié)構(gòu)的條件比較定量PCR的效率。
[0123] 通過與上述實施例2之制造方法相同的方法以相同方式制造固定有正向引物和反 向引物的多孔結(jié)構(gòu)Chi以及固定有通過接頭連接之正向引物和反向引物的多孔結(jié)構(gòu)Ch2,不 同之處在于:通過用161μ1的TET緩沖液清洗五次除去致孔劑。在此，多孔結(jié)構(gòu)中包含的引物 的量為100μΜ，并且多孔結(jié)構(gòu)的顆粒尺寸為600ym<Xh3中僅包含PCR溶液而不包含本發(fā)明的 多孔結(jié)構(gòu)，并且Ch3用作對照。
[0124] 上述Ch2之固定于正向引物和反向引物的接頭是聚乙二醇(PEG，n = 50)并且該接 頭所固定的正向引物和反向引物如下：
[0125] -與接頭連接的正向引物(長正向引物）：5'-Acrydite_PEG(聚乙二醇，n = 50)_DNA (AAT TAT CGC CAC GTT CGG GCA ATT CGT TA)-3'，
[0126]-與接頭連接的反向引物(長反向引物）：5'-Acrydite-PEG(聚乙二醇，n = 50)-DNA (TCA ΑΤΑ ΑΤΑ CCG GCC TTC AAA TCG GCA TC)-3'。
[0127] 此后，通過與上述實施例3中相同的方法進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)，不同之處在 于:進(jìn)行qPCR，總共90個循環(huán)。圖10中示出了使用CCD照相機(jī)(a)在qPCR之前、（b)在qPCR期間 (第42個循環(huán))和( c)在qPCR之后拍攝的多孔結(jié)構(gòu)的照片。因為隨著循環(huán)數(shù)增加，出現(xiàn)熒光圖 像，所以確認(rèn)了 qPCR的進(jìn)行。另外，每個循環(huán)測量的熒光強(qiáng)度的圖示于圖11中。
[0128] 由圖11中所示的結(jié)果可以看出：作為qPCR的結(jié)果，與在Chi的情況下相比，在其中 引物通過接頭連接于多孔結(jié)構(gòu)之Ch2的情況下熒光強(qiáng)度更高，這是因為與其中引物不通過 接頭連接于多孔結(jié)構(gòu)的Ch 1相比，在多孔結(jié)構(gòu)Ch2中引物的自由程度更高。
[0129] [工業(yè)實用性]
[0130] 根據(jù)本發(fā)明的多孔結(jié)構(gòu)用于多重實時核酸擴(kuò)增（多重實時PCR)，因為其可同時檢 測多種靶核酸并同時對其進(jìn)行實時分析，并且所述多孔結(jié)構(gòu)可用于需要通過同時且快速地 分析很多不同種類的核酸來精確地診斷疾病(例如即時護(hù)理技術(shù)(P0CT))的領(lǐng)域。
【主權(quán)項】
1. 包含孔的多孔結(jié)構(gòu)， 所述多孔結(jié)構(gòu)包含作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物 一個或更多個方向上的引物，所述引物固定于所述孔的內(nèi)部。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔結(jié)構(gòu)，其中所述多孔結(jié)構(gòu)固定有作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物僅一個方向上的引物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔結(jié)構(gòu)，其中所述多孔結(jié)構(gòu)的孔隙率為相對于所述多孔結(jié) 構(gòu)總體積的10體積％至80體積％。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔結(jié)構(gòu)，其中所述多孔結(jié)構(gòu)的顆粒尺寸為10M1至500μπι。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔結(jié)構(gòu)，其中固定于所述多孔結(jié)構(gòu)之孔內(nèi)部的引物在末端 包含丙烯?；渲兴霰；瘜W(xué)固定于所述多孔結(jié)構(gòu)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔結(jié)構(gòu)，其中固定于所述多孔結(jié)構(gòu)之孔內(nèi)部的所述引物中 的一種或更多種引物通過接頭與所述多孔結(jié)構(gòu)連接。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的多孔結(jié)構(gòu)，其中所述接頭的長度為5nm至100nm。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的多孔結(jié)構(gòu)，其還包含以下的一個或更多個:提供 經(jīng)固定引物之信息的編碼物和提供在孔中待擴(kuò)增之核酸的定量信息的熒光標(biāo)志物。9. 