一種基因gBabc的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從牛傳染性鼻氣管炎病毒的主要抗原糖蛋白gB中得到的基因gBabc,該基因表達(dá)能夠得到高免疫原活性的融合蛋白，最后制作用于檢測牛傳染性鼻氣管炎抗體的膠體金免疫層析試紙條。本發(fā)明的目的基因成功高效表達(dá)、分離純化得到用于檢測牛傳染性鼻氣管炎抗體的融合抗原蛋白gBF，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該融合蛋白具有高抗原性及高免疫活性，建立了牛傳染性鼻氣管炎抗體膠體金免疫層析方法。
【專利說明】
一種基因 gBabc
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種從牛傳染性鼻氣管炎病毒的主要抗原糖蛋白gB中得到的目的基 因濁abc。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛傳染性鼻氣管炎（Infectious bovine ;rhinotracheitis,IBR)是由牛傳染性鼻 氣管炎病毒（IBRV)也稱牛瘤疹病毒I型(Bovine he巧esvirusI，BHV-I)引起牛的一種急性、 熱性、接觸性傳染病，臨床癥狀有上呼吸道及氣管粘膜發(fā)炎、呼吸困難、流鼻汁等，并伴有結(jié) 膜炎、流產(chǎn)、乳腺炎，有時誘發(fā)小牛腦炎等。更嚴(yán)重的危害是導(dǎo)致持續(xù)性感染，給診斷、預(yù)防 及治療該病造成極大的困難。牛傳染性鼻氣管炎病毒粒子最外層的囊膜由11種糖蛋白組 成，其中g(shù)B、gC和曲糖蛋白具有高免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并在補(bǔ)體存在下致使感 染細(xì)胞裂解。
[0003] 目前，IBR的鑒別診斷方法主要包括傳統(tǒng)的病毒分離、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)、聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(PCR)技術(shù)等，其中血清學(xué)實(shí)驗(yàn)又包括血清中和實(shí)驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、間接血凝實(shí)驗(yàn)和 ELISA診斷方法。運(yùn)些檢測方法對操作步驟、操作環(huán)境、儀器設(shè)備的要求都很高，很難應(yīng)用于 臨床診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種從牛傳染性鼻氣管炎病毒的 主要抗原糖蛋白濁中獲得目的基因濁abc。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 一種基因濁abc，所述基因的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。
[0007] Jinybude，所述的基因 gBalDc表達(dá)得到融合蛋白gBF，具有如序列表SEQ ID N0:1所 示的氨基酸序列。
[000引基因濁abc的合成方法，包括如下的步驟：
[0009]利用DNAstar對牛傳染性鼻氣管炎病毒的主要抗原糖蛋白濁進(jìn)行預(yù)測分析，選出3 段抗原指數(shù)高的抗原表位基因，根據(jù)3段氨基酸序列起始位置找出3段對應(yīng)基因序列，并分 別命名為gBa、g抓和濁c，3段基因序列之間用Linker序列連接，并選定EcoR I和趾0 I為酶 切位點(diǎn)，將融合好的基因序列送與合成得到重組克隆載體PUCK-(gBa-linke;r-g化-linke;r- gBc) ，重組克隆載體存在于大腸桿菌 DH-5a 中，通過搖菌的方式克隆 W 及擴(kuò)增目 的基因 ，通 過質(zhì)粒提取、雙酶切W及膠回收得到帶有粘性末端的目的基因濁abc。
[0010]基因濁abc表達(dá)得到融合蛋白濁F的方法，包括如下的步驟：
