一種萊菔素衍生物的可溶性鹽及其制備方法
【專利摘要】一種萊菔素衍生化合物可溶性鹽的制備方法屬于抗癌化合物領(lǐng)域，尤其是萊菔素?谷胱甘肽結(jié)合物的可溶性鹽的制備方法，萊菔素?谷胱甘肽結(jié)合物通過反應(yīng)形成可溶性鹽極大的提高了萊菔素?谷胱甘肽結(jié)合物的溶解度，從而而已解決給藥過程中萊菔素?谷胱甘肽結(jié)合物藥物濃度偏低的問題。所制備的萊菔素?谷胱甘肽結(jié)合物可溶性鹽，它可以和合理量的藥學上可以接受的輔料制備粉針劑，注射液，乳劑等。
【專利說明】
一種萊菔素衍生物的可溶性鹽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種萊菔素衍生化合物的可溶性鹽及其制備方法，尤其是萊菔素-谷 胱甘肽結(jié)合物的可溶性鹽的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤是機體在各種致癌因素作用下，局部組織的細胞在基因水平上失去對其生長 的正常調(diào)控導致異常增生與分化而形成的新生物。新生物一旦形成，便不再停止生長，他的 生長不受正常機體生理調(diào)節(jié)，而是破壞正常組織與器官，這一點在惡性腫瘤尤其明顯。與良 性腫瘤相比，惡性腫瘤生長速度快，呈浸潤性生長，易發(fā)生出血、壞死、潰瘍等，并常有遠處 轉(zhuǎn)移，造成人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴重的臟器功能受損等，最終造成患 者死亡。
[0003] 腫瘤的治療方法有手術(shù)治療、放射治療和藥物治療（即化療)等，其中化學治療為 目前主要的治療手段。化學治療能治愈一部分腫瘤患者或延長患者的生命，在腫瘤治療中 占有越來越重要地位。但是，傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物對癌癥細胞的殺滅率較低或需要較高的濃 度，因此產(chǎn)生了許多嚴重的毒副反應(yīng)。隨著生活水平的提高，人們對于癌癥的治療預期顯著 提高，希望在治愈癌癥的時候身體健康不受到很大的影響，因此，發(fā)現(xiàn)新的、高效抗腫瘤化 合物顯得尤為迫切。
[0004] 萊菔素是中藥萊菔子中提取的一種天然活性成分，與萊菔硫烷結(jié)構(gòu)相近，也因此 與萊菔硫烷的抗癌效果相近。但是由于其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，無法長期儲存，嚴重限制了其應(yīng)用。 萊菔素可與還原型谷胱甘肽等含巰基類的物質(zhì)結(jié)合，使容易降解的基團被保護起來，并保 留了其抗癌活性，形成了全新的抗癌化合物。本發(fā)明的主要內(nèi)容是研究了一種萊菔素衍生 物可溶性鹽的制備方法，尤其是萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物的可溶性鹽的制備方法，萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物通過反應(yīng)形成可溶性鹽極大的提高了萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物的溶解度， 從而而已解決給藥過程中萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物藥物濃度偏低的問題。
[0005] 本發(fā)明的具體方法和步驟如下：
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種萊菔素衍生物的可溶性鹽的制備方法，尤其是萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物可溶性鹽的制備方法，萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物的化學式為：
[0007]
[0008] 所述的可溶性鹽在制備用于治療人的腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0009] 所述的可溶性鹽在制備用于治療或預防癌癥的藥物中的用途。
[0010] 藥物組合物，包含所述的可溶性鹽以及藥學輔料。
[0011] 所述的藥物組合物，是片劑、膠囊劑、粉針劑、液劑或混懸劑等形式。
[0012] 制備所述的可溶性鹽的方法，其特征在于：
[0013] (1)將萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物溶于1至1000體積倍的去離子水中將其溶解；
[0014] (2)在萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物溶液中加入0.1至10摩爾倍的堿；
[0015] (3)控制溫度在0°C至80°C，攪拌1至120分鐘；
[0016] (4)若反應(yīng)體系固含量大于15%，則加入去離子水，將反應(yīng)液固含量稀釋至5%-15%之間；若反應(yīng)體系固含量小于5%，則通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮反應(yīng)液，至反應(yīng)液固含量為 5%-15% 之間；
[0017] (5)過濾除去不溶性的雜質(zhì)后，向反應(yīng)液中加入0.1至500倍體積的與水互溶的有 機溶劑，控制溫度在50°C至100°C，攪拌lmin至12〇11^11，1°(：/11-50°(：/11降溫至-20至10°(：之 間，保持4_120h結(jié)晶產(chǎn)品；
[0018] (6)過濾后用無水乙醇洗滌，干燥。
[0019]步驟(2)中所描述的堿，可以為氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉，碳酸鈉，碳酸鉀，碳 酸氫鉀等藥學上可接受的無機堿或有機堿
[0020] 所述制備方法中，所加入的與水互溶的有機溶劑可以為乙醇，甲醇，乙腈，異丙醇 等藥學上可接受的有機溶劑。
[0021] 所制備的萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物可溶性鹽，它可以和合理量的藥學上可以接受 的輔料制備粉針劑，注射液，乳劑等。
【附圖說明】
[0022]圖1為化合物的質(zhì)譜圖譜。
[0023]圖2為化合物的紅外圖譜。
[0024] 圖3為化合物的1H-NMR圖譜。
[0025] 圖4為化合物的13C_NMR圖譜。
[0026] 圖5為化合物的制備色譜圖譜。
【具體實施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的描述，但這些實施例的目的并不在于限 制本發(fā)明的保護范圍。
[0028] 實施例1
[0029]將10g萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物溶于125ml去離子水中，向其中加入1.74g碳酸氫 鈉，碳酸氫鈉與萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物摩爾比1:1，50°c下攪拌30min。
[0030] 過濾除去不溶性雜質(zhì)，加入700ml的無水乙醇，控制溫度為75°C攪拌lh，置于梯度 降溫儀中5 °C /h降溫至4°C，4°C下保持72小時。
[0031] 將結(jié)晶析出固體過濾，用l〇〇ml無水乙醇洗滌3次，烘干6.5g，純度為97.5 %的產(chǎn) 品。
