反義microRNA-25及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及反義microRNA?25、含有反義microRNA?25堿基序列的載體、含有反義microRNA?25的組合物，以及反義microRNA?25的組合物作為干預(yù)關(guān)鍵氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)的藥物的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的反義microRNA?25及其相應(yīng)載體或組合物能夠多靶點(diǎn)干預(yù)關(guān)鍵氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)，可用于抗氧化損傷、抗腫瘤、心衰、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病等氧化應(yīng)激相關(guān)疾病治療或預(yù)防藥物中。
【專利說明】
反義microRNA-25及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種氧化應(yīng)激相關(guān)分子，尤其是設(shè)及反義microRNA-25及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 能夠造成視力不可逆損傷的年齡相關(guān)性黃斑變性（Age Related Macular Degeneration, AMD)是一個復(fù)雜的多因性疾病，目前缺乏有效的針對病因的治療措施。氧化 應(yīng)激是AMD的主要發(fā)病機(jī)制之一，視網(wǎng)膜色素上皮(Retinal Pigment化ithelium，RPE)細(xì) 胞為其始發(fā)病變細(xì)胞。但是目前缺少對RPE細(xì)胞氧化損傷作用機(jī)制的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的就是為了提供反義microRNA-25及其應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明在探究microRNA-25在RPE細(xì)胞的氧化損傷中的作用及機(jī)制的時候，發(fā)現(xiàn)W 氯化鉆(CoCb)和糖氧剝奪模型（0巧gen Glucose Deprivation，0GD)兩種手段模擬體外缺 氧/氧化應(yīng)激條件，分別研究兩種形式的氧化損傷對原代RPE細(xì)胞和人RPE細(xì)胞系的 microRNA-25表達(dá)的影響，在體外水平，明確氧化損傷對microRNA-25在R陽細(xì)胞中的誘導(dǎo)效 應(yīng)。W小鼠氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變(Oxygen Induced Retinopathy，0IR)為體內(nèi)缺氧/氧化應(yīng) 激模型，通過qRT-PCR方法檢測神經(jīng)視網(wǎng)膜W及RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體的microRNA-25在常氧組 和缺氧組的表達(dá)差異，通過體內(nèi)實驗進(jìn)一步證實缺氧/氧化應(yīng)激對microRNA-25的誘導(dǎo)效 應(yīng)。通過雙巧光素酶報告實驗驗證與祀基因的體外相互作用，通過功能獲得和缺失實驗了 解microRNA-25對下游祀基因的調(diào)控作用，通過人血管內(nèi)皮的成管實驗和R陽細(xì)胞的吞隧實 驗，探究microRNA-25在缺氧/氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的異常血管發(fā)生和R陽細(xì)胞吞隧功能損害中的 影響，并通過對0IR小鼠模型的實驗性治療來進(jìn)一步探究microRNA-25在氧化損傷中的作 用。通過W上研究明確microRNA-25在WE細(xì)胞氧化損傷中的作用和機(jī)制，分析其在AMD的 發(fā)生發(fā)展中的功能。
[0005] 基于W上研究，本發(fā)明提供一種反義microRNA-25，其為microRNA-25的反義RNA， 其堿基序列如沈9 10^.1所示，1111沈〇1?^4-25的序列如沈9 10^.2所示。
[0006] 該反義microRNA-25可W采用人工合成的方法得到，該合成方法為常規(guī)技術(shù)手段。
[0007] 本發(fā)明第二方面提供所述反義mic;roRNA-25在制備抑制mic;roRNA-25上調(diào)的藥物 中的應(yīng)用。
[000引本發(fā)明第Ξ方面提供含有所述反義microRNA-25堿基序列的載體。
[0009] 本發(fā)明第四方面提供含有所述反義microRNA-25的組合物。
[0010] 本發(fā)明第五方面提供含有所述反義microRNA-25的組合物作為干預(yù)關(guān)鍵氧化應(yīng)激 相關(guān)因子表達(dá)的藥物的應(yīng)用。具體而言，含有反義microRNA-25的組合物用于制備預(yù)防和/ 或治療抗氧化損傷、抗腫瘤、屯、衰、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病的藥物。
