蒺藜苜蓿MtE1L基因及其編碼蛋白和應(yīng)用
【專利摘要】蒺藜苜蓿MtE1L基因及其編碼蛋白和應(yīng)用，涉及一種蒺藜苜蓿基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。MtE1L基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。MtE1L基因編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。該基因在促進(jìn)蒺藜苜蓿開花中的應(yīng)用。本發(fā)明通過蒺藜苜蓿品種R108的遺傳及分子功能分析，蒺藜苜蓿MtE1L基因具有促進(jìn)蒺藜苜蓿開花的生理功能。
【專利說明】
漠黎首著MtE1 L基因及其編碼蛋白和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種裝襲首猜基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 裝襲首猜是一種長日照一年生豆科植物，且現(xiàn)已完成大規(guī)模基因組測序。裝襲首 猜因其生長周期短、倍性小(化= 16)、基因組小(470Mb)、自花授粉等特點，使裝襲首猜稱為 豆科植物生物學(xué)和基因組學(xué)研究的重要模式植物。裝襲首猜比較基因組學(xué)研究證實，裝襲 首猜與大豆在宏線性水平和微線性水平有較高的共線性關(guān)系。除此之外，裝襲首猜也與其 他大部分豆科植物遺傳相似性很高，從裝襲首猜獲得的信息對于其他豆科植物的研究具有 重要的借鑒意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明是提供一種裝襲首猜M巧1L基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的裝襲首猜M巧1L基因的核巧酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。
[0005] 本發(fā)明的裝襲首猜MtElL基因的編碼蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所 /J、- 〇
[0006] 本發(fā)明裝襲首猜M巧1L基因的應(yīng)用是指M巧1L基因在促進(jìn)裝襲首猜開花中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的有益效果：
[000引本發(fā)明公開了裝襲首猜MtElL基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。本發(fā)明通過MtElL基因在 大豆遺傳背景的功能研究W及MEIL突變株系的表型及表達(dá)分析，確定了 MtElL基因?qū)ρb襲 首猜生開花具有促進(jìn)作用。本發(fā)明的MtElL基因在轉(zhuǎn)基因大豆株系中得到了異源表達(dá)，但 M巧1L基因并未影響大豆正常開花調(diào)控。表明MtElL基因與大豆生育期E1基因化1基因具有 強烈抑制大豆開花的生理功能)功能存在顯著差異。
【附圖說明】
[0009] 圖1表示載體構(gòu)建大腸桿菌單菌落PCR鑒定結(jié)果；
[0010] 圖2表示構(gòu)建后pTF101:35S:MtElL載體經(jīng)過Xba I和Sac I雙酶切鑒定結(jié)果；
[0011] 圖3為M巧1L基因在M巧1L基因異源表達(dá)大豆轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平；
[0012] 圖4為長日照條件下MtElL轉(zhuǎn)基因大豆花期表型；
[0013] 圖5為圖4的放大圖；
[0014] 圖6為短日照條件下MtElL轉(zhuǎn)基因大豆花期表型；
[0015] 圖7為圖6的放大圖；
[0016] 圖8為長日照和短日照條件下，el-as在MEIL轉(zhuǎn)基因大豆中的表達(dá)水平；
[0017]圖9為長日照條件下，GmFTs基因在MtElL轉(zhuǎn)基因大豆中的表達(dá)水平；
[001引圖10為短日照條件下，GmFTs基因在MEIL轉(zhuǎn)基因大豆中的表達(dá)水平；
[0019] 圖11為mtell突變株系NF16583基因分型PCR鑒定；
[0020] 圖12為mtell突變株系NF20110基因分型PCR鑒定；
[0021] 圖13為M巧1L基因在mtell純合突變體中的表達(dá)檢測；
[0022] 圖14為長日照條件下，mtell純合突變體花期表型；
[0023] 圖15為圖14的放大圖；
[0024] 圖16為對雜交F2群體NF1-2-4進(jìn)行PCR基因分型；
