苦蘵苦素i及提取方法及用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了苦蘵苦素I及提取方法及用途，苦蘵苦素I是具有式(I)的結(jié)構(gòu)：本發(fā)明的苦蘵苦素I能有效地抑制一氧化氮(NO)的釋放，提示本發(fā)明化合物可作為抗炎的藥物?？嗵u苦素I能有效地抑制腫瘤活性。
【專利說明】
苦藤苦素 I及提取方法及用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及中藥提取領(lǐng)域，涉及苦藤苦素 I及提取方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]苦藤(Physalis angulata L.)，又稱燈籠草、天泡子、天泡草、樸樸草、打額泡等， 為前科(Solanaceae)酸衆(zhòng)屬(Physalis)-年生草本植物?！蛾懘ū静荨泛汀吨腥A本草》對苦藤 的藥用功效有著詳細(xì)的記載，苦藤具有行氣，消脹，利尿，治腹脹，清熱解毒，利尿止血，消腫 散結(jié)，可用于治療咽喉腫痛，肺癰，腮腺炎;小便不利，血尿牙齦腫痛，天皰瘡等疾病。民間多 用于治療皰瘡、牙齦腫痛、濕熱黃疸、咽喉紅腫疼痛、肺熱咳嗽等疾病。國內(nèi)外學(xué)者通過體 內(nèi)、體外實驗證實了苦藤的抗炎（Choi, E.M.;et al.Investigations of antiinflammatory and antinociceptive activities of Piper cubeba,Physalis angulata and Rosa hybrida. Journal of Ethnopharmacology 2003,89,171-175.)、抗腫瘤（He,H·; et al.Physalin A induces apoptotic cell death and protective autophagy in HT1080human fibrosarcoma cells.Journal of Natural Products,2013,76,880-888.)n 抗菌（Si lva，M · T · G · ; et al. Studies on antimicrobial activity , in vitro , of Physalis angulata L.(Solanaceae)fraction and physalin B bringing out the importance of assay determination.Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 2005, 100,779-782·)、抗氧化（Choi,E.M.;et al.Effect of some medicinal plants on plasma antioxidant system and lipid levels in rats.Phytotherapy research · 2005，19，382-386 ·)等作用。
[0003] 但從苦藤中提取苦藤苦素 I，提取方法，及用途尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供苦藤苦素 I。
[0005] 本發(fā)明的第二個目的是提供苦藤苦素 I的提取方法。
[0006] 本發(fā)明的第三個目的是提供苦藤苦素 I的用途。
[0007] 本發(fā)明的第四個目的是提供包含權(quán)利要求1的苦藤苦素 I的苦藤提取物。
[0008] 本發(fā)明的第五個目的是提供苦藤提取物的用途。
[0009] 本發(fā)明的第六個目的是提供含苦藤苦素 I的藥物組合物。
[0010] 本發(fā)明的第七個目的是提供上述藥物組合物的用途。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0012] 苦藤苦素 I，具有式(I)的結(jié)構(gòu)：
[0013]
[0014] 苦藤苦素 I的提取方法，包括如下步驟：
[0015] (1)以苦藤的干燥莖葉為原料，加入原料8-10質(zhì)量倍的體積分?jǐn)?shù)為60 %-80%乙醇 水溶液，回流提取2-3次，每次提取2-3小時，合并得到提取液，減壓回收溶劑，濃縮后得到總 浸膏；
[0016] (2)將總浸膏分散到5-10質(zhì)量倍的水中，依次用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸 乙酯萃取液減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯層浸膏；
