一種在無血清全懸浮培養(yǎng)的mdck細(xì)胞生長的禽流感病毒的制備方法及獲得的禽流感病毒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的制備方法及通過該方法獲得的禽流感病毒，包括以下步驟：1)制備待接種的MDCK細(xì)胞；2)準(zhǔn)備毒種：準(zhǔn)備雞胚源禽流感病毒；3)F1代病毒馴化：4)F2代病毒馴化：取F1代中禽流感病毒血凝效價(jià)最高的時(shí)間點(diǎn)所留取的上清液樣本，重復(fù)步驟3)；5)F3代病毒馴化：培養(yǎng)F3代病毒的溫度為35℃；6)F4～F10代病毒馴化：重復(fù)步驟5)，得到馴化完成的禽流感病毒；本發(fā)明的馴化方法將禽流感病毒從使用雞胚培養(yǎng)直接馴化到完全適應(yīng)在無血清懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞上高效繁殖，馴化效率高，禽流感病毒可在MDCK細(xì)胞中高效感染復(fù)制，病毒特性穩(wěn)定。
【專利說明】
-種在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞生長的禽流感病毒的制 備方法及獲得的禽流感病毒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及病毒培養(yǎng)馴化領(lǐng)域，具體設(shè)及一種適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì) 胞系生長的禽流感病毒的制備方法及通過該方法獲得的禽流感病毒。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國目前生產(chǎn)的H9亞型禽流感滅活疫苗都采用雞胚作為病毒生長載體，疫苗成本 偏高，且沒辦法應(yīng)對(duì)急性大規(guī)模的禽流感流行。目前已有少數(shù)廠家采用貼壁MDCK細(xì)胞培養(yǎng) 方法制備H5禽流感疫苗，然而，在單細(xì)胞層培養(yǎng)體系中，細(xì)胞的增殖受到基質(zhì)表面積的限 審IJ，很難實(shí)現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)，消化過程也增加了工藝的復(fù)雜性、生產(chǎn)時(shí)間和成本。無血清懸浮 培養(yǎng)可W突破細(xì)胞生長表面的限制，無需昂貴的微載體和添加血清，還可W節(jié)約設(shè)備空間， 提高設(shè)備的利用率，便于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。另外，因生產(chǎn)過程中無需微載體和消化液，從而可 大大減少產(chǎn)品雜質(zhì)的引入，簡(jiǎn)化產(chǎn)品的后期分離純化過程，有效降低生產(chǎn)成本。故而，將雞 胚培養(yǎng)的禽流感病毒馴化為適應(yīng)在無血清懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞上高效繁殖，對(duì)于提高禽流感 病毒的生產(chǎn)效率，并且對(duì)于禽流感疫苗的生產(chǎn)，皆具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng) 的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的制備方法，本發(fā)明的馴化到適應(yīng)在無血清懸浮培養(yǎng) MDCK細(xì)胞上高效繁殖，完全擺脫了對(duì)雞胚的依賴，也擺脫了貼壁細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模的限制，馴化 效率高，禽流感病毒可在MDCK細(xì)胞中高效感染復(fù)制，病毒特性穩(wěn)定。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的 MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的制備方法，包括W下步驟：
[0005] 1)制備待接種的適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞:將MDCK細(xì)胞裝入搖瓶，在轉(zhuǎn) 速13化pm，溫度37°C、通入濃度為5%的C〇2的條件下，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);然后每12h取樣一 次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);在MDCK細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用新鮮的無血清培養(yǎng)基稀釋至MDCK細(xì)胞 密度為0.5 X 106ce 11 s/mL，并W此為MDCK細(xì)胞起始密度，然后將MDCK細(xì)胞培養(yǎng)72h，得到待 接種的適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞；
[0006] 2)準(zhǔn)備毒種:準(zhǔn)備雞胚源禽流感病毒；
[0007] 3)F1代病毒馴化:按培養(yǎng)基體積的1%。接毒量將步驟2)的雞胚源禽流感病毒接種 于步驟1)中獲得的待接種的MDCK細(xì)胞中，并加入化g/mL的TPCK-膜酶進(jìn)行培養(yǎng);每1化檢測(cè) 病毒血凝效價(jià)和病毒滴度并留取F1代培養(yǎng)基上清液樣本，連續(xù)觀察96h;培養(yǎng)F1代病毒的溫 度為37°C;
[000引4)F2代病毒馴化:取F1代中病毒血凝效價(jià)最高的時(shí)間點(diǎn)所留取的F1代培養(yǎng)基上清 液樣本，重復(fù)步驟3)的過程，即將F1代培養(yǎng)基上清液樣本接種到新的待接種的MDCK細(xì)胞中， 并檢測(cè)病毒血凝效價(jià)和病毒滴度和留取F2代培養(yǎng)基上清液樣本;培養(yǎng)F2代病毒的溫度為 37。。
[0009] 5)F3代病毒馴化:取F2代中病毒血凝效價(jià)最高的時(shí)間點(diǎn)所留取的F2代培養(yǎng)基上清 液樣本，重復(fù)步驟3)的過程，即將F2代培養(yǎng)基上清液樣本接種到新的待接種的MDCK細(xì)胞中， 并檢測(cè)病毒血凝效價(jià)和病毒滴度和留取F3代培養(yǎng)基上清液樣本;培養(yǎng)F3代病毒的溫度為35 。。
[0010] 6)F4~F10代病毒馴化:重復(fù)步驟5)的過程培養(yǎng)F4~F10代，得到馴化完成的禽流 感病毒。
[0011] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案：步驟1)中，所述裝入搖瓶并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的 MDCK細(xì)胞為通過無血清培養(yǎng)基從MDCK貼壁細(xì)胞馴化為全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞。
[0012] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案:所述全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞通過W下步驟得到：
