一種從三角帆蚌的蚌肉中提取純化sod凍干粉的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從三角帆蚌的蚌肉中提取純化SOD凍干粉的方法，將三角帆蚌軟體組織破碎后，經(jīng)過(guò)勻漿、超濾、鹽析、超濾、熱變性、柱層析、脫鹽與濃縮、凍干等工序，最后得到SOD凍干粉產(chǎn)品。本發(fā)明使用珍珠采收后的蚌肉組織做原料，在沉淀雜蛋白時(shí)采用無(wú)機(jī)鹽，沉淀效果好，省時(shí)省力，適于規(guī)?；a(chǎn)。
【專利說(shuō)明】
_種從三角帆蛛的蛛肉中提取純化SOD凍干粉的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物工程的技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種珍珠加工下腳料一一三角帆蚌蚌肉中提取、純化超氧化物歧化酶SOD的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，S0D)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)，能清除生物體內(nèi)的超氧陰離子自由基(02—)，維持機(jī)體中自由基產(chǎn)生和清除動(dòng)態(tài)平衡的一種金屬酶，具有抗輻射損傷、抗衰老和抗癌等重要作用。目前，不同來(lái)源的SOD已被應(yīng)用于治療炎癥、自身免疫性疾病、肺水腫、腫瘤等疾病的診治，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品和化妝品等眾多領(lǐng)域。
[0003]自1969年首次從牛紅細(xì)胞中分離出SOD以來(lái)，人們相繼從動(dòng)植物和微生物中分離和純化出了S0D。但由于瘋牛病等疾病的影響，陸生動(dòng)物血液等組織來(lái)源的SOD提取及其應(yīng)用受到了很大的限制，從植物和微生物中提取SOD的方法多采用分步鹽析、有機(jī)溶劑和層析等方法，這些方法普遍存在生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。從水產(chǎn)品中提取純化SOD的報(bào)道相對(duì)較少，牡蠣等海產(chǎn)貝類由于個(gè)體小且本身經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，利用這些海產(chǎn)貝類難以大規(guī)模提取S0D。而利用珍珠采收后豐富的蚌肉廢棄物資源進(jìn)行SOD提取純化與應(yīng)用則更少見(jiàn)報(bào)道。
[0004]我國(guó)是淡水珍珠養(yǎng)殖大國(guó)，三角帆蛛(//jpr1sis是我國(guó)特有的淡水育珠蚌，由該蚌生產(chǎn)的珍珠占國(guó)際珍珠總產(chǎn)量的近90%。三角帆蚌多在1-2齡左右進(jìn)行植珠，經(jīng)3-4年養(yǎng)殖后采收珍珠，單個(gè)蚌體可達(dá)Ikg左右，殺蚌采珠后會(huì)產(chǎn)生大量的蚌肉:以年產(chǎn)約1000噸珍珠估算，蚌肉可達(dá)2-3萬(wàn)噸。但目前蚌肉資源除了進(jìn)行簡(jiǎn)單加工做飼料等用途外，大部分被采珠同時(shí)直接攪碎排放，不僅極大地浪費(fèi)了蚌肉資源，還嚴(yán)重污染了環(huán)境。蚌肉營(yíng)養(yǎng)豐富，除含有豐富的蛋白質(zhì)外，還含用超氧化物歧化酶(SOD)等生物活性物質(zhì)，對(duì)蚌肉進(jìn)行SOD的提取和利用將極大提高珍珠養(yǎng)殖的附加值、減少環(huán)境污染，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供了一種從三角帆蚌蚌肉中提取、純化SOD凍干粉的方法，使用珍珠采收后的蚌肉組織做原料，在沉淀雜蛋白時(shí)采用無(wú)機(jī)鹽，沉淀效果好，省時(shí)省力，適于規(guī)?；a(chǎn)。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種從三角帆蚌的蚌肉中提取純化SOD凍干粉的方法，包括以下步驟:將三角帆蚌軟體組織破碎后，經(jīng)過(guò)勻漿、超濾、鹽析、超濾、熱變性、柱層析、脫鹽、濃縮和凍干，最后得到SOD凍干粉產(chǎn)品。
