一種microRNA檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種microRNA檢測方法，屬于光學生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]成熟的microRNA是一類單鏈、非編碼蛋白、短的內(nèi)源性RNA(長度約19-23個核苷酸XMicroRNA作為重要的基因表達的后轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以調(diào)節(jié)信使核糖核酸的分裂或翻譯抑制。MicroRNA在許多生物進程中起著重要作用，這不僅包括癌癥的早期診斷和預(yù)后指標，還包括介入治療以及癌癥藥物的發(fā)現(xiàn)。所以，開發(fā)靈敏度高且選擇性好的microRNA檢測方法非常必要。
[0003]體外聚合核苷酸因具有顯著的信號放大能力，作為一個強有力的工具廣泛應(yīng)用于生物分析中。在研究microRNA的檢測方法方面，體外聚合核苷酸顯示出其巨大的應(yīng)用潛能，如，聚合酶鏈反應(yīng)、滾環(huán)擴增反應(yīng)以及鏈置換反應(yīng)等。大多數(shù)傳感器基于熒光分析法，需使用熒光基團或染料標記的探針作為信號源。但是設(shè)計合成這些信號源通常操作復雜或昂貴或需要大量、多步、費時的實驗。更重要的是，這些信號源一般有較強的非特異性吸附，使得制備的傳感器對環(huán)境非常敏感，同時也降低了靈敏度。近年來，做為代替熒光基團的理想的候選者，以DNA為模板合成的熒光銅納米粒子或銅納米簇(Cu NCs)引起人們越來越多的關(guān)注。由于納米簇具有非常小的尺寸，較弱的毒性，優(yōu)秀的光學性質(zhì)和良好的水溶性與生物相容性，在生物化學應(yīng)用方面顯示出巨大的潛力。然而，迄今為止，利用體外聚合核苷酸擴增反應(yīng)和以單鏈DNA為模板合成Cu NCs相結(jié)合用于microRNA的檢測技術(shù)尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供了一種microRNA檢測方法，該方法對microRNA的檢測具有背景低、靈敏和簡單快速的優(yōu)點。
[0005]本發(fā)明是這樣來實現(xiàn)的，一種microRNA檢測方法，其特征在于步驟如下:
(1)雙聚合酶延伸尿嘧啶序列:將已知含量的microRNA與模板DNA混合，75°(:退火雜交15 min后慢慢冷卻至室溫，加入含聚合酶Klenow片段、脫氧尿啼啶三磷酸核苷和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的緩沖溶液，在35 °C水浴中反應(yīng)4 h，制成聚尿嘧啶堿基序列；
(2)合成熒光銅納米簇:將抗壞血酸鹽加入到步驟(I)的聚尿嘧啶堿基序列溶液中，再加入C11CI2，室溫下反應(yīng)1min，制成以聚尿啼啶堿基序列為模板的紅色焚光銅納米簇，得到含紅色熒光銅納米簇的溶液；
(3)采用熒光分光光度計標定microRNA濃度與銅納米簇紅色熒光強度的標準關(guān)系曲線；
(4)將待測樣品與模板DNA混合，75°(:退火雜交15 min后慢慢冷卻至室溫，加入含聚合酶Klenow片段、脫氧尿嘧啶三磷酸核苷和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的緩沖溶液，在35 °C水浴中反應(yīng)4 h，制成聚尿嘧啶堿基序列；
(5)將抗壞血酸鈉加入到步驟(4)的聚尿嘧啶堿基序列溶液中，再加入CuCl2,室溫下反應(yīng)lOmin，制成以聚尿嘧啶堿基序列為模板的紅色熒光銅納米簇，得到含紅色熒光銅納米簇的溶液;采用熒光分光光度計測定含紅色熒光銅納米簇的溶液的紅色熒光強度，所得紅色熒光強度結(jié)果與標準關(guān)系曲線對比，計算得出microRNA濃度。