[0025] 圖17為對雜交F2群體NF2-4-4進(jìn)行PCR基因分型；
[0026] 圖18為F2突變體雜交群體花期統(tǒng)計分析。
【具體實施方式】
[0027] 本發(fā)明技術(shù)方案不局限于W下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
[00%]【具體實施方式】一：本實施方式裝襲首猜MtElL基因的核巧酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1 所示。
【具體實施方式】 [0029] 二:本實施方式本發(fā)明的裝襲首猜MtElL基因的編碼蛋白的氨基酸 序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
[0030] W下實施例中如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0031] 實施例1:裝襲首猜M巧1L基因的獲得與鑒定方法如下：
[0032] W裝襲首猜R108品系的剛展開S出復(fù)葉為材料，提取全基因組作為模板，W M巧lL-Fl(Seq ID No:3)和MtEa-Rl(Seq ID No:4)為引物，采用購買自北京全式金生物科 技有限公司的高保真酶化stP化Fly DNA化lymeras，進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù) 變性5min，94°C變性30s，5rC退火3〇3,72°(：延伸8〇3，共30循環(huán)，再72°(：延伸5111111;并對擴增 后獲得的PCR產(chǎn)物，采用購買自Promega公司的Wizard⑥SV Gel and PCR Clean Up System 進(jìn)行凝膠回收，并交由英維捷基(上海)貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序鑒定。
[0033] 經(jīng)檢測，核巧酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，該基因片段即為裝襲首猜MtElL 基因，由55化P個堿基組成。其編碼具有序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
[0034] 裝襲首猜開花調(diào)控MtElL基因編碼蛋白在氨基酸序列71~177區(qū)域存在著一個與 B3結(jié)構(gòu)域遠(yuǎn)緣相似的區(qū)域。其中B3是能夠與DNA結(jié)合的蛋白結(jié)構(gòu)域，依據(jù)前人研究，B3結(jié)構(gòu) 域中含有與DNA相結(jié)合的特殊位點，一般與DNA分子的大溝起作用，含有B3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì) 在植物逆境脅迫、生長素及ABA信號通路中起重要作用。
[0035] 實施例2:裝襲首猜MEIL基因的功能驗證
[0036] (一)大豆轉(zhuǎn)基因進(jìn)行基因功能驗證
[0037] 一、將測序后的PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為PCR模板，WMtEa-F2(Seq ID No:5)和 MtElL-R2(Seq ID No:6)為引物，采用購買自北京全式金生物科技有限公司的高保真酶 Fas1:Pfu Fly DNA Polymeras，并通過PCR反應(yīng)進(jìn)行基因擴增，PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性 5min，94°C 變性 303,50°(：退火303,72°(：延伸408,2循環(huán)，94°(：變性303,60°(：退火303,72°(：延 伸4〇8,2循環(huán)，94°(：變性3〇3,68°(：退火3〇3,72°(：延伸4〇3,26循環(huán)，再72°(：延伸5111111，最終獲 得含有甜a I和Sac I酶切位點的裝襲首猜化E1L基因序列。
[0038] 二、通過特異性內(nèi)切酶處理將獲得的裝襲首猜MtElL基因克隆到pTFlOl質(zhì)粒中，獲 得重組質(zhì)?？?。101:355:116化，口1。101:355:116化載體鑒定如圖1和2所示，結(jié)果表明 pTFlOl: 35S :M巧IL載體構(gòu)建成功。其中圖1表示大腸桿菌單菌落PCR鑒定結(jié)果，圖2表示構(gòu)建 后載體經(jīng)過甜a I和Sac I雙酶切鑒定結(jié)果。
