一種與植物應(yīng)對干旱脅迫相關(guān)的miRNA——ghr?miR17及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與植物應(yīng)對干旱脅迫相關(guān)的miRNA——ghr?miR17，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其前體序列如SEQ ID NO：3所示，其前體序列的編碼基因如SEQ ID NO：4所示。利用本發(fā)明的miRNA能夠分析和調(diào)節(jié)棉花的抗旱性，對棉花應(yīng)對環(huán)境脅迫的試驗研究進而培育優(yōu)良的棉花作物品種具有實際應(yīng)用意義。
【專利說明】一種與植物應(yīng)對干旱脅迫相關(guān)的mi RNA——ghr-miR17及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種抗旱相關(guān)的新miRNA，尤其是一種來源于棉花的、能夠用于分析和調(diào)節(jié)棉花抗旱性的新miRNA;本發(fā)明還涉及此miRNA的前體、其前體的編碼基因及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]非生物脅迫影響植物的生長發(fā)育，影響農(nóng)作物的產(chǎn)量，干旱脅迫是重要的非生物脅迫之一。在干旱脅迫下，棉花根系向土壤深層伸展，地上部分的主莖、果枝均受到抑制，節(jié)間縮短，植株變小，根莖比增大。另外，干旱脅迫下，棉花葉片氣孔部分或完全關(guān)閉，光合作用受到影響，蕾鈴脫落增加，降低產(chǎn)量。全世界干旱與半干旱地區(qū)耕地面積共約2.74億公頃，占總耕地的20%，對棉花抗旱性進行研究，擴大干旱和半干旱地區(qū)棉花種植面積對解決棉花供需矛盾和棉糧爭地矛盾意義重大。
[0003]miRNA是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一種長20-24 nt的內(nèi)源性非蛋白編碼RNAt3HiiRNA基因最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生pr1-miRNA，然后在核內(nèi)被Drosha酶加工成大約70 nt的具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA。隨后pre-miRNA被轉(zhuǎn)運出核，在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通過序列互補與特定革巴基因的mRNA結(jié)合，引起mRNA降解或抑制mRNA翻譯從而對基因的表達起到負(fù)調(diào)節(jié)作用(Llave et al., 2002; Palatnik et al., 2003; Tang et al., 2003)。近年來，越來越多的研究表明miRNA在植物非生物脅迫應(yīng)答機制中有非常重要的作用，相關(guān)miRNAs被不斷報道。棉花中，已有研究證明miRNA在抗鹽、抗旱等非生物脅迫響應(yīng)機制中有重要作用。
[0004]本發(fā)明中，利用solexa技術(shù)，分別對正常條件下和干旱脅迫條件下生長的棉花葉片中小RNA進行測序，及前體序列分析，鑒定得到棉花中干旱脅迫相關(guān)的新的miRNA，并利用Real-time PCR技術(shù)對其在干旱脅迫下的表達模式進行了驗證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與植物應(yīng)對干旱脅迫相關(guān)的miRNA——ghr-miR17，本發(fā)明同時提供此miRNA的前體序列及其前體的編碼基因序列，利用此miRNA能夠分析和調(diào)節(jié)棉花的抗旱性，對棉花應(yīng)對環(huán)境脅迫的試驗研究進而培育優(yōu)良的棉花品種具有實際應(yīng)用意義。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。
[0007]一種與植物應(yīng)對干旱脅迫相關(guān)的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0008]上述miRNA的前體序列，其具有序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
[0009]上述miRNA前體序列的編碼基因，其具有序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
[0010]上述miRNA對應(yīng)的DNA序列，其具有序列表中SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。[0011 ] 上述所述miRNA的cDNA Gene Specific RT Primer的引物序列，其具有序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
[0012]上述miRNA在實時熒光定量PCR操作中的引物序列，ghr-miR17F具有序列表中SEQID N0:6所示的核苷酸序列，ghr-miR17R具有序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；U6-F具有序列表中SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列;U6-R具有序列表中SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
[0013]上述的miRNA在植物應(yīng)對干旱脅迫試驗分析中的應(yīng)用，通過實時熒光定量PCR法測定所述miRNA在植物中的表達模式，如果與非脅迫植物相比所述miRNA在目的植物中表達未明顯上調(diào)(比如上調(diào)不足2倍)，提示目的植物未受到干旱脅迫，則返回修改試驗設(shè)計。