[0006]檢測原理為:當microRNA存在時，引物microRNA與模板DNA雜交形成引物-模板復合物;加入聚合酶Klenow片段使其綁定在引物-模板復合物中引物的3羥基末端，催化引物延伸反應(yīng)，生成與模板DNA互補的短DNA序列;加入末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，將脫氧尿嘧啶三磷酸核苷添加到新生成的短DNA序列的3’-羥基末端，催化脫氧尿嘧啶三磷酸核苷沿著短DNA序列的5’端向3’端延伸而形成聚尿嘧啶堿基序列；加入CuCl2和抗壞血酸鈉，以聚尿嘧啶堿基序列為模板原位生成銅納米簇，銅納米簇的熒光強度隨microRNA濃度的增加而增強。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)效果是:本發(fā)明利用聚合酶Klenow片段和脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶對脫氧尿嘧啶三磷酸核苷在microRNA-DNA復合物上的延伸作用，形成聚尿嘧啶堿基序列，加入CuCl2和抗壞血酸鈉后原位生成以聚尿嘧啶堿基序列為模板的銅納米簇，銅納米簇的熒光強度與microRNA濃度呈正相關(guān)，據(jù)此實現(xiàn)對microRNA的檢測，該方法具有背景低、靈敏和簡單快速的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0008]圖1是(A)熒光發(fā)射和激發(fā)光譜，(a)含和(b)不含microRNA-21的發(fā)射光譜，(C)含microRNA-21的最大激發(fā)光譜。內(nèi)插圖:凝膠電泳圖。條帶M: ladder marker;條帶O和I分別是(0)不含和(I)含microRNA-21的樣品。(B)紫外-可見吸收光譜，內(nèi)插圖為(I)不含和(2)含m i croRNA-21的樣品在紫外燈照射下的照片。
[0009]圖2是CuNCs的(A)透射電子顯微鏡圖和(B)原子力顯微鏡圖。
[0010]圖3是(A)不同濃度microRNA-21(0，l，2，5，10，20，50，100，200，500，1000pM)存在時的熒光光譜圖。(B)熒光強度與microRNA-21濃度的關(guān)系曲線，內(nèi)插圖為熒光強度與m i croRNA-21濃度的對數(shù)關(guān)系曲線。
[0011]圖4是(A)分析方法的特異性。(B)實際樣品檢測，內(nèi)插圖為紫外燈下得到的相對應(yīng)的細胞溶解產(chǎn)物的照片。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，本發(fā)明并不限于此。
[0013]實施例1
(I)雙聚合酶延伸尿嘧啶序列:將microRNA與模板DNA(pDNA)混合，75 °(:退火雜交15min后慢慢冷卻至室溫，加入含聚合酶Klenow片段(KFexcT)、脫氧尿啼啶三磷酸核苷和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(的緩沖溶液，在35 °C水浴中反應(yīng)4 h，制成聚尿嘧啶堿基序列。
[0014](2)合成熒光銅納米簇:將抗壞血酸鹽加入到步驟(I)的聚尿嘧啶堿基序列溶液中，再加入C11CI2，室溫下反應(yīng)1min，制成以聚尿啼啶堿基序列為模板的紅色焚光銅納米簇。
[0015]由圖1A可見，當存在microRNA-21時，以雙聚合酶延伸尿嘧啶形成的聚尿嘧啶堿基序列為模板原位合成的Cu NCs在600 nm處有強的焚光發(fā)射峰(曲線a)，最佳激發(fā)波長為340nm(曲線C)。然而，在沒有microRNA-21存在時，則沒有明顯的熒光發(fā)射峰出現(xiàn)(曲線b)，表明，在沒有生成Cu NCs。采用瓊脂糖凝膠電泳對雙聚合酶延伸尿嘧啶的反應(yīng)產(chǎn)物進行分析(內(nèi)插圖)，當存在mi croRNA-21時，反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)出明顯的長拖尾現(xiàn)象(條帶I)，表明反應(yīng)合成了高分子量的聚尿嘧啶堿基結(jié)構(gòu);而當沒有microRNA-21存在時，則未獲得高分子量的產(chǎn)物(如條帶O所示XCu