[0011]將基因 gBabc與線性化表達(dá)載體pET-28a( + )進(jìn)行連接得到重組原核表達(dá)載體 pET28a-濁abc,并將其轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌化21 pLysS中，表達(dá)菌化21 pLysS經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通 過SDS-PAGE選取最適的誘導(dǎo)表達(dá)時間、鑒別是可溶性表達(dá)還是包涵體表達(dá)W及確定表達(dá)蛋 白帶的大小為44.3kDa(含3.5kDa的祀T-28a( + )膚段），與理論計(jì)算的目的蛋白大小一致，將 鑒定正確的目的蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)，并分離純化得到融合蛋白濁F。
[0012] 利用所述的融合蛋白濁F制作的檢測牛傳染性鼻氣管炎抗體的膠體金免疫層析試 紙條，該試紙條包括PVC膠板，所述PVC膠板中間設(shè)置有硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜兩 側(cè)的PVC膠板上分別設(shè)置有血清樣品墊和吸水紙，所述血清樣品墊與所述硝酸纖維素膜之 間設(shè)置有金標(biāo)墊，所述金標(biāo)墊上涂覆有經(jīng)復(fù)溶緩沖液稀釋的金標(biāo)-SPA，所述金標(biāo)墊的一端 位于所述血清樣品墊下端，另一端位于所述硝酸纖維素膜上端;所述硝酸纖維素膜上靠近 金標(biāo)墊一端上設(shè)置有用牛傳染性鼻氣管炎病毒融合蛋白gBF劃線作為捕獲抗原的檢測線， 所述硝酸纖維素膜上背離金標(biāo)墊一端上設(shè)置有用兔IgG劃線作為捕獲抗體的質(zhì)控線。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益技術(shù)效果：目的基因成功高效表達(dá)、分離純化得到 用于檢測牛傳染性鼻氣管炎抗體的融合抗原蛋白gBF,且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該融合蛋白具有高抗 原性及高免疫活性;制成的試紙條具有快速、簡便、準(zhǔn)確、高度特異性和敏感性，且結(jié)果直觀 可靠等優(yōu)點(diǎn)，適用于牛傳染性鼻氣管炎的臨床檢測。
【附圖說明】
[0014] 下面結(jié)合【附圖說明】對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0015] 圖1為本發(fā)明中膠體金免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0016] 附圖標(biāo)記說明：1-PVC膠板;2-血清樣品墊;3-金標(biāo)墊(涂覆有金標(biāo)-SPA)
[0017] 4-硝酸纖維素膜;5-樣品層析方向；6-檢測線/T線（融合蛋白gBF作為捕獲抗原）； 7-質(zhì)控線/C線(兔IgG作為捕獲抗體）；8-吸水紙。
[0018] 圖2為IBRV濁蛋白抗原表位分析及篩選結(jié)果；
[0019] 圖3為祀T28a-gBabc陽性菌各時間點(diǎn)的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定結(jié)果；
[0020] 圖4為祀T28a-gBabc陽性菌表達(dá)蛋白可溶性的SDS-PAGE鑒定結(jié)果；
[0021] 圖5為融合蛋白濁F的Western blot鑒定結(jié)果；
[0022] 圖6為檢測試紙條有效性的驗(yàn)證結(jié)果；
[0023] 圖7為檢測試紙條交叉性試驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 本實(shí)驗(yàn)利用DNAstar對牛傳染性鼻氣管炎病毒的主要抗原糖蛋白gB進(jìn)行預(yù)測分 析，選出3段抗原指數(shù)高的抗原表位基因，根據(jù)3段氨基酸序列起始位置找出3段對應(yīng)基因序 列，并分別命名為濁a、濁b和濁c，3段基因序列之間用Linker序列連接，并選定EcoR巧日化0 I為酶切位點(diǎn)，將融合好的基因序列送與合成得到重組克隆載體PUCK-(gBa-linker-g化- linker-gBc)。