[0013] I)將需血清貼壁培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞用培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到80~90%時(shí)，棄 去培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)基，用膜酶溶液清洗細(xì)胞層后棄去溶液;再次加入膜酶溶液至覆蓋 MDCK細(xì)胞進(jìn)行消化5~15min;待細(xì)胞變圓后加入含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化;然后收集 細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞懸液離屯、后棄上清，獲得細(xì)胞團(tuán)；
[0014] Π)將步驟I)中獲得的細(xì)胞團(tuán)用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸至細(xì)胞密度1.3~1.6 X 106cells/mL，獲得細(xì)胞重懸液；
[0015] 虹）將步驟Π )中獲得的細(xì)胞重懸液加入方瓶，在轉(zhuǎn)速30巧m、溫度37°C、5%C02的 條件下置于搖床中并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過2代培養(yǎng)后將培養(yǎng)的細(xì)胞重懸液轉(zhuǎn)入搖瓶，轉(zhuǎn) 速提升至12化pm;每隔4她用新鮮的無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸液稀釋至細(xì)胞密度為1.3~ 1.6X 106cells/mL，進(jìn)行傳代，獲得適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞。
[0016] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案:所述無血清培養(yǎng)基按濃度計(jì)，包括W下組分：
[0017] 基礎(chǔ)代謝營養(yǎng)物： D-葡萄糖 3000 ~ lOOOOmg/。 丙禍酸飾 50~600mg/L; L巧氨酸 5~30mg/U 以精氣酸 150~撕0妨齡14 心天冬醜胺 10~60mg/L; ^天冬氨酸 10~60mg/L; 心脫氨酸 10 ~ 80m呂心
[001引心半化氨酸 20~150mgA-,; 以谷氨酸 5~60mg/1L; L-谷氨醜胺 300~1500mg/L; 甘氨酸 10~lO&ag/L; L紐氨酸 10~ 150mg/L; 心異亮氨酸 20~ 150mg人L; L亮氨酸 50 ~250mg,a_,; 以賴氨酸 50~150mgAL; 心甲硫氨酸 20-' 150mg/L; L-苯巧氨酸 20 ~ 250mg/k L-脯氨酸 20~200mg/：L; L絲氨駿 訊~15化鳴八-；
[0019] 以蘇.氨酸 沸-鄉(xiāng)Qrag化； 心色氨酸 20~i00mg/L; L酷氨酸 20~!00mg/k L鎖氨酸 沸~200mg/L;
[0020] 核巧酸： 次黃噪冷 2~25mg,l; 胸普 0.1 ~lmg./L;: 腺普 2叫51哨知一；
[0021] 尿普 2~15mg/^ 月包普 2~ 15mg/L; 鳥普 2~i5mg/U
[0022] 維生素： D-生物素 0.01 ~0.20mg/L; 葉酸 1 ~ lOmg/L; 煙醜胺 l~10mg/L; 化唉醇 X~lOmg/k
[0023] 疏胺素 l~10mg心 核黃素 0.1 ~ Img心 氯化膽堿 10 ~ 50mg/L; D-泛酸鉤 2~lOmg/L;
[0024] 肌醇 10. - 5()mg,心
[0025]無機(jī)鹽： 石肖酸鐵 I0~50mg/L; 碗酸亞鐵 0.1 Img/L; 硫酸緩 20~100 mg/L; 氯化卸 200~500mg/L;
[0026] 氯化納 5000 ~ 900〇11巧尼； 鱗酸氨二銅 50~lOOmg/L; 鱗酸二氨納 50 ~ lOOmg/L; 亞爾酸納 20 ~ l.〇0rng/b
[0027] 剪切力保護(hù)劑： 500~2500mg/l;
[002引抗細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑： 20~150mg/l;
[0029]酸堿度緩沖劑：
[0030] 碳酸氨鋼 1000 ~3000mg/l;
[0031] 酸堿度指示劑：
[0032] 酪紅 5~15mg/l;
[0033] 流感病毒增殖促進(jìn)劑： 膽固醇 r~10mg/L; DL-貨-生育醋·醋酸醋 0 J~3mg/L; 豆寇酸 0.05 ~ 0.5〇巧化；
[0034] 標(biāo)桐酸 0.05 …0.5mg/L; 硬脂酸 0.05 ~ 0.5mg/L; 氯化緩 1000~5000mg/L: 氯化媽 50250mgzL; 二甲基亞麟 2 ~ 20mg/L; 硫酸辭 0.2 ~ 2.0mg/L;
[003引硫酸銅 5 ~ 25mg/L; 硫酸短 0.0001~化001 mg/L， 偏軌酸錠 0.001~0.005m呂化；
[0036] 其它添加物： 梓橡酸鐵鎮(zhèn) B.5 ~ 40.5mg化； 腹?fàn)?wèi)素 2~15mg/L;
[0037] 大豆水解物 1000 ~ 5000nig/L; 乙醇胺 1~]0〇巧,心； 谷脫甘化 0.5~3mg化。
[0038] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案:所述剪切力保護(hù)劑為嵌段式聚酸F68。
[0039] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案:所述抗細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑為硫酸葡聚糖。
[0040] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案:將原料混合后磨成細(xì)粉，然后將所得細(xì)粉于10~ 30°C溶劑中溶解，得到混合液;調(diào)節(jié)混合液的抑至6.3~6.7,定容后得到無血清培養(yǎng)基。
[0041] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案:所述禽流感病毒為H9N2亞型禽流感病毒。
[0042] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的方案:所述步驟2)中，雞胚源禽流感病毒的病毒含量> 1〇6'化 IDso/O.l 血。
[0043] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種禽流感病毒，該禽流感病毒可在MDCK細(xì)胞中 高效感染復(fù)制，病毒特性穩(wěn)定，病毒含量和HA血凝效價(jià)皆有所提高。
[0044] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:通過上述的制備方法獲得。
[0045] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0046] 1、本發(fā)明的馴化方法將禽流感病毒從使用雞胚培養(yǎng)直接馴化到完全適應(yīng)在無血 清懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞上高效繁殖，無需經(jīng)歷貼壁細(xì)胞過程，完全擺脫了對(duì)雞胚的依賴，也 擺脫了貼壁細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模的限制，馴化效率高，禽流感病毒可在MDCK細(xì)胞中高效感染復(fù)制， 病毒特性穩(wěn)定；