[0017] (3)乙酸乙酯層浸膏經(jīng)硅膠柱色譜分離，以體積比分別為100:1、50:1和30:1的二 氯甲烷一甲醇為洗脫劑梯度洗脫，得到餾分Fr. 1、Fr. 2、Fr. 3;
[0018] (4)餾分Fr. 3經(jīng)硅膠柱色譜分離，以體積比分別為10:1、8:1和6:1的石油醚一丙酮 為洗脫劑梯度洗脫，得到餾分Fr. 3-1、Fr. 3-2、Fr. 3-3;
[0019] (5)餾分Fr.3-3經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，以體積比為1:1的二氯甲烷-甲醇 為洗脫劑等度洗脫，得到餾分Fr. 3-3-1和Fr. 3-3-2;
[0020] (6)餾分Fr. 3-3-2經(jīng)0DS柱色譜分離，以體積比為1: 9、3 : 7、5:5和8: 2的甲醇-水為 洗脫劑梯度洗脫，得到饋分Fr · 3H-1、Fr · 3m、Fr · 3H-3和Fr · 3-3H;
[0021] (7)餾分Fr.3-3-2-4經(jīng)硅膠制備薄層色譜分離，以體積比為1:1的二氯甲烷一丙酮 為展開劑進(jìn)行制備，得到餾分Fr. 3-3-2-4-1;
[0022] (8)餾分Fr.3-3-2-4-1經(jīng)制備HPLC色譜，以體積比為1:1的甲醇-水為流動相，進(jìn)行 純化，得到式I所示苦藤苦素 I。
[0023] 苦藤苦素 I在制備抗腫瘤藥物和在制備抑制細(xì)胞釋放N0藥物中的應(yīng)用。
[0024]包含苦藤苦素 I的苦藤提取物。
[0025] 苦藤提取物在制備抗腫瘤藥物和在制備抑制細(xì)胞釋放N0藥物中的應(yīng)用。
[0026] -種藥物組合物，包含苦藤苦素 I或其藥學(xué)上可接受的鹽，和藥學(xué)上可接受的載體 和/或賦形劑。
[0027] 上述藥物組合物在制備抗腫瘤藥物和在制備抑制細(xì)胞釋放N0藥物中的應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明的優(yōu)點：
[0029] 本發(fā)明的苦藤苦素 I能有效地抑制一氧化氮(N0)的釋放，提示本發(fā)明化合物可作 為抗炎的藥物?？嗵倏嗨?I能有效地抑制腫瘤活性。
【具體實施方式】
[0030] 下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行描述，所描述的實施例僅僅是本 發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在 沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0031] 實施例1
[0032]苦藤苦素 I的提取方法，包括如下步驟：
[0033] (1)以苦藤(Physalis angulata L.)的干燥莖葉（9.5kg)為原料，加入原料9質(zhì)量 倍的體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2小時，合并得到提取液，減壓回 收溶劑，濃縮后得到總浸膏（1370g);
[0034] (2)將總浸膏分散到5質(zhì)量倍的水中，依次用等體積石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取， 乙酸乙酯萃取液減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯層浸膏116g;
[0035] (3)乙酸乙酯層浸膏經(jīng)硅膠柱色譜分離，以體積比分別為100:1、50:1和30:1的二 氯甲烷一甲醇為洗脫劑梯度洗脫，得到餾分Fr.l、Fr.2、Fr.3(35g);
[0036] (4)餾分Fr. 3經(jīng)硅膠柱色譜分離，以體積比分別為10:1、8:1和6:1的石油醚一丙酮 為洗脫劑梯度洗脫，得到餾分Fr. 3-1、Fr. 3-2、Fr. 3-3(4.2g);
[0037] (5)餾分Fr.3-3經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，以體積比為1:1的二氯甲烷-甲醇 為洗脫劑等度洗脫，得到餾分Fr. 3-3-1和Fr. 3-3-2 (600mg);
[0038] (6)餾分Fr. 3-3-2經(jīng)0DS柱色譜分離，以體積比為1: 9、3 : 7、5:5和8: 2的甲醇-水為 洗脫劑梯度洗脫，得到餾分Fr · 3-3-2-1、Fr · 3-3-2-2、Fr · 3-3-2-3和Fr · 3-3-2-4( 500mg);