[0011 ] 基于上述研究，可知反義mic;roRNA-25可W抑制mic;roRNA-25上調(diào)，而mic;roRNA-25 上調(diào)主要體現(xiàn)在氧化應(yīng)激的條件下，因此，反義mic;roRNA-25或含有反義mic;roRNA-25序列 的載體或含有反義microRNA-25的組合物可W作為干預(yù)關(guān)鍵氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)的藥物 使用，主要應(yīng)用于治療抗氧化損傷、抗腫瘤、屯、衰、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病等 疾病的預(yù)防和/或治療藥物。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的反義mic;roRNA-25及其相應(yīng)載體或組合物能夠多 祀點(diǎn)干預(yù)關(guān)鍵氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)，可用于抗氧化損傷、抗腫瘤、屯、衰、年齡相關(guān)性黃斑 變性、糖尿病視網(wǎng)膜病等氧化應(yīng)激相關(guān)疾病治療或預(yù)防藥物中。
【附圖說明】
[OOU] 圖1為RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激與microRNA-25表達(dá)結(jié)果示意圖；
[0014] 圖2為0IR小鼠模型中，microRNA-25在神經(jīng)視網(wǎng)膜和RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體中的表達(dá) 結(jié)果示意圖；
[0015] 圖3為0IR小鼠模型中，PEDF和VEGF在RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體中的表達(dá)結(jié)果示意圖；
[0016] 圖4為在陽DF的3'UTR區(qū)miR-25的祀向序列在幾個物種中高度保守示意圖；
[0017] 圖5為巧光素酶報告實驗驗證PEDF和ITGAV均為miR-25的可能祀基因；
[001引圖6為RPE細(xì)胞過表達(dá)miR-25后，陽DF和ITGAV的表達(dá)量變化示意圖；
[0019] 圖7為反義miR-25預(yù)處理對0GD引起的ITGAV和陽DF改變的影響的示意圖；
[0020] 圖8為反義miR-25預(yù)處理對0GD引起的吞隧抑制的影響示意圖；
[0021] 圖9為反義miR-25預(yù)處理對0GD引起的成管能力增加的影響示意圖；
[0022] 圖10為反義miR-25預(yù)處理對0IR模型中的新生血管滲漏增加的影響示意圖。
【具體實施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0024] 實施例1
[00 巧]一種反義 microRNA-25,其為 microRNA-25 的反義 RNA，其為 microRNA-25 的反義 1?^八，其堿基序列如沈9 10^.1所示，1111沈〇1?^4-25的序列如沈9 10^.2所示。
[0026] 該反義microRNA-25可W采用人工合成的方法得到，該合成方法為常規(guī)技術(shù)手段。
[0027] 實施例2
[00巧]本實施例W氯化鉆（CoCb)和糖氧剝奪模型（0巧genGlucoseD邱1'；[￥日1:;[0]1，060)兩 種手段模擬體外缺氧/氧化應(yīng)激條件，分別研究兩種形式的氧化損傷對原代WE細(xì)胞和人 R陽細(xì)胞系的microRNA-25表達(dá)的影響。
[0029] 原代RPE細(xì)胞糖氧剝奪12,16,18,20小時，復(fù)氧2小時，通過qRT-PCR檢測miR-25的 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨糖氧時間剝奪的延長，miR-25表達(dá)增加。
[0030] 原代R陽細(xì)胞W不同濃度的氯化鉆溶液處理12小時后，通過qRT-PCR檢測miR-25的 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著處理濃度的增加，miR-25表達(dá)上調(diào)。
[0031] 原代R陽細(xì)胞Κ200μΜ的氯化鉆溶液處理不同時間，通過qRT-PCR檢測miR-25的表 達(dá)，發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的延長，miR-25表達(dá)上調(diào)。
[0032] 兩種形式的缺氧/氧化應(yīng)激(CoCb和0GD)均能誘導(dǎo)原代RPE細(xì)胞中的microRNA-25 上調(diào)。但人R陽細(xì)胞中的microRNA-25只能被0GD模型誘導(dǎo)(結(jié)果未列出），可能是細(xì)胞系與原 代細(xì)胞的差異或者是C0CI2和0GD的差異。