[0032] 實施例2
[0033]將5g萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物溶于200ml去離子水中，向其中加入0.83g氫氧化鈉， 氫氧化鈉與萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物摩爾比2:1，室溫下攪拌5min。
[0034]利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50°C，45mbar下旋蒸將反應(yīng)體系濃縮至50ml，過濾除去不溶性雜 質(zhì)，加入300ml的無水甲醇，控制溫度為95°C攪拌lh，置于梯度降溫儀中2°C/h降溫至0°C，0 °C下保持48小時。
[0035] 將結(jié)晶析出固體過濾，用50ml無水乙醇洗滌3次，烘干即得2.3g，純度為96.1 %的 廣品。
[0036] 實施例3
[0037]將15g萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物溶于100ml去離子水中，向其中加入2.14g碳酸鉀， 碳酸鉀與萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物摩爾比〇. 5:1，30°C下攪拌60min。
[0038] 加入去離子水100ml攪拌溶解，過濾除去不溶性雜質(zhì)，加入1000ml的乙腈，控制溫 度為85°C攪拌45min，置于梯度降溫儀中10°C/h降溫至-10°C，10°C下保持24小時。
[0039] 將結(jié)晶析出固體過濾，用150ml無水乙醇洗滌3次，烘干即得7.3g，純度為96.8 %的 廣品。
[0040] 實施例4
[00411將lg萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物溶于l00ml去離子水中，向其中加入0.464g氫氧化 鉀，氫氧化鉀與萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物摩爾比4:1，20°C下攪拌5min。
[0042]用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60°C，50mbar下旋蒸將反應(yīng)體系濃縮至10ml，過濾除去不溶性雜質(zhì)， 加入100ml的無水乙醇，控制溫度為80°C攪拌60min，置于梯度降溫儀中3°C/h降溫至0°C，0 °C下保持72小時。
[0043] 將結(jié)晶析出固體過濾，用10ml無水乙醇洗滌3次，烘干即得0.37g，純度為95.8 %的 廣品。
[0044] 實施例5
[0045]將5g萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物溶于50ml去離子水中，向其中加入l.lg碳酸鈉，碳酸 鈉鉀與萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物摩爾比1:1，50°c下攪拌5min。
[0046] 過濾除去不溶性雜質(zhì)，加入200ml的異丙醇，控制溫度為70°C攪拌30min，置于梯度 降溫儀中5 °C /h降溫至0 °C，0 °C下保持48小時。
[0047] 將結(jié)晶析出固體過濾，用50ml無水乙醇洗滌3次，烘干即得2.7g純度為，95.3%的 廣品。
[0048] 實施例6
[0049] -、材料和方法
[0050] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑：人肺鱗癌細胞系H460購買自美國ATCC細胞庫，培 養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA 常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[00511 2.化合物對H460血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的H460細胞消化成單個細 胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將化合物用無 菌去離子水溶解后，過0.22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II的最終濃度為 ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在Η460細胞接種培養(yǎng)24小時后，換成含有化合物相應(yīng) 濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離子水培養(yǎng)細胞。再分 別培養(yǎng)48小時后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h后，洗凈每孔 中的溶液，分別加入150yL的DMS0,搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長下的吸光度。以0小 時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC50)，實驗結(jié)果數(shù)據(jù) 見表1。
[0052]二、實驗結(jié)果
[0053]表1顯示，化合物對H460人肺鱗癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理48小 時后，化合物對的H460細胞生長的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)為9.116μΜ。
[0054] 實施例7
[0055] -、材料和方法
[0056] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑:人宮頸癌細胞系Hela購買自美國ATCC細胞庫，培 養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA 常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0057] 2.化合物對Hela血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的Hela細胞消化成單個細 胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將化合物用無 菌去離子水溶解后，過0.22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II的最終濃度為 ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在Hela細胞接種培養(yǎng)24小時后，換成含有化合物相應(yīng) 濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離子水培養(yǎng)細胞。再分 別培養(yǎng)48小時后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h后，洗凈每孔 中的溶液，分別加入150yL的DMS0,搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長下的吸光度。以0小 時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC50)，實驗結(jié)果數(shù)據(jù) 見表1。