[0047] 2、本發(fā)明所使用的無血清培養(yǎng)基不含動(dòng)物血清、成本低;支持MDCK單細(xì)胞高密度 全懸浮培養(yǎng)并可同時(shí)用于禽流感病毒的細(xì)胞培養(yǎng)，其成分明確、容易配制并且使用方便；
[0048] 3、本發(fā)明將需血清貼壁培養(yǎng)的MDCK貼壁細(xì)胞馴化為適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng)的 MDCK細(xì)胞，馴化時(shí)間短，獲得的全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞形態(tài)飽滿，大小均一，活性大，有利于 禽流感病毒的接種和培養(yǎng)；
[0049] 4、通過馴化方法獲得的禽流感病毒在全懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞中可高效感染復(fù)制，病 毒特性穩(wěn)定，病毒含量和HA血凝效價(jià)皆有所提高，獲得的禽流感病毒適用于生物反應(yīng)器培 養(yǎng)并制備禽流感疫苗半成品。
【附圖說明】
[0050] 圖1為實(shí)施例4中貼壁狀態(tài)下MDCK細(xì)胞形態(tài)圖；
[0051 ]圖2為實(shí)施例4中經(jīng)本發(fā)明無血清培養(yǎng)基馴化下的MDCK細(xì)胞形態(tài)圖；
[0化2] 圖3為實(shí)施例4中采用Hyclone公司無血清培養(yǎng)基SFM4 Mega Vir通過直接馴化法 得到的懸浮培養(yǎng)的MDCKS細(xì)胞形態(tài)圖；
[0053] 圖4為實(shí)施例4中采用Gibco公司開發(fā)的商業(yè)無血清培養(yǎng)基SMI F8間接法馴化得到 的MDCK.SUS2細(xì)胞形態(tài)圖；
[0054] 圖5為實(shí)施例5中活細(xì)胞密度和細(xì)胞活性曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0055] 下面，結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0化6] -、制備無血清培養(yǎng)基：
[0057]所述無血清培養(yǎng)基按濃度計(jì)，包括W下組分：
[005引基礎(chǔ)代謝營養(yǎng)物： D-葡萄糖 3000 ~1 OOOOmg/l.; 巧綱酸鍋 50 ~ 600mg/L; 心巧氨酸 5~30mg,'1L; 心精氨酸 150 -- 600mg/1L; 心天冬醜胺 10 ~ 60mg/L; 心天冬氨酸 10~60mg^;
[0059] L脫氨酸 10 ~80mg/l.; 以半脫氨酸 2D ~ 150mg/L; 心谷氨酸 5~60mg,'1L; ：L-谷氨醜胺 300 - 1500mg/L; 甘氨酸 10~lOOmg/L.; L純氨酸 10~150mg/T; L-異亮氨酸 20 ~ 150mg/L; L亮氨酸 50~250mg/。 L-賴氨酸 50~ 150mg,l; 心甲硫氨酸 細(xì)~150mg/L; 心苯巧氨酸 20~250mg/。 L-脯氨酸 20~200mg,l;
[0060] B 9 L絲風(fēng)酸 沸~150mg/L; 心蘇氨酸 彿~200mg/。 L-色氨酸 鄉(xiāng)~ lOOmg'l; 心酪氨酸 細(xì)~100mg/L; 心額氨酸 彿~200mg/。
[0061] 核巧酸： 次黃噪。令 2~25mg^; 胸苦 D.1'-Img/U 腺普 2 ~ 15mg/L;
[0062] " _ 口 尿甘· 2 ~ 15mg/L; 月包普 2 ~ 15mg/L; 鳥茸 2'-15mg/L;
[00創(chuàng)維生素： D-生物素 化01~化20mg/^ 葉酸 1 ~ lOmg/L; 煙醜胺 1 ~ lOmg化； 中乙唉醇 1~10111呂化；
[0064] 硫按素 1 ~lOmg'l; 核黃素 0.1~lmg/L; 氯化膽堿 10 ~ 50mg/L; D-泛酸鉤 2~ 10mg,l; 肌醇 10 ~ 50mg化；
[0065] 無機(jī)鹽： 硝酸鐵 10~50mg/T.; 碗酸亞鐵 0.1 ~ Img/L:
[0066] ,, 硫酸錠 20~lOOmg/1一； 氯化鐘 200 ~ 500mg/L; 氯化鑰 5000 ~ 9000mgZ^ 鱗酸氨二納 50 ~ lOOmg/L;
[0067] 鱗酸二氨銅 50-- lOOrngA-.; 亞巧酸銷 20 ~ lOOmg/L;
[0068] 剪切力保護(hù)劑：
[0069] 嵌段式聚酸 F68 500 ~2500mg/l;
[0070] 抗細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑：
[0071] 硫酸葡聚糖 20~150mg/l;
[0072] 酸堿度緩沖劑：
[0073] 碳酸氨鋼 1000 ~3000mg/l;
[0074] 酸堿度指示劑：
[0075] 酷紅 5 ~15mg/X;
[0076] 流感病毒增殖促進(jìn)劑： 膽固醇 1~lOmgZU D^a-生育酪醋酸醋 0.3~3mg/L; 豆寇酸 0.05~0.5mg/l：一； 掠桐酸 0.05 ~ 0.5mg/L; 硬脂釀 0.05 ~ 0.5mg/L; 氯化娛 ！000~500加 '巧心；
[0077],. 氯化釣 50.-25〇111呂心 二甲基亞觀 2~20mg心 碗酸辭 0.2 ~ 2.0mg/L; 硫酸銅 5 ~ 25mg/L; 硫酸短 0.0001~化001 mg/b 偏軌酸錠 0.001 ~ 0.005mg.,l;
[007引其它添加物： 持橡酸鐵錠 13.5~40.5mg/L; 跋島素 2~ 15mg/^
[0079] 一 欠豆水解物 1000 '- 5000nig/L; 乙醇胺 1~]0m呂心
[0080] 谷脫甘膚 0J~3mg/L。
[0081] 其中，核巧酸中選用次黃嚷嶺和胸巧，能促進(jìn)MDCK細(xì)胞的核巧酸合成，保證細(xì)胞的 生長;次黃嚷嶺和胸巧成分太高，會(huì)抑制細(xì)胞生長；
[0082] 其中，其他添加物中選用巧樣酸鐵錠，用W替代轉(zhuǎn)鐵蛋白發(fā)揮其原有作用，不影響 細(xì)胞生長與鐵代謝，且能減少無血清培養(yǎng)基中的動(dòng)物蛋白成分，降低培養(yǎng)基成本和對(duì)生產(chǎn) 的不確定性和不安全性;巧樣酸鐵錠依靠二價(jià)金屬離子通道DMT1吸收鐵，轉(zhuǎn)鐵蛋白通過轉(zhuǎn) 鐵蛋白受體吸收鐵，前者比后者提高了 MDCK細(xì)胞對(duì)鐵的吸收速率;巧樣酸鐵錠成分濃度過 高會(huì)抑制MDCK細(xì)胞生長;濃度太低，MDCK細(xì)胞對(duì)鐵的吸收不足；
[0083] 其中，其它添加物中膜島素的濃度在2~15mg/L，能促進(jìn)葡萄糖代謝，保證MDCK細(xì) 胞的生長和維持MDCK細(xì)胞的活性；
[0084] 其中，其它添加物中大豆水解物的濃度在1000~5000mg/mL，能保證維生素、金屬 離子、氨基酸等其他輔因子的供給，提高M(jìn)DCK細(xì)胞對(duì)氨基酸的攝?。?br>[0085] 將原料混合后磨成細(xì)粉，然后將所得細(xì)粉于10~30°C溶劑中溶解，得到混合液;調(diào) 節(jié)混合液的pH至6.3~6.7，定容后得到無血清培養(yǎng)基。