[0033] 如圖1所示，在R陽細(xì)胞氧化應(yīng)激能夠增加 mic;roRNA-25表達(dá)。（圖ΙΑ的橫坐標(biāo)表示 糖氧剝奪的時間，縱坐標(biāo)表示miR-25在RPE細(xì)胞中的相對表達(dá)量;圖1Β的橫坐標(biāo)表示不同濃 度的氯化鉆溶液，ctr表示未處理組即正常對照組，縱坐標(biāo)表示miR-25在WE細(xì)胞中的相對 表達(dá)量；圖1C的橫坐標(biāo)表示200μΜ的氯化鉆溶液處理不同時間，縱坐標(biāo)表示miR-25在RPE細(xì) 胞中的相對表達(dá)量）
[0034] 實施例3
[0035] W小鼠氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變(0巧genInducedRetinopathy，0IR)為體內(nèi)缺氧/氧化 應(yīng)激模型，通過qRT-PCR方法檢測神經(jīng)視網(wǎng)膜W及RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體的microRNA-25在常氧 組和缺氧組的表達(dá)差異，通過體內(nèi)實驗進(jìn)一步證實缺氧/氧化應(yīng)激對microRNA-25的誘導(dǎo)效 應(yīng)。
[0036] 0IR小鼠模型的構(gòu)建方法：
[0037] 將模型組小鼠于生后第7d時，隨同2只哺乳母鼠放置到連接測氧儀的動物實驗艙 中，.化/min的流量通入氧氣他），使氧濃度穩(wěn)定控制在75% ±2%。日光照明。每天定時 規(guī)律地打開氧艙清掃、換敷料(保持干燥）、換食加水，并將在正常環(huán)境的哺乳母鼠與艙內(nèi)母 鼠更替。至小鼠生后第12加寸將模型組小鼠及其哺乳母鼠返回正?？諝猸h(huán)境(21%化）中，W 誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管產(chǎn)生。正常組小鼠始終放置在正?？諝庵形桂B(yǎng)。
[0038] qRT-PCR 方法：
[0039] 1.總 RNA 抽提：
[0040] 視網(wǎng)膜或脈絡(luò)膜組織用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理后加入TRIzol，單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在 培養(yǎng)皿中加入TRIzol，用移液器吸打幾次。
[0041 ] 每使用ImURIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
[0042] 4°C 10000 Xg 離屯、15 分鐘。
[0043] 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，用同體積異丙醇沉淀RNA，室溫放置10分鐘。
[0044] 4°C10000Xg離屯、10分鐘，離屯、前看不出RNA沉淀，離屯、后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀 沉淀。移去上清。
[0045] 用75 %乙醇洗涂RNA沉淀。每使用ImlTRIzol至少加lml75 %乙醇。4°C不超過7500 X g離屯、5分鐘，棄上清。驚5-10分鐘，加DEPC水充分溶解后nano化op測濃度。
[0046] 2.具體逆轉(zhuǎn)錄方法參考？1'；[111日-5沈1911?化日日旨日]11:1(;[1:(061104.1'日4日^)說明書。簡 述如下：首先配置A，B兩個混合物，A混合物終體積為化1，不足時用DEPC水不足，過量時，減 少RNA用量，然后A混合物70°C lOmin，置于冰上2-3min，加入化1B混合物，混勻，然后放入PCR 儀，程序設(shè)定為30°C lOmin，42°C Ihr，70°C 15min，4°C，隨機(jī)9具體引物可商品化購得，miR-25 的特異性逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物由本實驗室自行設(shè)計。
[0047] A混合物中，總RNA0.化g，1(Μ隨機(jī)引物2.化1，SiiM莖環(huán)引物化1。
[004引 B混合物中，5Xbuffer 2μ1，10πιΜ dNTP 0.5yl，RTase 0.化1。
[0049] 3.實時巧光定量PCR
[0050] 用SYBN-GREEN相對定量法，miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物Wu6作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增普通的基因 (即非miRNA)時，使用通用引物的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，擴(kuò)增miRNA及其內(nèi)參基因時，使用由莖環(huán)引物 和隨機(jī)引物同時逆轉(zhuǎn)錄出來的產(chǎn)物，二者的反應(yīng)體系略有不同，反應(yīng)程序一致，具體如下： [0化1] miRNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的qPCR:
[0052] 擴(kuò)增miRNA的反應(yīng)體系：
[0053] 2Χπ?χ10μ1 [0化4] ΙΟμΜ上游引物化1
[0化5] ΙΟμΜ下游引物1.化1
[0056] dd肥03.6μ1
[0057] cDNA 化 1
[005引擴(kuò)增u6的反應(yīng)體系，同擴(kuò)增其它非miRNA基因一樣。
[0059] 目的基因相對表達(dá)量的計算，與擴(kuò)增其它基因一樣，采用2AET，或2AAET法，只與內(nèi) 參基因比較，最后獲得相對內(nèi)參基因的表達(dá)量的方法為2AET，而如果與內(nèi)參基因比較后，再 同對照組比較，最后獲得的是相對于對照組的相對表達(dá)量的方法為法。
[0060] 圖2所示，在0IR小鼠模型，不論是RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體還是神經(jīng)視網(wǎng)膜，缺氧組 microRNA-25的表達(dá)都顯著高于常氧組，更進(jìn)一步證實缺氧/氧化應(yīng)激對microRNA-25的誘 導(dǎo)效應(yīng)。圖2為qRT-PCR檢測0IR模型小鼠，不同時間microRNA-25在視網(wǎng)膜(左側(cè)圖）的表達(dá)， W及在RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體(右側(cè)圖）的表達(dá)，每組數(shù)據(jù)都表達(dá)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差，*表示p< 0.05，**表示pCO.Ol，NS表示無顯著差異。（圖2中，橫坐標(biāo):采樣時間點(diǎn)；縱坐標(biāo):miR-25在 RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體中的相對表達(dá)量:pdl2:出生后12天;pdl5:出生后15天;pdl7:出生后17 天;pd21:出生后21天;黑色柱形圖：0IR(氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型組）；白色柱形圖：CTR(正 常對照組）。
[0061] 但是如圖3所示，色素上皮衍生因子（PEDF)下降，血管內(nèi)皮生長因子（英文： vascularendothe 1 ialgrowthfactor，簡稱：VEGF)。圖3為qRT-PCR檢測0IR模型小鼠，不同時 間PEDF在視網(wǎng)膜(左側(cè)圖）的表達(dá)，W及VEGF在視網(wǎng)膜(右側(cè)圖）的表達(dá)，每組數(shù)據(jù)都表達(dá)為 均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差，*表示P <0.05，**表示P <0.01，NS表示無顯著差異。
[0062] 圖3是通過qRT-PCR方法檢測陽DF和VEGF在不同時間點(diǎn)，在正常對照組和0IR模型 組中小鼠的RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體中的相對表達(dá)量。
[0063] 圖3的左側(cè)圖中，橫坐標(biāo):采樣時間點(diǎn)；縱坐標(biāo):P抓F在RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體中的相對 表達(dá)重:pdl2:出生后12天；pdl5:出生后15天;pdl7:出生后17天;pd21:出生后21天；黑色柱 形圖：0IR(氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型組）；白色柱形圖：CTR(正常對照組）
[0064] 圖3的右側(cè)圖中，橫坐標(biāo):采樣時間點(diǎn);縱坐標(biāo):VEGF在RPE/脈絡(luò)膜復(fù)合體中的相對 表達(dá)重:pdl2:出生后12天；pdl5:出生后15天;pdl7:出生后17天;pd21:出生后21天；黑色柱 形圖：0IR(氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型組）；白色柱形圖：CTR(正常對照組）
[00化]microRNA-25能夠同時祀向色素上皮衍生因子(P抓F)和口 GAVemicroRNA-25的種 子序列與口 GAV的祀序列有10個堿基完全互補(bǔ)因此能夠在mRNA水平上抑制口 GAV，而PEDF的 3'UTR區(qū)只有6個堿基與microRNA-25種子序列互補(bǔ)（圖4)，microRNA-25對陽DF的調(diào)控可能 更多的存在于蛋白水平。陽DF是microRNA-25的祀基因目前尚無文獻(xiàn)報道。經(jīng)過巧光素酶報 道分析，驗證PEDF是mi croRNA-25的祀基因（圖5)。在RPE細(xì)胞過表達(dá)能夠引起陽DF和ITGAV 降低（圖6)
[0066] 雙巧光素酶報告實驗的具體步驟：
[0067] 1.3'UTR報告質(zhì)粒的構(gòu)建