[0014]上述的miRNA在植物應(yīng)對非干旱脅迫試驗分析中的應(yīng)用，在植物應(yīng)對非干旱脅迫試驗的分析中，通過實時熒光定量PCR方法測定所述miRNA在植物中的表達模式，如果與非脅迫植物相比所述miRNA在目的植物中的表達未明顯上調(diào)(比如上調(diào)不足2倍)，則排除目的植物受到干旱脅迫的影響，從而排除干旱脅迫對非干旱脅迫試驗數(shù)據(jù)的影響。
[0015]上述的miRNA在培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，在目的植物中過表達SEQ ID NO: I所示的miRNA，或采用其反義寡核苷酸抑制SEQ ID NO:1所示miRNA的表達，或過表達SEQ IDNO:4所示miRNA前體的基因序列，培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因目的植物。
[0016]上述miRNA的應(yīng)用優(yōu)選實施在棉花作物品種上。
[0017]采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于:
本發(fā)明提供了一種新的棉花miRNA，SoIexa測序和實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，本發(fā)明miRNA的表達受到干旱脅迫的調(diào)節(jié)，說明其在棉花適應(yīng)干旱脅迫機制中起重要作用。
[0018]基于此，可以在植物應(yīng)對干旱脅迫的試驗分析中，通過實時熒光定量PCR法測定miRNA在植物中的表達模式來確認(rèn)目的植物是否受到干旱脅迫，避免實驗操作失誤導(dǎo)致的試驗結(jié)果偏差。
[0019]在植物應(yīng)對非干旱脅迫的應(yīng)激試驗研究中，還可以利用本發(fā)明的miRNA檢測目的植物是否受干旱脅迫的影響。在植物應(yīng)對非干旱脅迫試驗的分析中，通過實時熒光定量PCR方法測定所述miRNA在植物中的表達模式，如果與非脅迫植物相比所述miRNA在目的植物中的表達未明顯上調(diào)，則排除目的植物受到干旱脅迫的影響，從而排除干旱脅迫對非干旱脅迫試驗數(shù)據(jù)的影響。
[0020]另外，本發(fā)明的研究強烈的提示上述miRNA還可應(yīng)用于培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物，即在目的植物中過表達SEQ ID NO:1所示的miRNA，或采用其反義寡核苷酸抑制SEQ ID NO:1所示miRNA的表達，或過表達SEQ ID N0:4所示miRNA前體的基因序列，培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因目的植物。
【附圖說明】
[0021]圖1為ghr_miR17在Solexa測序中非干旱脅迫和干旱脅迫條件下表達次數(shù)的比較，結(jié)果顯示，ghr-miR17在正常生長條件下表達數(shù)為83，干旱處理后表達次數(shù)為636，表明ghr-miR17的表達受到干旱脅迫的調(diào)節(jié)，說明其在棉花適應(yīng)干旱脅迫機制中起重要作用。
[0022]圖2為ghr-miR17前體序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)圖，可見其前體序列折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，屬于miRNA前體典型的二級結(jié)構(gòu)，符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征。
[0023]圖3為實時熒光定量PCR對ghr-miR17在干旱脅迫條件下和正常條件下表達特征的分析結(jié)果，結(jié)果顯示ghr-miR17的表達受干旱誘導(dǎo)明顯上調(diào)，達6.8倍，說明其在棉花適應(yīng)干旱脅迫機制中起重要作用。
【具體實施方式】
[0024]以下實施例詳細(xì)說明了本發(fā)明。本發(fā)明所使用的各種原料及各項設(shè)備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過市場購買直接獲得。以下實施例中的定量試驗，設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0025]本發(fā)明提供的miRNA來源于棉花(石早I號棉花)葉片，命名為ghr-miR17，其長度為24nt ；參看附圖2，其前體序列可折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，屬于miRNA前體典型的二級結(jié)構(gòu)，符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征。
[0026]實施例1:Solexa測序分析驗證ghr-miR17在棉花抗旱機制中的作用
一、材料培養(yǎng)及干旱處理:石早I號棉花種子播種于蛭石和營養(yǎng)土3:1混合的基質(zhì)的培養(yǎng)盆中，溫度為28 °(:，相對濕度為70%。對照材料分別于播種后第7、14、21、28天澆水，每次澆水150 mL，第35天取幼嫩葉片，液氮冷凍，-80 °C儲藏;干旱處理材料分別于播種后第7、14、21澆水，每次澆水150 mL，第35天取幼嫩葉片，液氮冷凍，-80 °C儲藏。