重組克隆載體存在于大腸桿菌DH-5a中，通過搖菌的方式克隆W及擴(kuò)增目的 基因，通過質(zhì)粒提取、雙酶切W及膠回收得到帶有粘性末端的目的基因 gBabc(核巧酸序列 如序列表SEQ ID NO: 1所示），將其與線性化表達(dá)載體祀T-28a( + )進(jìn)行連接得到重組原核表 達(dá)載體祀T28a-gBabc，并將其轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌化21 pLysS中。表達(dá)菌化21 pLysS經(jīng)IPTG誘導(dǎo) 表達(dá)，通過SDS-PAGE選取最適的誘導(dǎo)表達(dá)時間、鑒別是可溶性表達(dá)還是包涵體表達(dá)W及確 定表達(dá)蛋白帶的大小為44.3kDa(含3.化化的pET-28a( + )膚段），與理論計(jì)算的目的蛋白大 小一致。將鑒定正確的目的蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)，并分離純化得到融合蛋白gBF(氨基酸序列 如序列表SEQ ID N0:2所示），通過Weatern blot對融合蛋白濁F的免疫學(xué)活性進(jìn)行鑒定，結(jié) 果表明目的蛋白具有很好的免疫學(xué)活性，且融合蛋白gBF能夠在大腸桿菌化21 pLysS中獲 得高效的重組表達(dá)。
[0025]如圖1所示，一種檢測牛傳染性鼻氣管炎抗體的膠體金免疫層析試紙條，先將吸水 紙8和硝酸纖維素膜4粘覆與PVC膠板1上，將分離純化的牛傳染性鼻氣管炎病毒融合蛋白 gBF劃線于硝酸纖維素膜上作為檢測線6上的包被抗原，提純的兔IgG劃線于硝酸纖維素膜 上作為質(zhì)控線7上的捕獲蛋白，金標(biāo)-SPA用復(fù)溶緩沖液稀釋后涂覆在金標(biāo)墊3上，樣品墊經(jīng) 樣品點(diǎn)處理液處理烘干，再將金標(biāo)墊3與血清樣品墊2粘覆在PVC膠板1上，經(jīng)切條后組裝卡 槽，制成用于檢測牛傳染性鼻氣管炎抗體的膠體金免疫層析試紙條。用檢測試紙條檢測牛 傳染性鼻氣管炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，在檢測線處出現(xiàn)紅色反應(yīng)帶，檢測陰性血清時試紙條檢測 線處未出現(xiàn)反應(yīng)條帶，上述兩種檢測在質(zhì)控線處均出現(xiàn)紅色反應(yīng)條帶，表明用試紙條檢測 牛傳染性鼻氣管炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清時呈陽性反應(yīng)，檢測陰性血清時呈陰性反應(yīng);試紙條檢測 牛傳染性鼻氣管炎陰性血清、牛副結(jié)核病、牛布氏桿菌病和牛口蹄疫的陽性血清，結(jié)果都為 陰性反應(yīng);用保存于室溫1個月的試紙條與保存于4°C1個月的試紙條分別檢測牛傳染性鼻 氣管炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清，檢測的牛傳染性鼻氣管炎標(biāo)準(zhǔn)陽性血清都成陽性反應(yīng)， 檢測陰性血清時呈陰性反應(yīng)。所制備的試紙條具有靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)，穩(wěn)定性好，lOmin后即 出結(jié)果，操作簡便，可用于臨床診斷。
[00%]相關(guān)實(shí)驗(yàn)如下：
[0027] UIBRV濁蛋白DNAstar分析及抗原蛋白和基因篩選結(jié)果
[002引如圖2所示，IBRVgB蛋白抗原表位分析及篩選結(jié)果，根據(jù)DNAstar對IBRV濁蛋白序 列(945個氨基酸）的分析結(jié)果，截取氨基端第308-450，494-598，822-924，3段潛在抗原決定 簇多、親水性強(qiáng)和柔初性好的氨基酸序列。根據(jù)3段氨基酸序列起始位置找出對應(yīng)基因序 列，并分別命名為gBa、濁b和gBc，3段基因片段之間用Linker序列連接，整個基因序列兩端 設(shè)計(jì)了EcoR巧日趾0 I兩個酶切位點(diǎn)，得到融合好的基因，基因序列如序列表SEQ ID NO: 1 所示。其中3段基因片段之間用Linker序列連接位置如序列表SEQ ID NO: 1中雙下劃線位置 所示。