[0058] 二、實驗結(jié)果
[0059]表1顯示，化合物對Hela人宮頸癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理48小 時后，化合物對的Hela細胞生長的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)為14.92μΜ。
[0060] 實施例8
[0061] -、材料和方法
[0062] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑：人肺癌細胞系Η446購買自美國ATCC細胞庫，培養(yǎng) 在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA常 規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0063] 2.化合物對H446血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的H446細胞消化成單個細 胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將化合物用無 菌去離子水溶解后，過0.22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II的最終濃度為 ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在Η446細胞接種培養(yǎng)24小時后，換成含有化合物相應(yīng) 濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離子水培養(yǎng)細胞。再分 別培養(yǎng)48小時后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h后，洗凈每孔 中的溶液，分別加入150yL的DMS0,搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長下的吸光度。以0小 時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC50)，實驗結(jié)果數(shù)據(jù) 見表1。
[0064] 二、實驗結(jié)果
[0065]表1顯示，化合物對H446人肺癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理48小時 后，化合物對的H446細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC5Q)為6.098μΜ。
[0066] 實施例9 [0067] 一、材料和方法
[0068] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑:人皮膚黑色素瘤細胞系Α375購買自美國ATCC細胞 庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的1^11-1640(取(：1〇1^)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白酶以及 0.02%EDTA常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0069] 2.化合物對A375血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的A375細胞消化成單個細 胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將化合物用無 菌去離子水溶解后，過0.22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II的最終濃度為 ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在Α375細胞接種培養(yǎng)24小時后，換成含有化合物相應(yīng) 濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離子水培養(yǎng)細胞。再分 別培養(yǎng)48小時后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h后，洗凈每孔 中的溶液，分別加入150yL的DMS0,搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長下的吸光度。以0小 時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC50)，實驗結(jié)果數(shù)據(jù) 見表1。
[0070] 二、實驗結(jié)果
[0071] 表1顯示，化合物對A375人皮膚黑色素瘤細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處 理48小時后，化合物對的A375細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC 5Q)為17.515μΜ。
[0072] 實施例10 [0073] 一、材料和方法
[0074] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑:人乳腺癌細胞系MCF-7購買自美國ATCC細胞庫，培 養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA 常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0075] 2.化合物對MCF-7血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的MCF-7細胞消化成單個 細胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將化合物用 無菌去離子水溶解后，過0.22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II的最終濃度 為1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在]\07-7細胞接種培養(yǎng)24小時后，換成含有化合物 相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離子水培養(yǎng)細胞。 再分別培養(yǎng)48小時后，每孔加入20yL MTT，在含有5%0)2的37°(：培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h后，洗凈 每孔中的溶液，分別加入150yL的DMSO，搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長下的吸光度。以 〇小時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度(IC50)，實驗結(jié)果數(shù) 據(jù)見表1。
[0076]二、實驗結(jié)果