[0086] 二、制備全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞：
[0087] I)將需血清貼壁培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞用培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到80~90%時(shí)，棄 去培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)基，用膜酶溶液清洗細(xì)胞層后棄去溶液;再次加入膜酶溶液至覆蓋 MDCK細(xì)胞進(jìn)行消化5~15min;待細(xì)胞變圓后加入含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化;然后收集 細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞懸液離屯、后棄上清，獲得細(xì)胞團(tuán)；
[0088] Π)將步驟I)中獲得的細(xì)胞團(tuán)用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸至細(xì)胞密度1.3~1.6 X 106cells/mL，獲得細(xì)胞重懸液；
[0089] 虹）將步驟Π )中獲得的細(xì)胞重懸液加入方瓶，在轉(zhuǎn)速30巧m、溫度37 °C、5 % C〇2的 條件下置于搖床中并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過2代培養(yǎng)后將培養(yǎng)的細(xì)胞重懸液轉(zhuǎn)入搖瓶，轉(zhuǎn) 速提升至12化pm;每隔4她用新鮮的無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸液稀釋至細(xì)胞密度為1.3~ 1.6X 106cells/mL，進(jìn)行傳代，獲得適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞。
[0090] Ξ、一種適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的制備方法， 包括W下步驟：
[0091] 1)制備待接種的適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞:將MDCK細(xì)胞裝入搖瓶，在轉(zhuǎn) 速13化pm，溫度37°C、通入濃度為5%的C〇2的條件下，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);然后每12h取樣一 次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);在MDCK細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用新鮮的無血清培養(yǎng)基稀釋至MDCK細(xì)胞 密度為0.5 X 106ce 11 s/mL，并W此為MDCK細(xì)胞起始密度，然后將MDCK細(xì)胞培養(yǎng)72h，得到待 接種的適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞；
[0092] 2)準(zhǔn)備毒種：準(zhǔn)備雞胚源H9N2亞型禽流感病毒；禽流感病毒的病毒含量> 1〇6'化 ID 日 o/O.l血；
[0093] 3)F1代病毒馴化:按培養(yǎng)基體積的1%。接毒量將步驟2)的雞胚源禽流感病毒接種 于步驟1)中獲得的待接種的MDCK細(xì)胞中，并加入化g/mL的TPCK-膜酶進(jìn)行培養(yǎng);每1化檢測(cè) 病毒血凝效價(jià)和病毒滴度并留取F1代培養(yǎng)基上清液樣本，連續(xù)觀察96h;培養(yǎng)F1代病毒的溫 度為37°C;
[0094] 4)F2代病毒馴化:取F1代中病毒血凝效價(jià)最高的時(shí)間點(diǎn)所留取的F1代培養(yǎng)基上清 液樣本，重復(fù)步驟3)的過程，即將F1代培養(yǎng)基上清液樣本接種到新的待接種的MDCK細(xì)胞中， 并檢測(cè)病毒血凝效價(jià)和病毒滴度和留取F2代培養(yǎng)基上清液樣本;培養(yǎng)F2代病毒的溫度為37 V;
[00M] 5)F3代病毒馴化:取F2代中病毒血凝效價(jià)最高的時(shí)間點(diǎn)所留取的F2代培養(yǎng)基上清 液樣本，重復(fù)步驟3)的過程，即將F2代培養(yǎng)基上清液樣本接種到新的待接種的MDCK細(xì)胞中， 并檢測(cè)病毒血凝效價(jià)和病毒滴度和留取F3代培養(yǎng)基上清液樣本;培養(yǎng)F3代病毒的溫度為35 。。
[0096] 6)F4~F10代病毒馴化:重復(fù)步驟5)的過程培養(yǎng)F4~F10代，得到馴化完成的禽流 感病毒。
[0097] 具體實(shí)施例
[0098] 實(shí)施例1-3用于說明無血清培養(yǎng)基的效果：
[0099] 實(shí)施例1
[0100] 所述無血清培養(yǎng)基按濃度計(jì)，包括W下組分：
[0101] 基礎(chǔ)代謝營養(yǎng)物： D-葡萄糖 4500mg/^ 巧醜酸銅 220mg/L; L-巧氨酸 22.3mg/L; 以精氨酸 273.9mg.AL; 心天冬醜胺 33.9mg,l; 以天冬氨酸 33.31雌心 心脫氨酸 42.67mg/L; 心半脫氣酸 （)8.60mg/l：一； L谷氨酸 36.8mg/。 以谷氨醜胺 876mg/L; 甘氨酸 26.44mg化；
[0102] L-組氨酸 73.50mg/L; ^異亮氣酸 89.52mg/^ L 亮氨酸 15乂％mgA-; 以賴氨酸 107.21 mg/b L-甲硫氨酸 87.74mg/L; 心苯巧氨酸 100.38mg化; L-脯戴酸 96.47巧各凡； L-絲氨酸 78.46mg/L; L-蘇氨酸 B6.46mg/L; 心色氨酸 57.8 L-酪氛駿 56.87mg/L; 心鐵戴酸 96.85mg/L;
[0103] 核巧酸： 次黃噪吟 K).3mg/L·; 胸普 0.24mg/L; 腺普 7mg化；
[0104] ， 藏普 7rag/L; 胞普 7mg/L; 鳥普 7mg/：L;
[010引維生素： D-生物素 0.0720巧,心 葉酸 5.32m:g/L; 煙醜胺 3.14mg/L; 化巧醇 3.15mg/^
[0106] 硫胺素 3.23mg/b 核黃素 0.36mg/L; 氯化膽堿 26.01nig/l; D-泛酸鉤 5.82mg/l; 肌奪 25地曼化；
[0107] 無機(jī)鹽： 硝酸鐵 24.19mg^; 硫酸亞鐵 0.417mgAL; 硫酸矮 48.8mg/：L;
[010 引 氣化鐘 311.8mg/^ 氯化納 6860mg/1L; 禱酸氨二銅 71mg/L; 麟酸二氨銅 62.5mg化；
[0109] 亞願(yuàn)酸納 51.881唯化；
[0110] 剪切力保護(hù)劑：
[0111] 嵌段式聚酸 F68 1600mg/l;
[0112] 抗細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑：
[0113] 硫酸葡聚糖 50mg/l;
[0114] 酸堿度緩沖劑：
[0115] 碳酸氨鋼 2200mg/l;
[0116] 酸堿度指示劑：
[0117] 酪紅 8mg/l;
[0118] 流感病毒增殖促進(jìn)劑： 膽圏零 3.13mg/1L; DLa-生育釀酷酸醋 1.39mg/L; 豆寇酸 0.2284mg/L; 掠桐酸 0.2嫌腳摸'L; 硬臘酸 0.285mg化； 氯化矮 2的6rng/l：;