[006引首先設(shè)計大鼠陽DF的3 ' UTR引物，然后提取大鼠組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增:RNA提 取和逆轉(zhuǎn)錄方法同前。將回收的DNA產(chǎn)物及psiC肥CK-2各自用Notl，xohl雙酶切，體系如下： Notl，xohl各化1，10 XH緩沖液化1，0.1 %BSA2yl，0.1 %Triton-100化1，DNA《化 1，其余用 d地20補(bǔ)足。2. SygpsiC肥CK-2質(zhì)粒，酶切提示同DAN產(chǎn)物的酶切體系，酶切37°C，3小時，酶 切結(jié)束后過柱純化。酶切后的DNA片段和psiC皿CK-2連接，體系如下：10 XT4連接酶緩沖液 2.5μ1，0ΝΑ片段和載體DNA片段的摩爾比例控制在3~10:1，1μ1Τ4連接酶，d地20補(bǔ)足。16°C 連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化:取10化1感受態(tài)，加1化1連接產(chǎn)物，輕輕混勻后放置冰上30min，放 入42°C水浴中90s進(jìn)行熱休克，期間不要搖動試管;冰浴2min;向管中加入80化1的LB培養(yǎng)基 (不含抗菌素)輕輕混勻，37°C搖床(100-150r/min)，溫和震蕩45min;將菌液離屯、，棄上清， 留10化1上清，加至含lOOug/mlAmp的LB平板培養(yǎng)皿中，用火焰燈燒過的玻璃涂布棒涂布均 勻。將其放置在37Γ恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置 過來放入37 °C恒溫培養(yǎng)箱過夜;次日挑單克隆，搖菌，測序。陽性克隆，保種后大提質(zhì)粒
[0069] 2.雙巧光素酶報告實驗
[0070] 293T細(xì)胞鋪24孔板，細(xì)胞長至70%匯合時，用脂質(zhì)體119〇2000，共轉(zhuǎn)染日旨〇-11111?-25 (miR-25激動劑)和psiC肥CK-P邸。-3'1]了1?，日邑〇-11111?-25的終濃度為10碰，口31(：肥0(斗邸尸-3' UTR終濃度為InM，設(shè)置4個復(fù)孔，同樣ago-miR-25和psiC肥CK-ITGAV-3 ' UTR共轉(zhuǎn)染，設(shè)置4個 復(fù)孔，WpsiC肥CK-2的空載體作為陰性對照。轉(zhuǎn)染后6小時，吸出轉(zhuǎn)染液，更換為完全培養(yǎng)基 (高糖DMEM，10%FBS)，48小時后，按雙巧光素酶報告系統(tǒng)說明書操作，簡介如下:每孔加100 μ11 X化B裂解液，室溫，溫和搖15分鐘，收裂解液，離屯、收取上清。白色不透光的96孔酶標(biāo)板 中每孔加剛剛裂解的上清液10化，加入1(Κ)化預(yù)先混好的LARII，2s后測數(shù)據(jù)。每孔添加10化 化預(yù)先混好的Stop&Glo試劑，靜止2s后，測數(shù)據(jù)。
[0071] 圖4表示在PEDF的3'UTR區(qū)miR-25的祀向序列（加亮區(qū)）在幾個物種中高度保守。 mmu:小家鼠，:rno:大鼠，C化:家犬，cpo:豚鼠
[0072] 圖5表示通過巧光素酶報告實驗分析，P邸F(左側(cè)圖）和口GAW右側(cè)圖）是miR-25的 祀基因。左側(cè)圖橫坐標(biāo)表示實驗分組:psiC肥CK-P抓F-3 'UTR表示轉(zhuǎn)染插入了陽DF的3 ' UTR 序列的質(zhì)粒組，psiC肥CK表示轉(zhuǎn)染空載體的對照組。黑色柱狀圖表示共轉(zhuǎn)染miR-25序列組， 白色柱狀圖表示共轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的陰性對照組。該結(jié)果提示與其它各組相比，只有同時轉(zhuǎn) 染miR-25和psiC肥CK-P抓F-3'UTR的細(xì)胞的巧光素比值才會顯著下降，提示二者存在相互 作用?？v坐標(biāo)表示相對巧光素酶活性。
[0073] 右側(cè)圖橫坐標(biāo)表示實驗分組:psiCHECK-ITGAV-3'UTR表示轉(zhuǎn)染插入了 ITGAV的3' UTR序列的質(zhì)粒組，psiCHECK表示轉(zhuǎn)染空載體的對照組。黑色柱狀圖表示共轉(zhuǎn)染miR-25序列 組，白色柱狀圖表示共轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的陰性對照組。該結(jié)果提示與其它各組相比，只有同時 轉(zhuǎn)染miR-25和psiCHECK-ITGAV-3'UTR的細(xì)胞的巧光素比值才會顯著下降，提示二者存在相 互作用?？v坐標(biāo)表示相對巧光素酶活性。
[0074] 圖6表明WE細(xì)胞過表達(dá)miR-25后，通過qRT-PCR方法檢測，miR-25表達(dá)量明顯上 調(diào)，陽DF和口GAV的表達(dá)量顯著下降，提示miR-25能同時調(diào)節(jié)陽DF和口GAV的表達(dá)。圖6橫坐 標(biāo)表示Ξ種基因(miR-25,陽DFJTGAV)，縱坐標(biāo)表示Ξ種基因的相對表達(dá)量。
[0075] 在RPE細(xì)胞中抑制microRNA-25能夠?qū)?GD氧化損傷引起的PEDF分泌減少和 ITGAV表達(dá)下降（圖7似及吞隧功能抑制（圖8)。