[0007]所述從三角帆蚌的蚌肉中提取純化SOD凍干粉的方法，包括以下步驟:
(I)勻漿:收集珍珠采集后的三角帆蚌，挖取所有蚌肉稱重，以蚌肉和勻漿緩沖液I: I的比例混勻，用高速勻漿機(jī)勻漿，攪拌0.5-lh，離心去碎組織細(xì)胞碎片，取上清液；
(2)超濾:將步驟(I)中的上清液用可截留分子量為45kDa的聚醚砜超濾膜進(jìn)行超濾，取濾液；
(3)鹽析:將超濾液用硫酸銨進(jìn)行鹽析分離，4°C靜置2-3h，1000g離心15-20min，收集沉淀；
(4)二次超濾:將沉淀物用蒸餾水溶解，用可截留分子量為5-8kDa的聚醚砜超濾膜進(jìn)行超濾，濃縮SOD，并去除鹽類和其他小分子物質(zhì)，取濾液；
(5)熱變性:將濃縮液在60-70°C條件下加熱變性10-15min，冷卻后，1000g離心15-20min，去除雜蛋白，收集上清；
(6)層析純化:將上述熱變性溶液上樣到預(yù)先用平衡液平衡的DEAE52纖維素柱中，經(jīng)過(guò)液平衡，再用洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集下柱液；
(7)脫鹽與濃縮:將上述的蛋白洗脫液裝于透析袋內(nèi)，在0-4°C，流動(dòng)條件下進(jìn)行透析除鹽12-24h;再用聚乙二醇濃縮透析液，形成透析濃縮液；
(8)凍干:將步驟(7)中的透析濃縮液進(jìn)行低溫冷凍，并放置于凍干機(jī)中，進(jìn)行真空冷凍干燥，得到SOD凍干粉。
[0008]所述的蚌肉勻漿緩沖液采用含5mmol/L CuCl2的0.15mol/L NaCl溶液。
[0009]所述鹽析的硫酸銨為90%飽和度，結(jié)合超濾，去除45 kDa以上和5-8 kDa的小分子蛋白質(zhì)。
[0010]所述熱變性所采用的條件為:60-70°C條件下加熱變性10-15min。
[0011]所述離子交換層析所采用的平衡液為pH8.0的25mmol/LTriS-HCl，洗脫液為pH8.0，#0.1mol/L NaCl的2.5mmol/L Tris-HCl。
[0012]上述透析除鹽所用的透析液為高純水;所用聚乙二醇為PEG 4000-20000ο
[0013]本發(fā)明從三角帆蚌的蚌肉中提取純化SOD凍干粉的方法具有以下幾個(gè)特點(diǎn):
1、本發(fā)明采用的原料上使用珍珠采收后的軟體組織，不加抗凝劑，這樣省時(shí)省力，適于規(guī)?；a(chǎn)。
[0014]2、本發(fā)明在沉淀雜蛋白時(shí)不用有毒害作用的氯仿，也不用易揮發(fā)的乙醇，而用無(wú)機(jī)鹽，不僅沉淀效果好，又減少了環(huán)境污染和對(duì)生產(chǎn)人員的身體傷害。
[0015]3、本發(fā)明利用SOD蛋白酶耐熱的特點(diǎn)，通過(guò)膜超濾，去除45KDa以上的大分子蛋白，利用90%飽和度的中性鹽硫酸銨沉淀SOD效果好、活性高;然后利用二次超濾，去除鹽離子和小分子雜質(zhì)等，得到SOD蛋白酶。
[0016]4、本發(fā)明綜合生物與化學(xué)方法，采用高效分離、提取及純化技術(shù)，生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單、周期短、污染小，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。經(jīng)檢測(cè)，采用本方法提取的S0D，其單位酶活可以達(dá)到1200U/mg以上。