[0027]二、Solexa測序分析及新miRNA的鑒定:上步所得樣品送往上海美吉生物公司，進行solexa測序及分析。參看圖1，結(jié)果顯示，ghr-miR17在正常生長條件下表達數(shù)為83，干旱處理后表達次數(shù)為636，這表明ghr-miR17的表達受到干旱脅迫的調(diào)節(jié)，說明其在棉花適應(yīng)干旱脅迫機制中起重要作用，在棉花中過表達ghr-miR17，或采用其反義寡核苷酸抑制ghr-miR17的表達，將影響棉花對干旱脅迫的適應(yīng)能力，培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因棉花，對提高棉花的產(chǎn)量具有重大的意義。用Mfold在線軟件對其前體序列進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示符合miRNA前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)特征(圖2):要有較低的折疊自由能能量，RNA和其周圍序列應(yīng)該形成一個發(fā)夾式的二級結(jié)構(gòu)；小RNA序列在二級結(jié)構(gòu)的臂部即位于5'arm或3'臂上;在前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)上，miRNA最多只能有6 nt的錯配;前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)上，miRNA與miRNA*之間沒有大的loop 或break。
[0028]實施例2:實時熒光定量PCR(Real-time PCR)分析驗證ghr_miR17在棉花抗旱機制中的作用
一、材料培養(yǎng)及NaCl處理
石早I號棉花種子播種與蛭石和營養(yǎng)土3:1混合的基質(zhì)的培養(yǎng)盆中，溫度為28 °C，相對濕度為70%。對照材料分別于播種后第7、14、21、28天澆水，每次澆水150 mL，第35天取幼嫩葉片，液氮冷凍，-80 °C儲藏；干旱處理材料分別于播種后第7、14、21澆水，每次澆水150mL，第35天取幼嫩葉片，液氮冷凍，-80 0C儲藏。
[0029]二、RNA 的分離
用GIANGEN公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(目錄號:DP441)提取總RNA，提取方法如下:
1、勻漿處理。50-100mg葉樣用液氮在研缽內(nèi)快速磨碎，加入500 yL已加入β-巰基乙醇的SL液，立即渦旋劇烈震蕩；
2、12，000rpm 離心2 min； 3、將上清液轉(zhuǎn)移至過濾柱CS上，12,000rpm離心2 min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的離心管中，吸頭避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀；
4、緩慢加入0.4倍上清體積的無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，12,000 rpm離心15 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；
5、向吸附柱CR3中加入350μ?去蛋白液RWl，12,000 rpm離心15 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；
6、DNaseI工作液的配制:取10 μ I DNase I儲存液放入新的RNase-Free離心管中，加入70 μ? RDD溶液，輕柔混勻；
7、向吸附柱CR3中央加入80μ?的DNase I工作液，室溫放置15 min；
8、向吸附柱CR3中加入350μ?去蛋白液RWl，12,000 rpm離心15 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；
9、向吸附柱CR3中加入500μ?漂洗液RW(使用前先加入乙醇)，12，000 rpm離心15 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；
10、重復(fù)步驟9;
11、12，000rpm離心2 min，將吸附柱CR3放入一個新的RNase-Free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30-50 μ? RNase-Free ddH20，室溫放置2 min，12,000 rpm離心Imin，得到RNA溶液。
[0030]三、反轉(zhuǎn)錄為cDNA
用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒，將提取的RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0031]1、去除基因組DNA。在冰上配置10.0 μ?反應(yīng)體系混合液:5 X gDNA EraserBuffer, 2.0 μ?; gDNA Eraser, 1.0 μ?; Total RNA, 2.0 μ?; RNase Free difeO, 5.0μ?。輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心使得管壁上的反應(yīng)液沉落，42 °C反應(yīng)2 min，4°C存放用于下步實驗。
[0032I 2、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在冰上配置內(nèi)參基因U6所用混合液:步驟I的反應(yīng)液，10.0 μ? ;PrimeScript RT Enzyme Mix 1, 1.0 μ?; RT Primer Mix, 4.0 μ?; 5 X PrimeScriptBuffer 2,4.0 μ? ； RNase Free (IH2O，1.0 μ?;總體積，20 μ?，輕輕混勾上述配制的反應(yīng)液，短暫離心使得管壁上的反應(yīng)液沉落。在冰上配置miRNA所用混合液:步驟I的反應(yīng)液，10.0 μ?; PrimeScript RT Enzyme Mix 1, 1.0 μ?; Gene Specific RT Primer , 1.0 μI; 5 X PrimeScript Buffer 2,4.0 μ? ； RNase Free (IH2O，4.0 μ?;總體積，20 μ?，輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心使得管壁上的反應(yīng)液沉落。37 °C, 15 min; 85°C, 5 sec;合成的cDNA反應(yīng)液放置-20 °C保存，也可以直接進行下游熒光定量檢測。