[0076] 圖7左側(cè)圖表示qRT-PCR檢測抑制miR-25對0GD引起的ITGAV下調(diào)的影響。每組數(shù)據(jù) 都表達(dá)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤;**表示和對照組相比P<〇. 01。橫坐標(biāo)表示Ξ個分組，第一組為正常 對照組(R陽細(xì)胞用陰性對照的無關(guān)序列轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時，不給予OGD處理），第二組為OGD 處理組(WE細(xì)胞用陰性對照的無關(guān)序列轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時，給予OGD處理），第Ξ組為反義 miR-25預(yù)處理組(R陽細(xì)胞用反義miR-25轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時后，給予OGD處理），縱坐標(biāo)表示 ITGAV的相對表達(dá)量。
[0077]圖7左側(cè)圖實驗步驟：首先根據(jù)實驗分組，對RPE細(xì)胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)的序列，使用 (1 ifetechnology的1 ipo2000試劑），轉(zhuǎn)染48小時候，施加0GD處理，然后提總RNA，通過qRT- PCR檢測ITGAV的相對表達(dá)量。
[007引圖7右側(cè)圖表示ELISA檢測抑制miR-25對0GD引起的PEDF分泌減少的影響。每組數(shù) 據(jù)都表達(dá)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤;**表示和對照組相比P<0. 01。橫坐標(biāo)表示Ξ個分組，第一組為正 常對照組(WE細(xì)胞用陰性對照的無關(guān)序列轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時，不給予0GD處理），第二組為 0GD處理組(R陽細(xì)胞用陰性對照的無關(guān)序列轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時，給予0GD處理），第Ξ組為反 義miR-25預(yù)處理組(R陽細(xì)胞用反義miR-25轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時后，給予0GD處理），縱坐標(biāo)表 示PEDF的含量，單位為ng/mL。分別收集Ξ組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染階段和0GD處理階段的細(xì)胞培養(yǎng)基， 通過化ISA試劑盒檢測培養(yǎng)液中PEDF的含量，通過實驗發(fā)現(xiàn)，0GD引起的PEDF分泌減少能夠 被反義miR-25預(yù)處理矯正。
[0079] 圖8表示通過吞隧實驗檢測抑制miR-25對0GD引起的吞隧抑制的影響。標(biāo)尺為25μ m，藍(lán)色代表細(xì)胞核，紫色為緊密連接蛋白（Ζ0-1)，綠色表示W(wǎng)E細(xì)胞內(nèi)吞的外節(jié)，黃色為結(jié) 合在R陽細(xì)胞膜上的外節(jié)。a圖：RPE細(xì)胞用陰性對照的無關(guān)序列轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時，不給予 0GD處理;b: R陽細(xì)胞用陰性對照的無關(guān)序列轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時，給予0GD處理;C: R陽細(xì)胞用 陰性對照的無關(guān)序列轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時，給予0GD處理。本實驗結(jié)果提示，0GD引起的WE細(xì) 胞內(nèi)吞和結(jié)合的外節(jié)減少可W被反義miR-25預(yù)處理矯正。
[0080] 吞隧實驗步驟：
[0081] 首先制備豬外節(jié)，然后用NHS-LC-LC-生物素標(biāo)記豬外節(jié)，將其按一定濃度與完全 培養(yǎng)基混合，在0GD處理的復(fù)氧階段，將原來的培養(yǎng)基更換為含有豬外節(jié)的培養(yǎng)基，解育3- 4小時，PBS洗3次，每次5分鐘，然后用4 % PFA，室溫固定10分鐘，然后PBS洗，充分去除殘余的 PFA，用1 %BSAPBS溶液封閉10分鐘，然后抗小鼠的化odopsin室溫解育半小時，PBS洗3次每 次15分鐘，徹底清楚殘留的化odopsin，然后解育抗兔的Z0-1，4°C過夜。次日，PBS洗3次，然 后用0.1%時1扣11乂-100?85溶液透膜5-10分鐘，然后與〔￥5-抗兔，〔￥3-抗小鼠和。11'(：- AVIDIN-起室溫解育1小時。DAPI染核，然后封片，激光共聚焦顯微鏡拍照。內(nèi)吞進(jìn)R陽細(xì)胞 的外節(jié)發(fā)綠光，而結(jié)合在RPE細(xì)胞表面的外節(jié)由于結(jié)合了化odops in可W發(fā)紅光，同時外節(jié) 標(biāo)記的生物素又能與FITC-AVIDIN結(jié)合而發(fā)綠光。