[0017]5、本發(fā)明從水產(chǎn)品一三角帆蚌中提取SOD蛋白酶，而且是從珍珠采收下腳料一蚌肉中提取生物酶制劑，有利于為豐富的蚌肉資源的開(kāi)發(fā)利用提供新出路，提高珍珠養(yǎng)殖的附加值、減少環(huán)境污染，為食品和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供SOD酶制劑，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0019]實(shí)施例1
收集采珠后的三角帆蛛蛛肉Ikg，瀝干水分；
配制1000ml NaCl溶液，加入1.0325g CuCl2.2H20，溶解后作為抽提緩沖溶液;將蚌肉用高速勾楽機(jī)勾楽，操作條件為4°C條件下，3000rpm，勾楽1min; 1000g離心15min，取上清;
將上清液用可截留分子量為45 kDa的聚醚砜超濾膜進(jìn)行超濾，得濾液300ml;
加入固體硫酸銨至60%飽和度，4 °C靜置2h，10000g離心15min，取上清;上清中再加入固體硫酸銨至90%飽和度，4°C靜置2h，離心20min，收集沉淀；
將沉淀物用蒸餾水溶解，用可截留分子量為5-8kDa的聚醚砜超濾膜進(jìn)行超濾，取濾液；將超濾液先在70°C條件下加熱變性15min，再在65°C，15min，冰浴冷卻后，1000g，離心15min，去除雜蛋白，收集上清；
預(yù)先用PH8.0的25mmol/LTriS-HCl平衡液平衡DEAE 52纖維素柱;將熱變性溶液上樣到柱中，經(jīng) 12h平衡，再用ρΗ8.0，含0.1mol/L NaCl的2.5mmol/L Tris-HCl溶液以2ml/min的速度進(jìn)行梯度洗脫，收集下柱液；
將層析洗脫液裝于截留分子量為5 KDa的透析袋內(nèi)，在4°C，流動(dòng)條件下進(jìn)行透析除鹽24h;再在透析外加入PEG 4000濃縮透析液；
將上述透析濃縮液預(yù)先在-40°C進(jìn)行急凍，然后放置于冷凍干燥機(jī)，得到SOD酶凍干粉。經(jīng)檢測(cè)，SOD比活性為1520 U/mg，蛋白含量96.5%。
[0020]實(shí)施例2
收集采珠后的三角帆蛛蛛肉5kg，瀝干水分；
先配制5000ml NaCl溶液，然后加入5.1625g CuCl2.2H20，配置抽提緩沖溶液;將蚌肉，用高速勾楽機(jī)勾楽在2°C條件下，3000rpm，勾楽10min;42°C，1000(^離心15111；[11，取上清；將上清液用可截留分子量為45kDa的聚醚砜超濾膜進(jìn)行超濾，得濾液1450ml;
加入固體硫酸銨至45%飽和度，不斷攪拌，4°C靜置3h，1000g離心15min，取上清;上清中再加入固體硫酸銨至90%飽和度，40C靜置3h; 4°C，12000g離心15min，收集沉淀；
將沉淀物用蒸餾水溶解，用可截留分子量為5-8kDa的聚醚砜超濾膜進(jìn)行超濾，收集濾液；
將超濾液先在65°(:，預(yù)熱變性51^11，再在60°(:，151^11，磁力攪拌器加熱攪拌;冰浴冷卻后，10000g，離心15min，去除雜蛋白，收集上清；
將熱變性溶液上樣到預(yù)先用PH8.0的25mmol/LTris-HCl平衡液平衡DEAE52柱中，經(jīng)24h平衡，再用PH8.0的含0.1mol/L NaCl的2.5mmol/L Tris-HCl溶液以lml/min的速度進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液；
將洗脫液裝于截留分子量為5 kDa的透析袋內(nèi)，在4°C，磁力攪拌條件下進(jìn)行透析除鹽12h;再在透析外加入PEG 6000濃縮透析液；