[0039] (7)餾分Fr.3-3-2-4經(jīng)硅膠制備薄層色譜分離，以體積比為1:1的二氯甲烷一丙酮 為展開劑進(jìn)行制備，得到餾分Fr. 3-3-2-4-1;
[0040] (8)餾分Fr.3-3-2-4-1經(jīng)制備HPLC色譜，以體積比為1:1的甲醇-水為流動相，進(jìn)行 純化，得到化合物1(17mg)。
[0041 ] 化合物1的物理化學(xué)和常數(shù)如下：
[0042] 化合物 1:無定型粉末；Μ;; +80.0(c 0.1，Me0H);UV(Me0H)Amax(l〇ge)208(1.4)， 220(4.0)nm;IR(KBr)v max 3395,2921,2850,1740,1712,1647,1467,1382,1228,113401150) (MeOH)nm(Δε)247(+5.9),294(-1.1)；HRESIME m/z 581.2726[M+Na]+(calcd for C3iH42〇9Na，581 · 2727)，確定化合物 1 的分子式為C31H42O9; ^GOOMHz，pyridine-d5)和 13C-NMR (100MHz，pyridine_d5)數(shù)據(jù)表 1 〇
[0043] 表1化合物1的碳譜和氫譜數(shù)據(jù)
[0044]
[0045] 注 ^H-NMRJOOMHz，pyridine_d5; 13C_NMR，100MHz，pyridine_d5〇
[0046] 通過理化常數(shù)和現(xiàn)代波譜學(xué)手段(MS和NMR)，結(jié)合文獻(xiàn)相關(guān)數(shù)據(jù)，鑒定它的結(jié)構(gòu)， 化合物1為未見文獻(xiàn)報道的新化合物，如下所示：
[0047
[0048] 實施例2
[0049] 苦藤苦素 I的提取方法，包括如下步驟：
[0050] (1)以苦藤的干燥莖葉為原料，加入原料8質(zhì)量倍的體積分?jǐn)?shù)為80 %乙醇水溶液， 回流提取3次，每次提取2小時，合并得到提取液，減壓回收溶劑，濃縮后得到總浸膏；
[0051] (2)將總浸膏分散到5質(zhì)量倍的水中，依次用等體積石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取， 乙酸乙酯萃取液減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯層浸膏；
[0052] (3)-(8)同實施例1(3)_(8)。
[0053] 實施例3
[0054] 苦藤苦素 I的提取方法，包括如下步驟：
[0055] (1)以苦藤的干燥莖葉為原料，加入原料10質(zhì)量倍的體積分?jǐn)?shù)為60 %乙醇水溶液， 回流提取3次，每次提取2小時，合并得到提取液，減壓回收溶劑，濃縮后得到總浸膏；
[0056] (2)將總浸膏分散到10質(zhì)量倍的水中，依次用等體積石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取， 乙酸乙酯萃取液減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯層浸膏；
[0057] (3)-(8)同實施例1(3)_(8)。
[0058] 實施例4
[0059] 苦藤苦素 I抗腫瘤活性檢測
[0060] 采用MTT方法，對苦藤苦素 I進(jìn)行活性檢測，以人前列腺癌細(xì)胞(C4-2B和22Rvl)，人 腎癌細(xì)胞（786-0，A-498和ACHN)，人黑色素瘤細(xì)胞(A375-S2)為例。上述細(xì)胞均來購置于 ATCCOJSA，電話:800-638-6597，購買時間2014年9 月）
[0061] 取處于對數(shù)生長期的上述細(xì)胞100yL，每孔2X104接種于96孔板中，置⑶ 2培養(yǎng)箱 (37°C，5%C02,飽和濕度)培養(yǎng)。
[0062] 12小時后加藥(苦藤苦素 Ι)10μL7孔，樣品的工作液用含10%熱滅活(56°C，30min) 胎牛血清（Gibco，USA)、100U/mL青霉素鈉(Gibco，USA)、100yg/mL鏈霉素（Gibco，USA)的 RPMI 1640(Gibco，USA)或 EMEM(Gibco，USA)培養(yǎng)基液稀釋至終濃度分別為 10，5，2 · 5，1 · 25， 0.625，0.3125，0.15625μΜ，加樣組及空白組均設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，加入MTT工作 液，20μ!7孔，3小時后，棄去培養(yǎng)基，加入DMS0 150μ!7孔，平板搖床上500rpm震搖3分鐘，用 酶標(biāo)儀測定各孔的0D值，測定波長為490nm，計算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=(空白 對照組0D值-給藥組0D值)/空白對照組0D值X 100%。以上實驗均重復(fù)三次，活性結(jié)果（IC50) 見表2。