因此重疊圖像顯示，R陽細(xì)胞外的P0S為黃 色，而內(nèi)吞進(jìn)WE的P0S為綠色。R陽細(xì)胞的邊緣，被Z0-1染出，帶CY5巧光，人肉眼無法分辨， 但激光共聚焦顯微鏡可W分辨出來。運(yùn)樣根據(jù)外節(jié)的位置及其所顯示的顏色也能判斷是內(nèi) 吞還是結(jié)合的外節(jié)。選擇有代表性的視野，每個樣本至少數(shù)50個細(xì)胞，計數(shù)總的吞隧外節(jié)數(shù) (綠色），和結(jié)合的外節(jié)數(shù)(黃色），但是由于專利附圖為黑白圖，在圖中顯示不到綠色和黃 色，二者之差即為內(nèi)吞的外節(jié)數(shù)。最后W每個細(xì)胞平均結(jié)合的外節(jié)數(shù)和內(nèi)吞的外節(jié)數(shù)為指 標(biāo)來衡量，不同組的吞隧功能的差異。
[0082] 0GD處理的R陽細(xì)胞，如果該組細(xì)胞未提前抑制microRNA-25,則其來源的條件培養(yǎng) 基6小時生成的血管數(shù)量明顯多于microRNA-25抑制組。運(yùn)一結(jié)果提示，缺氧/氧化應(yīng)激引起 的促新生血管功能可能是mic;roRNA-25部分依賴的，由于mic;roRNA-25在缺氧/氧化應(yīng)激中 上調(diào)，通過祀向，抑制陽DF，發(fā)揮促新生血管的作用。使用IMAGEJ軟件計數(shù)每組至少5-6個視 野的血管分支數(shù)。
[0083] 圖9A，通過成管實驗檢測抑制miR-25對0GD引起的促新生血管作用。a:條件培養(yǎng)基 來自第一組為正常對照組(RPE細(xì)胞用陰性對照的無關(guān)序列轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時，不給予0GD 處理）；b:條件培養(yǎng)基來自第二組為0GD處理組(R陽細(xì)胞用陰性對照的無關(guān)序列轉(zhuǎn)染預(yù)處理 48小時，給予0GD處理）；C:條件培養(yǎng)基來自第Ξ組為反義miR-25預(yù)處理組(WE細(xì)胞用反義 miR-25轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時后，給予0GD處理）。X 10倍。
[0084] 圖9B，生成血管的統(tǒng)計，該圖橫坐標(biāo)表示用來自3個實驗組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人視網(wǎng) 膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞，Ξ個實驗組分別為第一組為正常對照組(R陽細(xì)胞用陰性對照的無關(guān)序 列轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時，不給予0GD處理），第二組為0GD處理組(R陽細(xì)胞用陰性對照的無關(guān)序 列轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時，給予0GD處理），第Ξ組為反義miR-25預(yù)處理組(WE細(xì)胞用反義miR- 25轉(zhuǎn)染預(yù)處理48小時后，給予0GD處理）。收集Ξ組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染階段和0GD處理階段的細(xì)胞培 養(yǎng)基做為成管實驗的條件培養(yǎng)基。縱坐標(biāo)表示平均每個視野的血管分支數(shù)，值越大，代表成 管能力越強(qiáng)。本結(jié)果提示，只轉(zhuǎn)染陰性無關(guān)序列，然后給予0GD處理RPE細(xì)胞后收集的條件培 養(yǎng)基具有較強(qiáng)的成管能力，但預(yù)先轉(zhuǎn)染miR-25的反義序列，在給予0GD處理，該組條件培養(yǎng) 基的成管能力顯著下降，可能與PEDF的分泌量恢復(fù)(圖7右側(cè)圖）有關(guān)。
[0085] 圖9成管實驗具體方法：
[00化]1.人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞巧umanRetinalMicrovascularEndothelialCells， HRMEC)的培養(yǎng)。該原代細(xì)胞購于Angio-Proteomie(ΜΑ，USA)，培養(yǎng)基為ECM，5%FBS，1 %P/S， 在鋪細(xì)胞之前，培養(yǎng)皿要用1-化g/cm2的牛血漿纖連蛋白包被，37 °C解育2小時后，回收纖連 蛋白溶液，再用d地20沖洗一遍，然后即可鋪細(xì)胞，包被好的培養(yǎng)皿不能儲存留待W后用?；?收的纖連蛋白溶液，放于4°C保存，可重復(fù)用1-2次。
[0087] 2.ma化igel基質(zhì)膠，4°C融化，按15化1/孔，均勻包被預(yù)冷過的48孔板，37°C放置1 小時后，備用。