[0029] 2、祀T28a-gBabc陽性菌各時間點(diǎn)的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定
[0030] 如圖3所示，pET28a-gBabc陽性菌各時間點(diǎn)的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定結(jié)果。將制備 的5個時間點(diǎn)的上樣蛋白及對照蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果如圖3所示，重組表 達(dá)菌誘導(dǎo)之后出現(xiàn)一條大小約為44.3kDa的特異性條帶，與理論計(jì)算的目的蛋白大小一致， 而重組質(zhì)粒陽性菌未誘導(dǎo)對照和空載菌液對照均未出現(xiàn)目的條帶，且經(jīng)目的條帶的顏色深 淺能夠明顯判斷融合蛋白濁F在誘導(dǎo)后化的表達(dá)量最大。
[0031 ] 圖中：Ml:預(yù)染彩虹Marker ;M2:預(yù)染蛋白質(zhì)Marker; 1~5:分別為祀T28a-gBabc陽 性菌在誘導(dǎo)后化、地、化、6h、化菌體總蛋白；6:pET28a-gBabc陽性菌未誘導(dǎo)對照；7:pET-28a (+ )空載菌液對照。
[0032] 3、祀T28a-gBabc陽性菌表達(dá)蛋白可溶性的SDS-PAGE鑒定
[0033] 如圖4所示，收集重組表達(dá)質(zhì)粒陽性菌在誘導(dǎo)后化的菌體，超聲裂解后分別收集上 清和沉淀并加入上樣緩沖液沸水浴變性制備上樣蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖4所示， 菌體總蛋白作對照，上清中沒有出現(xiàn)目的蛋白條帶，沉淀中出現(xiàn)大小約為44.3的蛋白條帶， 說明融合蛋白濁F在本試驗(yàn)誘導(dǎo)條件下為包涵體形式表達(dá)。
[0034]圖中：M:預(yù)染蛋白質(zhì)Marker; 1:重組質(zhì)粒陽性菌在誘導(dǎo)后化的菌體總蛋白；2:菌體 裂解后的上清;3:菌體裂解后的沉淀。
[OO%] 4、融合蛋白濁F的Western blot鑒定結(jié)果
[0036] 如圖5所示，純化后的蛋白經(jīng)Western blot鑒定后的結(jié)果如圖5所示，在大小約 44.3kDa的位置出現(xiàn)特異性目的條帶，而陰性血清對照沒有出現(xiàn)特異性條帶，說明經(jīng)IPTG誘 導(dǎo)表達(dá)并純化后得到的融合蛋白濁F擁有很好的免疫學(xué)活性。
[0037] 圖中：M:Weste;rn blot Marke;r;l:融合蛋白濁F;2:g邸蛋白陰性血清反應(yīng)對照。
[0038] 5、檢測試紙條有效性的驗(yàn)證結(jié)果
[0039] 將制成的試紙條裝入卡槽，分別用IB財示準(zhǔn)陽性血清及試驗(yàn)室保存的IB郎日性血清 和陰性血清對試紙條進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖6所示，陽性結(jié)果在檢測線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色條 帶，陰性結(jié)果只在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶而檢測線未出現(xiàn)顯色，與預(yù)期結(jié)果一致。
[0040] 圖中：1: IBR標(biāo)準(zhǔn)陽性血清；2:試驗(yàn)室保存IBR陽性血清;3:試驗(yàn)室保存IBR陰性血 清。
[0041 ] 6、檢測試紙條交叉性試驗(yàn)結(jié)果
[0042] 用檢測試紙條同時檢測牛副結(jié)核病、牛布魯菌病、牛病毒性腹瀉和?？谔阋哧栃?血清，結(jié)果如圖7所示，觀察結(jié)果并與IBR標(biāo)準(zhǔn)陽性血清結(jié)果和陰性血清結(jié)果比較，結(jié)果說明 本試驗(yàn)制備的檢測試紙條在檢測IBR抗體時，與上述4種陽性血清無明顯的交叉反應(yīng)。