[0119] 氯化媽 174.9mg/L; 二甲基亞碼 1 ling/L, 硫酸辭 OJmg/L; 碗酸銅 15.97mg/L; '硫酸短 0.000302mg/。 偏饑酸鎮(zhèn) 0.00234mg/L;
[0120] 其它添加物： 掉橡酸鐵錠 巧放g/L; 化島素 6.94口巧化；
[0121] 大互水解物 21 OOmg^; 乙醇胺 3.46mg/L; 谷脫甘膚 1.4mg/L。
[0122] 將原料混合后磨成細(xì)粉，然后將所得細(xì)粉于10~3〇°C溶劑中溶解，得到混合液;調(diào) 節(jié)混合液的抑至6.5，定容后得到無血清培養(yǎng)基。
[0123] 實(shí)施例2
[0124] 所述無血清培養(yǎng)基按濃度計(jì)，包括W下組分：
[01巧]基礎(chǔ)代謝營養(yǎng)物： D-葡萄糖 3715mg.AL; 丙禍酸輛 llOmg/L; ^丙-氣酸 11.2.11巧幾； L精氨釀 21乂11雌八一； 心天冬醜胺 22.6mg/l; 心天冬氨酸 22.2mg/^
[0126] 心賊氨酸 28.45mg/lL; ^半化氨酸 54.88mg,l; L谷氨酸 18.4mg/L; 心谷氨醜胺 584mg/L; 甘氨酸 13.22mg化； 心組氨酸 36.75mg/lL; L-異亮氣酸 44.76mg/]L; 心亮氨酸 7 乂 69mgzL; L-賴氨酸 85.77mg/L; L-甲硫氨酸 43.87mg^; 心苯丙氨釀 5化19mg/L; L-脯氨酸 48.24mg/L;
[0127] L-絲氨酸 62.巧mg/L; L蘇氧酸 85.29mg/L; L 色氨酸 38.54mg^; 以骼氨酸 45.50i?g化； 心鎖氨酸 58.HmgA_.;
[012引核巧酸： 次黃噪哈 5.2mg/。 胸普 化12mg/^ 腺普 3.5mg/L;
[0129] 尿普 3.5mg/L; 月包普 3.5mg/L; 鳥普 3.5;iiig/L;;
[0130] 維生素： D-生物素 0.036mg,'L; 葉酸 2.燃mg化;. 煙醜胺 1.51mg/L;
[0131] 化唉醇 1.61雌心 硫胺素 1.62mg/L; 枯黃素 ai8mg/T.; 氯化膽堿 13mg/：L;
[01 創(chuàng) D-泛酸鉤 2.91 mg/b 肌醇 12.5mg/L;
[0133] 無機(jī)鹽： 硝酸鐵 24.19mg/!：_.; 硫酸亞鐵 0.4171雌心 硫酸矮 24.4mg/L; 氯化舒 311.姑塔化；
[0134] 氯化銅 5488mg/^ 蹲薇蠢二銷 巧抑g/L; 麟酸二氨銅 62.5mg/L; 亞禍酸鋪 25.94mg/L;
[0135] 剪切力保護(hù)劑：
[0136] 嵌段式聚酸 F68 lOOOmg/l;
[0137] 抗細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑：
[0138] 硫酸葡聚糖 25mg/l;
[0139] 酸堿度緩沖劑：
[0140] 碳酸氨鋼 2200mg/l;
[0141] 酸堿度指示劑：
[0142] 酪紅 8mg/l;
[0143] 流感病毒增殖促進(jìn)劑： 膽國釀 1.57mg/：L;
[0144] DL-α-生育敵醋酸酶 0,7m名瓜； 豆蔥酸 0.1142mg/L; 掠桐酸 0.128mg/L； 硬脂酸 （U43mg心 氯化錢 1904mg/1L; 氯化輯 n6,6mgA,;
[0145] 二甲基亞觀 5.5iTig/L; 石荒酸舞 0,4mg/L; 硫酸銅 7.98mg/L; 硫酸短 0.000151 mg/L; 偏饑酸錠 0.00117mg/L;
[0146] 其它添加物： 粹橡酸鐵鎮(zhèn) 13.5mgZl·一； 跋島素 5mg化；
[0147] 大豆水解物 1400mg/T·; 乙醇胺 1.73mg/L; 答脫甘獻(xiàn) 0;.?mg/L。
[014引將原料混合后磨成細(xì)粉，然后將所得細(xì)粉于10~30°C溶劑中溶解，得到混合液;調(diào) 節(jié)混合液的pH至6.4，定容后得到無血清培養(yǎng)基。
[0149] 實(shí)施例3
[0150] 所述無血清培養(yǎng)基按濃度計(jì)，包括W下組分：
[0151] 基礎(chǔ)代謝營養(yǎng)物： D-葡萄糖 撕:00mg/'L;
[0152] 巧禍酸銷 440mg/L; 心巧氨酸 22.5mg/b L-精氨酸 547.8mg/L； L-天冬耽胺 45.2mg/L; 1_.-天冬氯醜 55.5mg/L; L眺氨酸 64.0 ImgZ。 以半脫氨酸 10么始轅L; L谷氨酸 55.2mg^ 一； 心谷氨眺胺 1460mg/^ 甘氨酸 52.()8mgZ^ L組氨酸 110.25mg^; 心異亮氨酸 134.28mgC:;
[0153] 心亮氨酸 23 乂 07〇1霞,心 L-賴氨酸 134.01 mg/。 心甲硫氨酸 109.68nigZL; 心苯丙氨酸 200.76mg/L; 以脯氨酸 144.7img/L?; 心絲氨酸 117.69mg/L; 心蘇氨酸 17化57mg/U: L-色氨酸 77.07mg/L; L-!駱氨酸 85.31 mg心 心鋼氨酸 145,28mg^;
[0154] 核巧酸： 次黃。票吟 20.6mg/：L;
[0155] 胸普 0.48mg,'T; 腺菩 10.5mgA-; 尿普 10.5mg/L;
[0156] 胞菩 K).5mg,''1L; 鳥苦 10.5mgAL;
[0157] 維生素： D-生物素 0.144mg/l_; 葉酸 7.98mg/U 煙晚胺 6.28mg/L; 化巧醇 6,3mg,^
[015 引硫胺素 6.46mgAL; 板黃素 0.72mg/L; 氯化膽堿 巧.02mg/：L; D-泛酸鉤 8.73mg/。 肌醇 37.5mg/L;
[0159] 無機(jī)鹽： 硝酸鐵 24.19mgZ。 硫酸亞鐵 0.417mg/L; 硫酸緩 73.2mg/L; 氯化鐘 SllJmg/L;
[0160] 氯化納 的75mg^; 蹲酸氨二銅 71mg/'L; 鱗酸二氨銅 62.5mg/'I， 亞觸酸納 77.82mg化；
[0161] 剪切力保護(hù)劑：
[0162] 嵌段式聚酸 F68 2200mg/l;
[0163] 抗細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑：
[0164] 硫酸葡聚糖 lOOmg/l;
[0165] 酸堿度緩沖劑：
[0166] 碳酸氨鋼 2200mg/l;
[0167] 酸堿度指示劑：
[016 引酪紅 8mg/X;
[0169] 流感病毒增殖促進(jìn)劑： 膽固醇 6.26mg/L; DL-a-生育盼醋酸醋 2.1 m畏/L:;: 至蘿酸 0.34化mg/b 掠桐酸 C).384mg/^ 硬脂酸 0.428mg/lL; 氯化緩 4762mgZI^;
[0170] _ 氯化媽 233.2mg/L; 二甲基亞踢i 化Jmg/L; 硫酸辭 1.6mg/L; 硫酸銅 23.96mg/L; 硫酸猛 O.WQ453mg,'L; 偏軌酸矮 0.00351 mg/L;
[0171] 其它添加物： 將橡酸鐵矮 40.5mg/U 敗島素 10.41mg/L;
[0172] 大豆水解物 4200mg,a.; 乙醇胺 5.!9mg.^;
[017引谷脫甘膚 2,lmg/L。
[0174] 將原料混合后磨成細(xì)粉，然后將所得細(xì)粉于10~3〇°C溶劑中溶解，得到混合液;調(diào) 節(jié)混合液的pH至6.7，定容后得到無血清培養(yǎng)基。
[0175] 將實(shí)施例1-3獲得的培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK細(xì)胞并進(jìn)行特性試驗(yàn)：