[0077]表1顯示，化合物對MCF-7人乳腺癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理48 小時后，化合物對的MCF-7細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC5Q)為9.599μΜ。
[0078] 實施例11
[0079] -、材料和方法
[0080] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑:人非小細胞肺癌細胞系Α549購買自美國ATCC細胞 庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的1^11-1640(取(：1〇1^)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白酶以及 0.02%EDTA常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0081 ] 2.化合物對A549血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的A549細胞消化成單個細 胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將化合物用無 菌去離子水溶解后，過0.22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II的最終濃度為 ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在Α549細胞接種培養(yǎng)24小時后，換成含有化合物相應(yīng) 濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離子水培養(yǎng)細胞。再分 別培養(yǎng)48小時后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h后，洗凈每孔 中的溶液，分別加入150yL的DMS0,搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長下的吸光度。以0小 時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC50)，實驗結(jié)果數(shù)據(jù) 見表1。
[0082] 二、實驗結(jié)果
[0083]表1顯示，化合物對A549人非小細胞肺癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處 理48小時后，化合物對的A549細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC5Q)為9.154μΜ。
[0084] 實施例12
[0085] -、材料和方法
[0086] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑:人非小細胞肺癌細胞系Η1299購買自美國ATCC細 胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的1^11-1640(取(：1〇1^)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白酶以及 0.02%EDTA常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0087] 2.化合物對H1299血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的H1299細胞消化成單個 細胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將化合物用 無菌去離子水溶解后，過0.22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II的最終濃度 為1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在!11299細胞接種培養(yǎng)24小時后，換成含有化合物 相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離子水培養(yǎng)細胞。 再分別培養(yǎng)48小時后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h后，洗凈 每孔中的溶液，分別加入150yL的DMS0，搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長下的吸光度。以 〇小時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度(IC50)，實驗結(jié)果數(shù) 據(jù)見表1。
[0088] 二、實驗結(jié)果
[0089]表1顯示，化合物對H1299人非小細胞肺癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。 處理48小時后，化合物對的H1299細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC5Q)為8.333μΜ。
[0090] 實施例13
[0091] -、材料和方法
[0092] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑:人肝癌細胞系HepG2購買自美國ATCC細胞庫，培養(yǎng) 在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白酶以及0.02%EDTA常 規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0093] 2.化合物對HepG2血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的HepG2細胞消化成單個 細胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將化合物用 無菌去離子水溶解后，過0.22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II的最終濃度 為1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在他?62細胞接種培養(yǎng)24小時后，換成含有化合物 相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離子水培養(yǎng)細胞。 再分別培養(yǎng)48小時后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h后，洗凈 每孔中的溶液，分別加入150yL的DMS0，搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長下的吸光度。以 〇小時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度(IC50)，實驗結(jié)果數(shù) 據(jù)見表1。
[0094] 二、實驗結(jié)果