將上述透析濃縮液預(yù)先在-30 °(:進(jìn)行急凍，然后放置于冷凍干燥機(jī)，得到SOD酶凍干粉，經(jīng)檢測(cè)SOD比活性為1268 U/mg，蛋白含量95.8%。
[0021]上述實(shí)施例僅用于解釋說(shuō)明本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思，而非對(duì)本發(fā)明權(quán)利保護(hù)的限定，凡利用此構(gòu)思對(duì)本發(fā)明進(jìn)行非實(shí)質(zhì)性的改動(dòng)，均應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從三角帆蚌的蚌肉中提取純化SOD凍干粉的方法，其特征在于包括以下步驟:將三角帆蚌軟體組織破碎后，經(jīng)過(guò)勻漿、超濾、鹽析、超濾、熱變性、柱層析、脫鹽、濃縮和凍干，最后得到SOD凍干粉產(chǎn)品。2.如權(quán)利要求1所述從三角帆蚌的蚌肉中提取純化SOD凍干粉的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)勻漿:收集珍珠采集后的三角帆蚌，挖取所有蚌肉稱重，以蚌肉和勻漿緩沖液1:1的比例混勻，用高速勻漿機(jī)勻漿，攪拌0.5-lh，離心去碎組織細(xì)胞碎片，取上清液； (2)超濾:將步驟(I)中的上清液用可截留分子量為45kDa的聚醚砜超濾膜進(jìn)行超濾，取濾液； (3)鹽析:將超濾液用硫酸銨進(jìn)行鹽析分離，4°C靜置2-3h，1000(^離心15-201^11，收集沉淀； (4)二次超濾:將沉淀物用蒸餾水溶解，用可截留分子量為5-8kDa的聚醚砜超濾膜進(jìn)行超濾，濃縮SOD，取濾液； (5)熱變性:將濃縮液在60-70°C條件下加熱變性10-15min，冷卻后，1000g離心15-20min，去除雜蛋白，收集上清； (6)層析純化:將上述熱變性溶液上樣到預(yù)先用平衡液平衡的DEAE52纖維素柱中，經(jīng)過(guò)液平衡，再用洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集下柱液； (7)脫鹽與濃縮:將上述的蛋白洗脫液裝于透析袋內(nèi)，在0-4°C，流動(dòng)條件下進(jìn)行透析除鹽12-24h;再用聚乙二醇濃縮透析液，形成透析濃縮液； (8)凍干:將步驟(7)中的透析濃縮液進(jìn)行低溫冷凍，并放置于凍干機(jī)中，進(jìn)行真空冷凍干燥，得到SOD凍干粉。3.如權(quán)利要求1所述從三角帆蚌的蚌肉中提取純化SOD凍干粉的方法，其特征在于:所述的蚌肉勻漿緩沖液采用含5mmol/L CuCl2的0.15mol/L NaCl溶液。4.如權(quán)利要求1所述從三角帆蚌的蚌肉中提取純化SOD凍干粉的方法，其特征在于:所述鹽析的硫酸銨為90%飽和度，結(jié)合超濾，去除45 kDa以上和5-8 kDa的小分子蛋白質(zhì)。5.如權(quán)利要求1所述從三角帆蚌的蚌肉中提取純化SOD凍干粉的方法，其特征在于所述熱變性所采用的條件為:60-70°C條件下加熱變性10-15min。6.如權(quán)利要求1所述從三角帆蚌的蚌肉中提取純化SOD凍干粉的方法，其特征在于:所述離子交換層析所采用的平衡液為PH8.0的25mmol/LTriS-HCl，洗脫液為pH8.0，含0.1mol/L NaCl的2.5mmol/L Tris-HCl。7.如權(quán)利要求1所述從三角帆蚌的蚌肉中提取純化SOD凍干粉的方法，其特征在于:所用聚乙二醇為PEG 4000-20000。
【文檔編號(hào)】C12N9/02GK106011091SQ201610452905
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】楊受保
【申請(qǐng)人】紹興文理學(xué)院