[0063]表2苦藤苦素 I的抗腫瘤活性結(jié)果（IC5Q，yM)
[0064]
[0065] 實施例5
[0066]苦藤苦素 I抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7釋放一氧化氮(N0)的活性測試 [0067] 小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7(ATCC)培養(yǎng)于含10%熱滅活（56°C，30min)胎牛血清 (Gibco)、100U/mL 青霉素鈉(Gibco)、100yg/mL 鏈霉素(Gibco)的 RPMI 1640(Gibco)培養(yǎng)液 中，37°C，5 %C02的恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長。由于N0極不穩(wěn)定，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液內(nèi)很快代 謝成亞硝酸基（NOf)，故采用Griess法測定樣品中NOf的濃度作為衡量N0水平的指標(biāo)。 Griess 試劑 A: 0 · 1 %N_ 萘乙二胺鹽酸鹽(naphthylethylenediaminedihydrochloride)溶于 水中；Griess試劑B: 1 %對氨基苯磺酰胺（sulphanilamide)溶于5%H3P〇4中。使用前等體積 混合試劑4和1用1?^1 1640培養(yǎng)液將1^1 264.7細(xì)胞稀釋至5\105〇6118/1^濃度，接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200100yL細(xì)胞懸浮液。C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh后，每孔加入脂多 糖（lipopolysaccharide，LPS)(Sigma)(終濃度lyg/mL)和DMSO溶解的不同濃度的測試樣品 0.4yL，同時設(shè)LPS組(加入LPS，但不加入測試樣品，對NO釋放的抑制率為0% )和空白對照組 (不加入LPS和測試樣品，僅加入0.4yL DMS0，對NO釋放的抑制率為100 % )，每個樣品設(shè)4個 平行孔。在37°C，5%C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，吸取100yL培養(yǎng)液上清至酶標(biāo)板中，離心 (1000 Xg，4°C，3min)，加入100yL Griess試劑，室溫避光反應(yīng)lOmin，于酶標(biāo)儀測定其540nm 處吸光值。用濃度分別為1、5、10、50ym〇VL的NaN02繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)NaN02標(biāo)準(zhǔn)曲線細(xì)胞 培養(yǎng)上清液中NOf的濃度進(jìn)而計算測試樣品對NO釋放的抑制率。
[0068]表3化合物的抑制N0釋放結(jié)果
[0069]
[0070] 含有本發(fā)明所述化合物的組合物的抗炎藥物可以為適用于口服或注射等應(yīng)用形 式，例如，按常規(guī)技術(shù)，加入藥物可接受的載體和/或賦形劑制成片劑、膠囊劑、粉劑、糖漿 劑、針劑等。
[0071 ]化合物具有藥理活性，因此，含有該化合物的組合物也具有藥理活性。
[0072] 以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其中心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對 于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干 改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)。