[0095]表1顯示，化合物對HepG2人肝癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理48小 時后，化合物對的IfepG2細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC5Q)為8.776μΜ。
[0096] 實施例14
[0097] 一、材料和方法
[0098] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑:人TNBC亞型的乳腺癌細胞系MDA-MB-453購買自美 國ATCC細胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白 酶以及0.02%EDTA常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0099] 2.化合物對MDA-MB-453血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的MDA-MB-453細胞 消化成單個細胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 將化合物用無菌去離子水溶解后，過〇. 22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II 的最終濃度為1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在]\?從-]\?-453細胞接種培養(yǎng)24小時后， 換成含有化合物相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離 子水培養(yǎng)細胞。再分別培養(yǎng)72小時后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°C培養(yǎng)箱繼續(xù) 孵育3h后，洗凈每孔中的溶液，分別加入150yL的DMSO，搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長 下的吸光度。以〇小時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度 (IC50)，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。
[0100] 二、實驗結(jié)果
[0101]表1顯示，化合物對MDA-MB-453人肝癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理 72小時后，化合物對的MDA-MB-453細胞生長的半數(shù)抑制濃度(IC5Q)為3.08μΜ。
[0102] 實施例15
[0103] 一、材料和方法
[0104] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑:人TNBC亞型的乳腺癌細胞系MDA-MB-231購買自美 國ATCC細胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白 酶以及0.02%EDTA常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0105] 2.化合物對MDA-MB-231血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞 消化成單個細胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 將化合物用無菌去離子水溶解后，過〇. 22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II 的最終濃度為1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在]\?從-]\?-231細胞接種培養(yǎng)24小時后， 換成含有化合物相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離 子水培養(yǎng)細胞。再分別培養(yǎng)72小時后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°C培養(yǎng)箱繼續(xù) 孵育3h后，洗凈每孔中的溶液，分別加入150yL的DMS0，搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長 下的吸光度。以〇小時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度 (IC50)，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。
[0106] 二、實驗結(jié)果
[0107] 表1顯示，化合物對MDA-MB-231人肝癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理 72小時后，化合物對的MDA-MB-231細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC 5Q)為8.71μΜ。
[0108] 實施例16 [0109] 一、材料和方法
[0110] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑:人TNBC亞型的乳腺癌細胞系MDA-MB-436購買自美 國ATCC細胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白 酶以及0.02%EDTA常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0111] 2.化合物對MDA-MB-436血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的MDA-MB-436細胞 消化成單個細胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 將化合物用無菌去離子水溶解后，過〇. 22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II 的最終濃度為1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在]\?從-]\?-436細胞接種培養(yǎng)24小時后， 換成含有化合物相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離 子水培養(yǎng)細胞。再分別培養(yǎng)72小時后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°C培養(yǎng)箱繼續(xù) 孵育3h后，洗凈每孔中的溶液，分別加入150yL的DMSO，搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長 下的吸光度。以〇小時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度 (IC50)，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。
[0112] 二、實驗結(jié)果