[0176] 1、儀器:Bio-Bundle生物反應(yīng)器（購自荷蘭Applikon Biotechnology公司），罐體 體積為化；
[0177] 2、用于對(duì)照的MDCK細(xì)胞通過商品化無血清培養(yǎng)基SFM4 Mega Vir(購自Hyclone公 司)培養(yǎng)得到；
[017引3、培養(yǎng)方法：W0.5X106cells/mL的細(xì)胞密度接種細(xì)胞至生物反應(yīng)器中，在37°C、 通入濃度為5 %的CO2的條件下進(jìn)行批培養(yǎng)，每24h取樣進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞生長速 率;結(jié)果如表1、表2所示：
[0179] 表1最高活細(xì)胞密度(106cells/mL)
[0180]
[0183] 與對(duì)照組商業(yè)化無血清培養(yǎng)基SFM4 Mega Vir懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞相比，采用本 發(fā)明所提供的無血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)過程中支持的活細(xì)胞密度有大幅度的增長;此外，在非 指數(shù)生長期細(xì)胞的比生長速率從對(duì)照的0.57CT1最大增長到實(shí)施例1中的0.91CT1，細(xì)胞倍增 時(shí)間則從對(duì)照的〇.79d最大縮短至實(shí)施例1中的0.32d?？梢姴捎帽景l(fā)明的無懸浮培養(yǎng)基獲 得的MDCK細(xì)胞，在細(xì)胞生長速率和細(xì)胞活性均有較大的提高。
[0184] 實(shí)施例4-5說明用于禽流感病毒馴化的MDCK細(xì)胞馴化過程及細(xì)胞特性：
[01化]實(shí)施例4
[01化]一、制備無血清培養(yǎng)基：
[0187]采用實(shí)施例1制得的無血清培養(yǎng)基；
[018引二、制備全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞：
[0189] I)將需血清貼壁培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞用培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到80~90%時(shí)，棄 去培養(yǎng)MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)基，用膜酶溶液清洗細(xì)胞層后棄去溶液;再次加入膜酶溶液至覆蓋 MDCK細(xì)胞進(jìn)行消化5~15min;待細(xì)胞變圓后加入含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化;然后收集 細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞懸液離屯、后棄上清，獲得細(xì)胞團(tuán)；
[0190] Π )將步驟I)中獲得的細(xì)胞團(tuán)用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸至細(xì)胞密度1.3~1.6 X 106cells/mL，獲得細(xì)胞重懸液；
[0191] 虹）將步驟Π )中獲得的細(xì)胞重懸液加入方瓶，在轉(zhuǎn)速30巧m、溫度37 °C、5 % C〇2的 條件下置于搖床中并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔4她用新鮮的無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸液稀 釋至細(xì)胞密度為1.3~1.6X 106cells/mL，進(jìn)行傳代，獲得MDCK細(xì)胞。
[0192] 通過貼壁培養(yǎng)和通過本實(shí)施例獲得的MDCK細(xì)胞形態(tài)比較如圖1-4所示：
[0193] 圖1為貼壁狀態(tài)下MDCK細(xì)胞貼附于培養(yǎng)介質(zhì)表面，呈鋪路石狀；
[0194] 圖2為本實(shí)施例懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞呈單個(gè)分散狀，無結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，細(xì) 胞形態(tài)完整，邊界光滑清晰，大小均一；
[01巧]圖3為采用Hyclone公司無血清培養(yǎng)基SFM4 Mega Vir通過直接馴化法得到的懸浮 培養(yǎng)的MDCKS細(xì)胞，圖片來源:張良艷，姚志東，等.MDCK細(xì)胞的懸浮馴化及初步應(yīng)用.生物技 術(shù)通訊.2013，24(3): 382-384;圖中可見，多個(gè)細(xì)胞聚集成團(tuán)，少見單個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞大小不均 -* · ，
[0196] 圖4為采用Gibco公司開發(fā)的商業(yè)無血清培養(yǎng)基SMIF8間接法馴化得到的 MDCK.洲 S2 細(xì)胞；圖片來源：V 丄 ohr，Y.Genzel, et al.A new MDCK suspension line cultivated in a fully defined med ium in stirred-tank and wave bioreactor. Vaccine. 2010，28(3): 6256-6264;圖中所見，在該無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)時(shí) 細(xì)胞形態(tài)也呈聚集狀，但聚團(tuán)較小，細(xì)胞大小不均一，狀態(tài)略欠。
[0197] 在本實(shí)施例將貼壁培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞馴化為懸浮培養(yǎng)狀態(tài)，該細(xì)胞呈單個(gè)分散生 長，細(xì)胞形態(tài)飽滿，大小均一;細(xì)胞質(zhì)量高。
[019引實(shí)施例5
[0199] 對(duì)得到的全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞測(cè)定活細(xì)胞密度和細(xì)胞活性，結(jié)果如圖5所示： MDCK貼壁細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中馴化6代W后（馴化后第13d)，細(xì)胞生長逐漸穩(wěn)定，細(xì)胞活 性保持在95% W上。由此可W證明，通過本發(fā)明的對(duì)MDCK貼壁細(xì)胞馴化的方法使MDCK貼壁 細(xì)胞適應(yīng)懸浮培養(yǎng)并穩(wěn)定生長只需2周，大大縮短了MDCK細(xì)胞由貼壁細(xì)胞馴化成無血清的 全懸浮細(xì)胞馴化時(shí)間。
[0200] 實(shí)施例6
[0201] 本實(shí)施例用于說明適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的 制備方法及通過該方法獲得禽流感病毒特性：
[0202] 一種適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的制備方法，包括 W下步驟：