[0073] 本發(fā)明的苦藤苦素 I、含苦藤苦素 I的提取物、含苦藤苦素 I的組合物能制備治療一 氧化氮代謝異常相關(guān)聯(lián)疾病的藥物。
[0074] 其相關(guān)聯(lián)的疾病包括:全身炎癥反應(yīng)綜合癥、高血壓、腦血栓、心力衰竭、肝硬化、 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、急性胰腺炎、腹膜炎、膽囊炎、闌尾炎、 糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮炎肌、銀肩病、急性髓性白血病、帕金森癥、早老性癡呆、抑郁 癥、敗血癥、慢性阻塞性肺炎、哮喘、急性胰腺炎、中樞神經(jīng)損傷等。其次，N0代謝異常還與癌 變及癌組織的增生有關(guān)，高濃度的N0也會誘發(fā)基因突變和腫瘤，上述化合物可以抑制N0釋 放，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。適用的腫瘤例子包括但不限于:各種實體腫瘤和白血病，如肺 癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌、子宮頸癌、黑色素 瘤、睪丸癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、膽管癌、絨毛膜癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)纖維瘤、纖維肉瘤、淋 巴管瘤等。
【主權(quán)項】
1. 苦藤苦素 I，其特征是具有式(I)的結(jié)構(gòu)：2. 權(quán)利要求1所述苦藤苦素 I的提取方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 以苦藤的干燥莖葉為原料，加入原料8-10質(zhì)量倍的體積分?jǐn)?shù)為60% -80 %乙醇水溶 液，回流提取2-3次，每次提取2-3小時，合并得到提取液，減壓回收溶劑，濃縮后得到總浸 膏； (2) 將總浸膏分散到5-10質(zhì)量倍的水中，依次用石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯 萃取液減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯層浸膏； (3) 乙酸乙酯層浸膏經(jīng)硅膠柱色譜分離，以體積比分別為100:1、50:1和30:1的二氯甲 烷一甲醇為洗脫劑梯度洗脫，得到餾分Fr. I、Fr. 2、Fr. 3; (4) 餾分Fr. 3經(jīng)硅膠柱色譜分離，以體積比分別為10:1、8:1和6:1的石油醚一丙酮為洗 脫劑梯度洗脫，得到餾分Fr. 3-1、Fr. 3-2、Fr. 3-3; (5) 餾分Fr.3-3經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜分離，以體積比為1:1的二氯甲烷-甲醇為洗 脫劑等度洗脫，得到餾分Fr. 3-3-1和Fr. 3-3-2; (6) 餾分Fr. 3-3-2經(jīng)ODS柱色譜分離，以體積比為1:9、3: 7、5: 5和8: 2的甲醇-水為洗脫 劑梯度洗脫，得到饋分Fr · 3H-1、Fr · 3m、Fr · 3-3?和Fr · 3-3H; (7) 餾分Fr.3-3-2-4經(jīng)硅膠制備薄層色譜分離，以體積比為1:1的二氯甲烷一丙酮為展 開劑進(jìn)行制備，得到餾分Fr. 3-3-2-4-1; (8) 餾分Fr. 3-3-2-4-1經(jīng)制備HPLC色譜，以體積比為1:1的甲醇-水為流動相，進(jìn)行純 化，得到式I所示苦藤苦素 I。3. 權(quán)利要求1的苦藤苦素 I在制備抗腫瘤藥物和在制備抑制細(xì)胞釋放NO藥物中的應(yīng)用。4. 包含苦藤苦素 I的苦藤提取物。5. 權(quán)利要求4的苦藤提取物在制備抗腫瘤藥物和在制備抑制細(xì)胞釋放NO藥物中的應(yīng) 用。6. -種藥物組合物，其特征是包含苦藤苦素 I或其藥學(xué)上可接受的鹽，和藥學(xué)上可接受 的載體和/或賦形劑。7. 權(quán)利要求6的藥物組合物在制備抗腫瘤藥物和在制備抑制細(xì)胞釋放NO藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號】A61P1/00GK106008657SQ201610341691
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】邱峰, 孫成鵬, 陳麗霞, 康寧
【申請人】天津中醫(yī)藥大學(xué)