[0043] 圖中：1: IBR標(biāo)準(zhǔn)陽性血清;2:試驗(yàn)室保存IBR陰性血清;3~6:分別為牛副結(jié)核病、 牛布魯菌病、牛病毒性腹瀉和?？谔阋哧栃匝?。
[0044] W上所述的實(shí)施例僅是對本發(fā)明的優(yōu)選方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行 限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案做出 的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基因 gBabc，其特征在于:所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因 gBabc表達(dá)得到融合蛋白gBF，具有如序列表SEQ ID N0:1 所示的氨基酸序列。3. 權(quán)利要求1所述的基因 gBabc的合成方法，其特征在于:包括如下的步驟： 利用DNAstar對牛傳染性鼻氣管炎病毒的主要抗原糖蛋白gB進(jìn)行預(yù)測分析，選出3段抗 原指數(shù)高的抗原表位基因，根據(jù)3段氨基酸序列起始位置找出3段對應(yīng)基因序列，并分別命 名為gBa、gBb和gBc，3段基因序列之間用Linker序列連接，并選定EcoR I和Xho I為酶切位 點(diǎn)，將融合好的基因序列送與合成得到重組克隆載體PUCKgBa-linker-gBb-linker-gBc) ，重組克隆載體存在于大腸桿菌 DH-5a 中 ，通過搖菌的方式克隆以及擴(kuò)增目 的基因 ，通 過質(zhì)粒提取、雙酶切以及膠回收得到帶有粘性末端的目的基因 gBabc。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因 gBabc表達(dá)得到融合蛋白gBF的方法，其特征在于:包括如 下的步驟： 將基因 gBabc與線性化表達(dá)載體pET-28a( + )進(jìn)行連接得到重組原核表達(dá)載體pET28a-gBabc，并將其轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌BL21pLysS中，表達(dá)菌BL21pLysS經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE選取最適的誘導(dǎo)表達(dá)時間、鑒別是可溶性表達(dá)還是包涵體表達(dá)以及確定表達(dá)蛋白帶的 大小為44.3kDa(含3.5kDa的pET-28a( + )肽段），與理論計(jì)算的目的蛋白大小一致，將鑒定正 確的目的蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)，并分離純化得到融合蛋白gBF。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白gBF制作的檢測牛傳染性鼻氣管炎抗體的膠體金免 疫層析試紙條，其特征在于:包括PVC膠板，所述PVC膠板中間設(shè)置有硝酸纖維素膜，所述硝 酸纖維素膜兩側(cè)的PVC膠板上分別設(shè)置有血清樣品墊和吸水紙，所述血清樣品墊與所述硝 酸纖維素膜之間設(shè)置有金標(biāo)墊，所述金標(biāo)墊上涂覆有經(jīng)復(fù)溶緩沖液稀釋的金標(biāo)-SPA，所述 金標(biāo)墊的一端位于所述血清樣品墊下端，另一端位于所述硝酸纖維素膜上端;所述硝酸纖 維素膜上靠近金標(biāo)墊一端上設(shè)置有用牛傳染性鼻氣管炎病毒融合蛋白gBF劃線作為捕獲抗 原的檢測線，所述硝酸纖維素膜上背離金標(biāo)墊一端上設(shè)置有用兔IgG劃線作為捕獲抗體的 質(zhì)控線。
【文檔編號】C12N15/70GK106047902SQ201610355921
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】秦建華, 劉騰, 趙月蘭, 史萬玉, 包永占, 景翠, 王敏, 趙越, 劉立元
【申請人】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)