[0203] 1)制備待接種的適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞:將MDCK細(xì)胞裝入搖瓶，在轉(zhuǎn) 速13化pm，溫度37°C、通入濃度為5%的C〇2的條件下，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);然后每12h取樣一 次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);在MDCK細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用新鮮的無血清培養(yǎng)基稀釋至MDCK細(xì)胞 密度為0.5 X 106cel 1 s/mL，并W此為MDCK細(xì)胞起始密度，然后將MDCK細(xì)胞培養(yǎng)72h，得到待 接種的適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞；
[0204] 2)準(zhǔn)備毒種：準(zhǔn)備雞胚源H9N2亞型禽流感病毒；禽流感病毒的病毒含量> 1〇6'化 ID 日 o/O.l血；
[0205] 3)F1代病毒馴化:按培養(yǎng)基體積的1%。接毒量將步驟2)的雞胚源禽流感病毒接種 于步驟1)中獲得的待接種的MDCK細(xì)胞中，并加入化g/mL的TPCK-膜酶進(jìn)行培養(yǎng);每1化檢測(cè) 病毒血凝效價(jià)和病毒滴度并留取F1代培養(yǎng)基上清液樣本，連續(xù)觀察96h;培養(yǎng)F1代病毒的溫 度為37°C;
[0206] 4)F2代病毒馴化:取F1代中病毒血凝效價(jià)最高的時(shí)間點(diǎn)所留取的F1代培養(yǎng)基上清 液樣本，重復(fù)步驟3)的過程，即將F1代培養(yǎng)基上清液樣本接種到新的待接種的MDCK細(xì)胞中， 并檢測(cè)病毒血凝效價(jià)和病毒滴度和留取F2代培養(yǎng)基上清液樣本;培養(yǎng)F2代病毒的溫度為37 V;
[0207] 5)F3代病毒馴化:取F2代中病毒血凝效價(jià)最高的時(shí)間點(diǎn)所留取的F2代培養(yǎng)基上清 液樣本，重復(fù)步驟3)的過程，即將F2代培養(yǎng)基上清液樣本接種到新的待接種的MDCK細(xì)胞中， 并檢測(cè)病毒血凝效價(jià)和病毒滴度和留取F3代培養(yǎng)基上清液樣本;培養(yǎng)F3代病毒的溫度為35 。。
[020引6)F4~F10代病毒馴化:重復(fù)步驟5)的過程培養(yǎng)F4~F10代，得到馴化完成的禽流 感病毒。
[0209] 禽流感病毒的血凝效價(jià)檢測(cè)結(jié)果如表3所示：
[0210] 表3MDCK細(xì)胞馴化病毒血凝效價(jià)
[0211]
[0212]禽流感病毒經(jīng)過MDCK細(xì)胞馴化至F6代，血凝效價(jià)明顯提高；并且在48-7化的血凝 效價(jià)達(dá)到9-101og2。馴化至巧代，血凝效價(jià)穩(wěn)定達(dá)到101og2,連續(xù)傳代到9-10代，血凝效價(jià) 可達(dá)到lllog2。
[0213] 從各代次的禽流感病毒感染MDCK細(xì)胞72h后收取培養(yǎng)基上清液樣本，測(cè)量血凝效 價(jià)及病毒含量，結(jié)果如表4所示：
[0214] 表4馴化毒血凝效價(jià)和病毒含量測(cè)定
[0215]
[0216]
[0217] 馴化禽流感病毒第F10代后7化血凝效價(jià)達(dá)11 log2,病毒含量穩(wěn)定提升，在F10代達(dá) 到 1〇8·8εΙ〇5〇/0.1 血。
[0218] 對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)W上描述的技術(shù)方案W及構(gòu)思，做出其它各 種相應(yīng)的改變W及變形，而所有的運(yùn)些改變W及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的制備方法，其特征 在于包括以下步驟： 1) 制備待接種的適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞：將MDCK細(xì)胞裝入搖瓶，在轉(zhuǎn)速 130rpm，溫度37°C、通入濃度為5%的⑶2的條件下，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；然后每12h取樣一 次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);在MDCK細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用新鮮的無血清培養(yǎng)基稀釋至MDCK細(xì)胞 密度為〇 . 5 X IO6ce11 s/mL，并以此為MDCK細(xì)胞起始密度，然后將MDCK細(xì)胞培養(yǎng)72h，得到待 接種的適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞； 2) 準(zhǔn)備毒種:準(zhǔn)備雞胚源禽流感病毒； 3. F1代病毒馴化:按培養(yǎng)基體積的1%。接毒量將步驟2)的雞胚源禽流感病毒接種于步 驟1)中獲得的待接種的MDCK細(xì)胞中，并加入5yg/mL的TPCK-胰酶進(jìn)行培養(yǎng);每12h檢測(cè)病毒 血凝效價(jià)和病毒滴度并留取Fl代培養(yǎng)基上清液樣本，連續(xù)觀察96h;培養(yǎng)Fl代病毒的溫度為 37 °C； 4. F2代病毒馴化:取Fl代中病毒血凝效價(jià)最高的時(shí)間點(diǎn)所留取的Fl代培養(yǎng)基上清液樣 本，重復(fù)步驟3)的過程，即將Fl代培養(yǎng)基上清液樣本接種到新的待接種的MDCK細(xì)胞中，并檢 測(cè)病毒血凝效價(jià)和病毒滴度和留取F2代培養(yǎng)基上清液樣本;培養(yǎng)F2代病毒的溫度為37°C; 5. F3代病毒馴化:取F2代中病毒血凝效價(jià)最高的時(shí)間點(diǎn)所留取的F2代培養(yǎng)基上清液樣 本，重復(fù)步驟3)的過程，即將F2代培養(yǎng)基上清液樣本接種到新的待接種的MDCK細(xì)胞中，并檢 測(cè)病毒血凝效價(jià)和病毒滴度和留取F3代培養(yǎng)基上清液樣本;培養(yǎng)F3代病毒的溫度為35°C; 6 )F4~FlO代病毒馴化:重復(fù)步驟5)的過程培養(yǎng)F4~FlO代，得到馴化完成的禽流感病 毒。2. 如權(quán)利要求1所述的適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的制 備方法，其特征在于:步驟1)中，所述裝入搖瓶并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞為通過無血 清培養(yǎng)基從需血清貼壁培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞馴化為全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞。3. 