用于制造多孔結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括： 制備結(jié)構(gòu)形成溶液，其包含預(yù)聚物、致孔劑以及作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之引物的靶 核酸的正向引物和反向引物一個或更多個方向上的引物； 如下形成液滴形結(jié)構(gòu)：使油通過微通道的一個通道，所述微通道由包括以直角相互交 叉之截面的兩個通道組成，并使如上制備的所述結(jié)構(gòu)形成溶液通過另一通道從而使所述結(jié) 構(gòu)形成溶液分散在交叉截面的油相中； 固化由此形成的結(jié)構(gòu)；以及 通過從經(jīng)固化結(jié)構(gòu)中除去所述致孔劑在所述結(jié)構(gòu)中形成孔。10. 用于制造多孔結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括： 制備結(jié)構(gòu)形成溶液，其包含預(yù)聚物、致孔劑以及作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之引物的靶 核酸的正向引物和反向引物一個或更多個方向上的引物； 通過將如上制備的所述結(jié)構(gòu)形成溶液點樣在陣列上形成液滴形結(jié)構(gòu)； 固化所述結(jié)構(gòu)；以及 通過從經(jīng)固化結(jié)構(gòu)中除去所述致孔劑在所述結(jié)構(gòu)中形成孔。11. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的用于制造多孔結(jié)構(gòu)的方法，其中所述結(jié)構(gòu)形成溶液包含 作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物僅一個方向上的引物。12. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的用于制造多孔結(jié)構(gòu)的方法，其中所述結(jié)構(gòu)形成溶液還包 含以下的一個或更多個:提供經(jīng)固定引物之信息的編碼物和提供待擴(kuò)增核酸之定量信息的 熒光標(biāo)志物。13. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于制造多孔結(jié)構(gòu)的方法，其中所述形成液滴形結(jié)構(gòu)的步驟 包括通過調(diào)整所述油和所述結(jié)構(gòu)形成溶液的相應(yīng)流量來調(diào)整待形成之液滴的尺寸。14. 根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的用于制造多孔結(jié)構(gòu)的方法，其中所述制備結(jié)構(gòu)形成溶液 的步驟還包括通過改變所述溶液中所包含致孔劑的尺寸來調(diào)整將在多孔結(jié)構(gòu)中形成之孔 的尺寸。15. 用于多重實時核酸擴(kuò)增的設(shè)備，其包含： 一個或更多個根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔結(jié)構(gòu)；以及 陣列，其具有以凹陷形式圖案化的表面以便布置所述多孔結(jié)構(gòu)。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的用于多重實時核酸擴(kuò)增的設(shè)備，其包含多個多孔結(jié)構(gòu)，所述 多孔結(jié)構(gòu)包含針對每個不同靶核酸的引物。17. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的用于多重實時核酸擴(kuò)增的設(shè)備，其中根據(jù)其中所包含引物 的種類，一個或更多個多孔結(jié)構(gòu)具有不同的顆粒尺寸。18. 多重實時核酸擴(kuò)增方法，所述方法包括： 將一個或更多個根據(jù)權(quán)利要求1所述的多孔結(jié)構(gòu)注入室中，所述室包含具有以凹陷形 式圖案化之表面的陣列，并將所述多孔結(jié)構(gòu)布置在所述陣列上； 將包含一種或更多種靶核酸的溶液注入用于多重實時核酸擴(kuò)增的設(shè)備的所述室中并 將所述溶液引入所述多孔結(jié)構(gòu)的孔中；以及 通過所述靶核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增所述靶核酸。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的多重實時核酸擴(kuò)增方法，其中所述多孔結(jié)構(gòu)包含作為聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之引物的靶核酸的正向引物和反向引物僅一個方向上的引物，并且包含 靶核酸的所述溶液包含另一種引物。20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的多重實時核酸擴(kuò)增方法，其中一個或更多個所述多孔結(jié)構(gòu) 彼此包含不同的引物。21. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的多重實時核酸擴(kuò)增方法，所述方法還包括伴隨實時擴(kuò)增所 述靶核酸的步驟，同時分析一個或更多個多孔結(jié)構(gòu)的每個中待聚合的核酸。
【文檔編號】C12M1/38GK105992815SQ201480065116
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2014年10月28日
【發(fā)明人】金尚慶, 崔洛源, 李東珍, 鄭勝元
【申請人】韓國科學(xué)技術(shù)研究院