[0113] 表1顯示，化合物對MDA-MB-436人肝癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理 72小時后，化合物對的MDA-MB-436細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC 5Q)為3.45μΜ。
[0114] 實施例17
[0115] -、材料和方法
[0116] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑:人TNBC亞型的乳腺癌細胞系MDA-MB-468購買自美 國ATCC細胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白 酶以及0.02%EDTA常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0117] 2.化合物對MDA-MB-468血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的MDA-MB-468細胞 消化成單個細胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 將化合物用無菌去離子水溶解后，過〇. 22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II 的最終濃度為1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在]\?從-]\?-468細胞接種培養(yǎng)24小時后， 換成含有化合物相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離 子水培養(yǎng)細胞。再分別培養(yǎng)72小時后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°C培養(yǎng)箱繼續(xù) 孵育3h后，洗凈每孔中的溶液，分別加入150yL的DMSO，搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長 下的吸光度。以〇小時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度 (IC50)，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。
[0118] 二、實驗結(jié)果
[0119] 表1顯示，化合物對MDA-MB-468人肝癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理 72小時后，化合物對的MDA-MB-468細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC 5Q)為3.59μΜ。
[0120] 實施例18
[0121] -、材料和方法
[0122] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑:人ER+亞型的乳腺癌細胞系MCF-7購買自美國ATCC 細胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白酶以及 0.02%EDTA常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0123] 2.化合物對MCF-7血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的MCF-7細胞消化成單個 細胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將化合物用 無菌去離子水溶解后，過0.22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II的最終濃度 為1以]?、2以]\1、3以]\1、5以]\1、1(^]\1、2(^]\1和5(^]\1，在]\0 7-7細胞接種培養(yǎng)24小時后，換成含有化合物 相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離子水培養(yǎng)細胞。 再分別培養(yǎng)72小時后，每孔加入20yL ΜΤΤ，在含有5%0)2的37°(：培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h后，洗凈 每孔中的溶液，分別加入150yL的DMSO，搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長下的吸光度。以 〇小時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度(IC50)，實驗結(jié)果數(shù) 據(jù)見表1。
[0124] 二、實驗結(jié)果
[0125] 表1顯示，化合物對MCF-7人肝癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理72小 時后，化合物對的MCF-7細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC 5Q)為3.48μΜ。
[0126] 實施例19
[0127] 一、材料和方法
[0128] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑：人ER+亞型的乳腺癌細胞系ZR-75-1購買自美國 ATCC細胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白酶 以及0.02%EDTA常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0129] 2.化合物對ZR-75-1血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的ZR-75-1細胞消化成 單個細胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將化合 物用無菌去離子水溶解后，過0.22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II的最終 濃度為ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在ZR-75-1細胞接種培養(yǎng)24小時后，換成含有 化合物相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離子水培養(yǎng) 細胞。再分別培養(yǎng)72小時后，每孔加入20yL MTT，在含有5^^02的37°(：培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h 后，洗凈每孔中的溶液，分別加入150yL的DMSO，搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長下的吸 光度。以〇小時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC50 )，實 驗結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。
[0130]二、實驗結(jié)果