[0039] 并將pTFlOl :35S:M巧1L質(zhì)粒通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)的方法轉(zhuǎn)入大豆東 農(nóng)50品種基因組中，獲得化E1L異源表達(dá)大豆株系。其中pTFlOl質(zhì)粒由美國愛荷華州立大學(xué) 王康教授饋贈，該質(zhì)粒已用于公開發(fā)表論文。
[0040] S、轉(zhuǎn)基因大豆中RT-PCR進(jìn)行功能驗證
[0041 ] 1、取MtElL異源表達(dá)大豆株系的剛展開S出復(fù)葉為材料，用購買自Invihogen公 司的TRIzol試劑盒的操作手冊提取大豆葉片總RNA;
[00創(chuàng) 2、采用面ase處理步驟一提取的總RNA，處理后的總RNA采用購買自Toyobo公司的 Nano化op檢測其DNA含量及質(zhì)量；
[0043] 3、取經(jīng)步驟2NanoDrop檢測到達(dá)標(biāo)準(zhǔn)后的化g總RNA，采用購買自北京全式金生物 科技有限公司的TransScrij^t"One-Step 曲NA Removal and cDNA Synthesis 如perMix試劑 盒，W及試驗盒配帶的dTis引物，按照試劑盒的操作手冊合成cDNA;
[0044] 4、取化1步驟3稀釋5倍后的cDNA作為RT-PCR模板，WMtEa-F3(Seq ID No:7)和 MtElL-R3(Seq ID No:8)為引物，操作步驟按購買自北京全式金生物科技有限公司的 TansStart'^Top Green qPCR SuperMix試劑盒中所介紹的操作步驟進(jìn)行，每個樣品的總反應(yīng) 體積為20化；
[0045] 5、采用購買自北京全式金生物科技有限公司的Easy化q，進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)條 件：94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，5rC退火3〇8,72°(：延伸3〇3，共30循環(huán)，再72°(：延伸 5min;并W大豆內(nèi)參基因 TUA5作為對照。
[0046] 在長日照和短日照條件下，MtElL基因在MtElL基因異源表達(dá)大豆轉(zhuǎn)基因株系化6 和L14)中的表達(dá)水平如圖3所示，其中大豆TUA5為參照基因。長日照條件下MtElL轉(zhuǎn)基因大 豆花期表型如圖4和5所示，圖5為圖4的放大圖；短日照條件下化E1L轉(zhuǎn)基因大豆花期表型如 圖6和7所示?？蒞看出，在長日照和短日照條件下，MtElL異源表達(dá)大豆株系和野生型開花 期無明顯差異。圖8、9、10為長日照和短日照條件下，el-as和GmFTs基因在MEIL轉(zhuǎn)基因大豆 中的表達(dá)水平；可W看出MtElL基因的異源表達(dá)也并未影響大豆內(nèi)源el-as和GmFTs (GmFT2a、GmFT5a和GmFT4)的表達(dá)。其中大豆GmFT2a、GmFT5a和GmFT4均為大豆成花相關(guān)基 因。
[0047] 由圖3~10可知，本發(fā)明的MtElL基因轉(zhuǎn)基因大豆株系中得到了異源表達(dá)，但MEIL 基因并未影響大豆正常開花調(diào)控。對本試驗重復(fù)操作一次后，獲得了相似結(jié)果。表明MtElL 基因與大豆生育期El基因功能存在差異。
[004引（二)mtell裝襲首猜突變體功能驗證
[0049] 一、對從裝襲首猜 R108品種化1:1 突變體庫化 ttp: //medicag〇-mu1:ant. noble. org/ mutant/)中篩選獲得的兩個突變株系陽F16583(NF1)和NF20110(NF2)]進(jìn)行突變位點鑒定。 W裝襲首猜突變體葉片為材料，采用CTAB法提取葉片DNA，并WMtEa-F3(Seq ID No:7)、 M巧lL-R3(SeqIDNo:8)和MtElレF3(SeqIDNo:7)、]MtElレl'ntl-R(SeqIDN0.9)為引物， 采用購買自北京全式金生物科技有限公司的高保真酶化stPfu Fly DNA Polymeras，并分 別通過PCR反應(yīng)進(jìn)行MtE 1L基因擴增W及突變區(qū)段擴增，其中MtE 1L基因擴增PCR反應(yīng)條件： 94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，5rC退火30s，72°C延伸30s，共30循環(huán)，再72°C延伸5min;突 變區(qū)段擴增PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，5rC退火30s，72°C延伸80s，共30 循環(huán)，再72°C延伸lOmin。