[0033]Gene Specific RT Primer 引物序列為:GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATTCCACSEQ ID NO:5)。
[0034]四、實時熒光定量PCR
混勻如下反應(yīng)體系，然后分裝入96孔光學(xué)板中，并覆蓋上專用光學(xué)膜。擴增使用的儀器為ABI公司的熒光定量PCR儀。
[0035]20 μ?反應(yīng)體系配制如下:反轉(zhuǎn)錄cDNA模板，2μ1;正向引物(10 μΜ)，I μ?;反向引物(10 μΜ),I μ?；2 XRealStar Green Power Mixture,10 μ?；RNase Free dH20，6 μ?0
[0036]擴增程序為:擴增程序為:95°C， 30 sec ； 95 °C，15 s，60 °C，34 s，40cycles；72 °C 30 sD
[0037]引物序列為:ghr_miR17F:GGACCgaTTgaggaTgagaTaTg( SEQ ID NO: 6 ) ； ghr-miR17R: GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID N0:7)； U6-F:GGGGACATCCGATAAAATTGGCSEQ ID NO:8) ；U6-R: CATTTCTCGATTTGTGCGTGTCCSEQ ID N0:9) ; (U6為內(nèi)參基因)。
[0038]五、結(jié)果分析
參看圖3，實時熒光定量PCR分析的結(jié)果顯示ghr-miR17的表達受干旱誘導(dǎo)明顯上調(diào)，達6.8倍，這同樣表明ghr-miR17的表達受到干旱脅迫的調(diào)節(jié)?；诖?，可以通過實時熒光定量PCR法測定所述miRNA在植物中的表達模式，從而確認(rèn)或排除目的植物受到干旱脅迫，同時上述試驗結(jié)果強烈的提示上述miRNA還可應(yīng)用于培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物，即在棉花中過表達ghr-miR17，或采用其反義寡核苷酸抑制ghr-miR17的表達，或過表達ghr-miR17前體的基因序列將影響棉花對干旱脅迫的適應(yīng)能力，培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因棉花。
[0039]上述描述僅作為本發(fā)明可實施的技術(shù)方案提出，不作為對其技術(shù)方案本身的單一限制條件。
【主權(quán)項】
1.一種與植物應(yīng)對干旱脅迫相關(guān)的miRNA，其特征在于:其具有序列表中SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列。2.權(quán)利要求1所述miRNA的前體序列，其特征在于:其具有序列表中SEQID NO:3所示的核苷酸序列。3.權(quán)利要求2所述miRNA前體序列的編碼基因，其特征在于:其具有序列表中SEQIDNO: 4所示的核苷酸序列。4.權(quán)利要求1所述miRNA對應(yīng)的DNA序列，其特征在于:其具有序列表中SEQID NO: 2所示的核苷酸序列。5.權(quán)利要求1所述miRNA的cDNAGene Specific RT Primer的引物序列，其特征在于:其具有序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。6.權(quán)利要求1所述miRNA在實時熒光定量PCR操作中的引物序列，其特征在于:ghr-miROlF具有序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，ghr_miR01R具有序列表中SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列；U6-F具有序列表中SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；U6-R具有序列表中SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。7.權(quán)利要求1所述的miRNA在植物應(yīng)對干旱脅迫試驗分析中的應(yīng)用，其特征在于:通過實時熒光定量PCR法測定所述miRNA在植物中的表達模式，如果與非脅迫植物相比所述miRNA在目的植物中表達未明顯上調(diào)，提示目的植物未受到干旱脅迫，則返回修改試驗設(shè)i+o8.權(quán)利要求1所述的miRNA在植物應(yīng)對非干旱脅迫試驗分析中的應(yīng)用，其特征在于:在植物應(yīng)對非干旱脅迫試驗的分析中，通過實時熒光定量PCR方法測定所述mi RNA在植物中的表達模式，如果與非脅迫植物相比所述miRNA在目的植物中的表達未明顯上調(diào)，則排除目的植物受到干旱脅迫的影響，從而排除干旱脅迫對非干旱脅迫試驗數(shù)據(jù)的影響。9.權(quán)利要求1所述的miRNA在培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其特征在于:在目的植物中過表達SEQ ID NO:1所示的miRNA，或采用其反義寡核苷酸抑制SEQ ID NO:1所示miRNA的表達，或過表達SEQ ID N0:4所示miRNA前體的基因序列，培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因目的植物。10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為棉花。
【文檔編號】C12Q1/68GK106047881SQ201610698450
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月22日
【發(fā)明人】董章輝, 朱青竹, 趙麗芬, 眭書祥, 李增書, 張艷麗, 王虎
【申請人】石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院