[0131] 表1顯示，化合物對ZR-75-1人肝癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理72 小時后，化合物對的ZR-75-1細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC 5Q)為2.82μΜ。
[0132] 實施例20
[0133] 一、材料和方法
[0134] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑：人ER+亞型的乳腺癌細胞系ZR-75-1購買自美國 ATCC細胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白酶 以及0.02%EDTA常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0135] 2.化合物對ZR-75-1血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的ZR-75-1細胞消化成 單個細胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將化合 物用無菌去離子水溶解后，過0.22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II的最終 濃度為ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在ZR-75-1細胞接種培養(yǎng)24小時后，換成含有 化合物相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離子水培養(yǎng) 細胞。再分別培養(yǎng)72小時后，每孔加入20yL MTT，在含有5^^02的37°(：培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h 后，洗凈每孔中的溶液，分別加入150yL的DMS0，搖床震蕩lOmin，測定每孔490nm波長下的吸 光度。以〇小時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC50 )，實 驗結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。
[0136] 二、實驗結(jié)果
[0137] 表1顯示，化合物對ZR-75-1人肝癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理72 小時后，化合物對的ZR-75-1細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC 5Q)為2.82μΜ。
[0138] 實施例21
[0139] -、材料和方法
[0140] 1.實驗細胞系和相關(guān)化學試劑:人HER2+亞型的乳腺癌細胞系Sk-br-3購買自美國 ATCC細胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640(HyClone)培養(yǎng)基中，用0.25%胰蛋白酶 以及0.02%EDTA常規(guī)消化后傳代。本實驗相關(guān)化學試劑皆購自Sigma公司。
[0141 ] 2.化合物對Sk-br-3血細胞的體外抑制實驗:取對數(shù)生長期的Sk-br-3細胞消化成 單個細胞后，接種于96孔板中，每孔3000個細胞，在含5 % 0)2的37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將化合 物用無菌去離子水溶解后，過0.22μπι濾膜除菌，用含血清培養(yǎng)液稀釋，使得結(jié)合物II的最終 濃度為ΙμΜ、2μΜ、3μΜ、5μΜ、ΙΟμΜ、20μΜ和50μΜ，在sk-br-3細胞接種培養(yǎng)24小時后，換成含有 化合物相應(yīng)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，陰性對照組培養(yǎng)基中加入等體積的無菌去離子水培養(yǎng) 細胞。再分別培養(yǎng)72小時后，每孔加入20yL MTT，在含有5^^02的37°(：培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3h 后，洗凈每孔中的溶液，分別加入150yL的DMS0，搖床震蕩10min，測定每孔490nm波長下的吸 光度。以〇小時的陰性對照組存活細胞數(shù)為基準，計算細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC50 )，實 驗結(jié)果數(shù)據(jù)見表1。
[0142] 二、實驗結(jié)果
[0143] 表1顯示，化合物對Sk-br-3人肝癌細胞的生長增值具有顯著的抑制效果。處理72 小時后，化合物對的Sk-br-3細胞生長的半數(shù)抑制濃度（IC5Q)為2.82μΜ。
[0144] 表1為結(jié)構(gòu)式II在多種腫瘤細胞中的48小時的1(：50值
[0145] 表2為結(jié)構(gòu)式II在不同亞型乳腺癌中72小時的1(：50值
[0146] 表1
[0147]
【主權(quán)項】
1. 一種萊菔素衍生物的可溶性鹽，其化學式如下：2. 權(quán)利要求1所述的化合物在制備用于治療人的腫瘤的藥物中的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的化合物在制備用于治療或預防癌癥的藥物中的用途。4. 藥物組合物，包含權(quán)利要求1所述的化合物以及藥學輔料。5. 按照權(quán)利要求4所述的藥物組合物，是片劑、膠囊劑、粉針劑、液劑或混懸劑形式。6. 制備如權(quán)利要求1所述的一種萊菔素衍生物的方法，其特征在于： (1) 將萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物溶于1至1000體積倍的去離子水中將其溶解； (2) 在萊菔素-谷胱甘肽結(jié)合物溶液中加入0.1至10摩爾倍的堿； (3) 控制溫度在0 °C至80 °C，攪拌1至120分鐘； (4) 若反應(yīng)體系固含量大于15%，則加入去離子水，將反應(yīng)液固含量稀釋至5%-15%之 間；若反應(yīng)體系固含量小于5 %，則通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮反應(yīng)液，至反應(yīng)液固含量為5 % -15%之間； (5) 過濾除去不溶性的雜質(zhì)后，向反應(yīng)液中加入0.1至500倍體積的與水互溶的有機溶 劑，控制溫度在50°C至100°C，攪拌Imin至12〇11^11，1°(：/11-50°(：/11降溫至-20至10°(：之間，保 持4-120h結(jié)晶產(chǎn)品； (6) 過濾后用無水乙醇洗滌，干燥。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:有機溶劑為乙醇，甲醇，乙腈或異丙醇。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:堿為氫氧化鈉，氫氧化鉀，碳酸氫鈉，碳酸 鈉，碳酸鉀或碳酸氫鉀。
【文檔編號】A61K31/145GK106008663SQ201610320397
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月15日
【發(fā)明人】袁其朋, 王忠鵬, 程立, 姚越, 田桂芳, 況鵬群, 任萌, 劉玉婷
【申請人】北京化工大學