如權(quán)利要求2所述的適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的制 備方法，其特征在于:所述全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞通過以下步驟馴化得到： I)將需血清貼壁培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞用培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到80~90%時(shí)，棄去培 養(yǎng)MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)基，用胰酶溶液清洗細(xì)胞層后棄去溶液;再次加入胰酶溶液至覆蓋MDCK 細(xì)胞進(jìn)行消化5~15min;待細(xì)胞變圓后加入含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化;然后收集細(xì)胞 懸液，并將細(xì)胞懸液離心后棄上清，獲得細(xì)胞團(tuán)； Π )將步驟I)中獲得的細(xì)胞團(tuán)用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸至細(xì)胞密度1 .3~I .6 X 106cellS/mL，獲得細(xì)胞重懸液； ΙΠ )將步驟Π )中獲得的細(xì)胞重懸液加入方瓶，在轉(zhuǎn)速30rpm、溫度37°C、5%CO2的條件下 置于搖床中并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過2代培養(yǎng)后將培養(yǎng)的細(xì)胞重懸液轉(zhuǎn)入搖瓶，轉(zhuǎn)速提升 至120rpm;每隔48h用新鮮的無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸液稀釋至細(xì)胞密度為1.3~1.6 X 106ce 11 s/mL，進(jìn)行傳代，獲得適應(yīng)無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞。4. 如權(quán)利要求1-2任一所述的適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病 毒的制備方法，其特征在于:所述無血清培養(yǎng)基按濃度計(jì)，包括以下組分： 基礎(chǔ)代謝營養(yǎng)物： D-葡萄糖 3000 叫 0000mg/L:; 丙酮酸鈉 50 - 600rag/L; L-丙氨酸 5~3Omg/L; L-精氨酸 15:0 ~ 600mg/L; L-天冬醜胺 1.0 ~ 60mg/L; L-天冬氨酸 10 ~ 60mg/L; L-胱氨酸 丨0-80mg/L; L-半胱氣酸 20 - 150mg/L; L-谷氨酸 5 ~ 60mg/L; L-谷氨酰胺 300~ 1500mg/L; 甘氨酸 10 ~ LOQmg/L; L-組氨酸 10 M50mg/L; L-異亮氨酸 20-150mg/L; L-亮氨酸 50 ~ 250mg/L; L-賴氨酸 50~150mg/L; L-曱硫氨酸 20 ~ 150mg/L; L-苯丙氨酸 20 ~ 250mg/L; L-脯氨酸 20 ~ 200mg/L; L-絲氨酸 50 ~ 150mg/L; L-蘇氨酸 50~200mg/L; L-色氨酸 20 ~ 100mg/L; L-釀氣酸 20 ~ IOOmgZL; L-纈氨酸 50 ~ 200mg/L; 核苷酸： 次黃嘌呤 2~25mg/L; /鉤苷 0.1 ~ lmg/L; 腺苷 2~15mg/L; 尿苷 2~_15mgZL; 胞苷 2 ^ 15mg/L; 鳥苷 2~15mg/L; 維生素： D-生物素 0.01 ~0.20mg/L; 葉酸 1~iOmg/L; 煙.醜胺 I _1.0mg/L._; 吡哆醇 1~10mg/L; 硫胺素 l~10mg/L; 核黃素 O I ~ lmg/L; 氯化膽減 10 ~ 5()irig/L; D-泛酸鈣 2~10mg/L; 肌醇 10~50mg/L; 無機(jī)鹽： 硝酸鐵 10~50mg/L; 硫酸亞鐵 0.1 ~ l.mg/L; 硫酸鎂 2〇~丨00mg/L: 氯化鉀 200 ~ 500mg/L; 氯化納 5000 ~ 9000mg/L; 磷酸氫二鈉 50~100mg/L; 磷酸二氫鈉 50 ~ 100mg/L; 亞石西酸納 20 ~ lOOmg/L; 剪切力保護(hù)刑: 5QO ~ 2500mg/L; 抗細(xì)胞結(jié)爾劑: 20- 150mg/L; 酸堿度緩沖劑： 碳酸氫鈉 1000~3000mg/L; 酸堿度指示劑： 酸紅 5~15mg/L; 流感病毒增殖促進(jìn)劑： 膽固醇 1~10mg/L; DL-Ct-生育酚醋酸酯 0.3 ~ 3mg/'L; 豆蔻酸 0.05~0.5mg/L; 棕櫚酸 0.05~0.5mg/L; 硬脂酸 0.05 ~ 0.5mg./L; 氯化鎂 1000 ~5000mg/L; 氯化鈣 5Q~25Qmg/L; 二曱基亞砜 2~20mg/L; 硫酸鋅 〇，:2~2.0mg/L; 硫酸銅 5~25mg/L; 硫酸錳 0.0001 ~ 0.001mg/L; 偏機(jī)酸銨 0 001 ~ 0.005mg/L; 其它添加物： 檸檬酸鐵銨 13,5~40.5mg/L; 腠島素 2~15mg/L; 大豆水解物 丨OOO ~ 5000mg/L; 乙醇胺 I10.mg/L; 谷胱甘肽 0.5~3mg/L〇5. 如權(quán)利要求4所述的適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的制 備方法，其特征在于:所述剪切力保護(hù)劑為嵌段式聚醚F68。6. 如權(quán)利要求4所述的適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的制 備方法，其特征在于:所述抗細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑為硫酸葡聚糖。7. 如權(quán)利要求1-2任一所述的適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病 毒的制備方法，其特征在于:所述無血清培養(yǎng)基通過以下步驟制得： 將原料混合后磨成細(xì)粉，然后將所得細(xì)粉于10~30°C溶劑中溶解，得到混合液;調(diào)節(jié)混 合液的pH至6.3~6.7，定容后得到無血清培養(yǎng)基。8. 如權(quán)利要求1所述的適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的制 備方法，其特征在于:所述禽流感病毒為H9N2亞型禽流感病毒。9. 如權(quán)利要求1所述的適應(yīng)在無血清全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系生長的禽流感病毒的制 備方法，其特征在于：所述步驟2)中，所述雞胚源禽流感病毒的病毒含量多IO 6^EID50/ 0.IrnL010. -種禽流感病毒，其特征在于:通過權(quán)利要求1-9任一所述的制備方法獲得。
【文檔編號(hào)】C12N5/02GK106011083SQ201610486914
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】陳瑞愛, 賴漢漳, 劉玉鵬, 詹烜子, 劉旭平, 麥康聰, 湯欽, 盤偉嵐, 許東蕾, 陳華堅(jiān)
【申請(qǐng)人】廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司, 華東理工大學(xué), 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司