[0088] 3. HRMEC膜酶消化，用完全培養(yǎng)基重懸，按2-3 X 10^孔的濃度鋪板，細(xì)胞培養(yǎng)箱解 育1小時后，將完全培養(yǎng)基替換為條件培養(yǎng)基，每隔2小時觀察一次，W便及時發(fā)現(xiàn)處理組和 對照組的差別。
[0089] 圖10中上排的Ξ幅圖表示通過視網(wǎng)膜鋪片觀察抑制miR-25對0IR引起的新生血 管滲漏的影響。a:常氧組+注射陰性對照病毒;b:0IR組+注射陰性對照病毒;c:0IR組+注射 lenti-anti-miR-25。X5倍。
[0090] 圖10下排的兩幅圖表示利用閒0T0S冊P3.0標(biāo)記新生血管滲漏區(qū)。b: 0IR組+注射陰 性對照病毒；C:0IR組+注射lenti-anti-miR-25，X5倍。
[0091] 圖10具體實驗步驟：
[0092] 構(gòu)建0IR小鼠模型，出生后12天時進(jìn)行視網(wǎng)膜下腔注射lenti-anti-miR-25和陰性 對照病毒(可從公司購買也可W自己制備），左右眼自身對照；常氧注射陰性對照病毒。5天 后小鼠進(jìn)行屯、臟灌注，做視網(wǎng)膜鋪片。觀察視網(wǎng)膜缺血，新生血管等情況。
[0093] 視網(wǎng)膜下腔注射：
[0094] 剛出氧艙的OIR小鼠 （pd 12)，立刻用1 % avert in (用0.9 %的生理鹽水配置），按 O.lml/lOg的劑量腹腔注射麻醉，然后進(jìn)行視網(wǎng)膜下腔注射濃縮的Lenti-anti-miR-25，W 及陰性對照Lenti-anti-ctr，各化1，左右眼自身對照。處理后的小鼠注意保溫，pdl2小鼠尚 未完全睜眼，所W需要小屯、剪開連著的眼險，注意避免出血，阻礙注射視野并傷害小鼠。 [00M]屯、臟灌注，視網(wǎng)膜鋪片：
[0096] 首先將5%葡萄糖溶液和PBS緩沖液按4:1的體積比混合，并過濾，配置成細(xì)胞膜紅 色巧光探針(D i 1)溶解液。
[0097] 按每100m曲i 1加16.7ml的100 %乙醇的比例，配置Di 1的儲存液，避光室溫，溫和搖 床過夜。要灌注之前將Di 1的儲存液用溶解液50倍稀釋，配置成工作液。
[0098] 將小鼠用avertin麻醉，四肢固定，剪開胸腔，進(jìn)行左屯、室灌注，先用PBS灌注，待物 血液流出時，灌注Dil工作液(每只小鼠5ml灌注液），然后再灌注4%PFA。灌注后，取下眼球， 可W泡在PBS中4°C存放，也可W馬上在體視顯微鏡下，去除眼前節(jié)，小屯、取出視網(wǎng)膜，在載 玻片上剪成6瓣，然后用加抗巧滅的封片劑封片，拍照。一旦視網(wǎng)膜鋪片完成，就要馬上在巧 光顯微鏡下觀察，不能4°C存放，防止染料泄露。
[0099] 一定程度的氧化損傷通過上調(diào)microRNA-25促進(jìn)R陽細(xì)胞異常增殖，減少PEDF的分 泌，抑制RPE細(xì)胞的吞隧功能，從而促進(jìn)了 AMD的發(fā)生和發(fā)展。祀向RPE的抗microRNA-25的干 預(yù)方法可能是個有效的針對病因的AMD治療手段。祀向microRNA-25也是治療異常新生血管 的一個策略。
[0100] 上述的對實施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。 熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可W容易地對運(yùn)些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般 原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領(lǐng) 域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的掲示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0101：
【主權(quán)項】
1. 一種反義microRNA-25，其特征在于，為microRNA-25的反義RNA，其堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 一種如權(quán)利要求1所述的反義microRNA-25在制備抑制microRNA-25上調(diào)的藥物中的 應(yīng)用。3. -種含有權(quán)利要求1所述的反義microRNA-25堿基序列的載體。4. 一種含有權(quán)利要求1所述的反義microRNA-25的組合物。5. -種含有權(quán)利要求1所述的反義microRNA-25的組合物作為干預(yù)關(guān)鍵氧化應(yīng)激相關(guān) 因子表達(dá)的藥物的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，含有反義microRNA-25的組合物用于制備 預(yù)防和/或治療抗氧化損傷、抗腫瘤、心衰、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病的藥物。
【文檔編號】A61P3/10GK106011140SQ201610394192
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】徐國彤, 呂立夏, 張介平
【申請人】同濟(jì)大學(xué)