[0050]二、將野生型R108子代和基因分型獲得的純合突變株系子代經(jīng)種皮破損后，置于 濕潤濾紙上，并于4°C條件下黑暗處理lOd，然后移栽至濕潤營養(yǎng)±中，置于22°C恒溫長日照 條件的（1化光照/她黑暗)人工氣候箱內(nèi)正常培養(yǎng)，并統(tǒng)計其花期。
[0051 ] ^、111*611突變株系中腳斗0?進(jìn)行功能驗證
[0052] 1、取mtell純合突變株系的剛展開S出復(fù)葉為材料，用購買自Invi化ogen公司的 TRIzol試劑盒的操作手冊提取大豆葉片總RNA;
[0化3] 2、采用面ase處理步驟一提取的總RNA，處理后的總RNA采用購買自Toyobo公司的 Nano化op檢測其DNA含量及質(zhì)量；
[0化4] 3、取經(jīng)步驟2NanoDrop檢測到達(dá)標(biāo)準(zhǔn)后的化g總RNA，采用購買自北京全式金生物 科技有限公司的TransScri口、'One-Step 曲NA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑 盒，W及試驗盒配帶的dTis引物，按照試劑盒的操作手冊合成cDNA;
[0055] 4、取化1步驟3稀釋5倍后的cDNA作為RT-PCR模板，WMtEa-F3(Seq ID No:7)和 M巧]X-R3(Seq ID No:8)為引物，采用購買自北京全式金生物科技有限公司的Easy化q，進(jìn) 行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，5rC退火30s，72°C延伸30s，共30 循環(huán)，再72°C延伸5min;并W裝襲首猜內(nèi)參基因 MSC27作為對照。
[0056] 四、將基因分型獲得的純合突變株系（其中NF1-2-4和NF2-4-4為分別來源于純合 突變植株NF1-2和NF2-4的子代植株)與野生型植株雜交，通過自交獲得F2群體，并對獲得的 F2群體經(jīng)上述步驟一和二中提及的基因型鑒定方法和培養(yǎng)方式進(jìn)行處理，最終進(jìn)行花期統(tǒng) 計及數(shù)據(jù)分析。
[0057] 經(jīng)PCR結(jié)果鑒定，由圖11和12可知，只擴增獲得MEIL基因目的條帶的為野生型，只 擴增獲得突變序列目的條帶的為純合突變植株，擴增獲得兩條條帶的為雜合突變植株，由 此可見分別來源于NF16583(NF1)的F1代植株NF1-UNF1-2W及來源于NF20110(NF2)的F1代 植株NF2-2、NF2-4為純合突變植株。
[005引圖13為MtElL基因在mtell純合突變體中的表達(dá)檢測，經(jīng)RT-PCR鑒定，純合突變體 NF1 -1和NF2-2子代無化E1L基因表達(dá)。
[0059] 圖14和15為長日照條件下，mtell純合突變體花期表型；在長日照條件下，純合突 變株系較之野生型株系表現(xiàn)為晚花表型；
[0060] 對獲得的雜交F2群體進(jìn)行PCR基因分型（如圖16和17所示），結(jié)果表明子代分離比 例分別為野生型：雜合體:純合體=4: 7:4和3:6:4，符合孟德爾遺傳定律，且在長日照條件 下純合突變植株較之野生型和雜合突變植株表現(xiàn)為晚花表型(如圖18所示）。
[0061] 由圖11~18可知，本發(fā)明的MtElL基因在純合突變株系中無表達(dá)，且較之野生型表 現(xiàn)為晚花表型，表明化E1L基因作為開花促進(jìn)因子參與裝襲首猜的開花調(diào)控。
【主權(quán)項】
1. 蒺藜苜蓿MtElL基因，其特征在于MtElL基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1 所示。2. 權(quán)利要求1所述的蒺藜苜蓿MtElL基因編碼蛋白的氨基酸序列，其特征在于該氨基酸 序列如序列表SEQ ID N0:2所3. 權(quán)利要求1所述的蒺藜苜蓿MtElL基因在促進(jìn)蒺藜苜蓿開花中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/29GK106047894SQ201610594794
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月26日 公開號201610594794.8, CN 106047894 A, CN 106047894A, CN 201610594794, CN-A-106047894, CN106047894 A, CN106047894A, CN201610594794, CN201610594794.8
【發(fā)明人】夏正俊, 張興政, 翟紅, 吳紅艷, 呂世翔
【申請人】中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所