一種PS1基因條件性敲除flox大鼠的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種PS1基因條件性敲除flox大鼠的制備方法，該方法利用在PS1基因關(guān)鍵外顯子兩端添加Cre重組酶靶向序列l(wèi)oxP位點，構(gòu)建條件性基因敲除載體，再進行顯微注射的方法，制備可用于PS1條件性基因敲除的flox大鼠。該大鼠與Cre大鼠交配即可獲得組織特異性或誘導性組織特異性PS1基因敲除大鼠。本發(fā)明基于CRISPR/Cas9技術(shù)的條件性基因敲除方法，可減少對其他細胞的危害，只需Cre工具鼠即可實現(xiàn)特異性基因敲除；且獲得的PS1基因條件性敲除大鼠還可以作為研究阿爾茲海默癥等疾病的動物模型，這對于研究PS1基因的功能，尤其是研究PS1基因在神經(jīng)組織中的功能，具有重要的應(yīng)用高價值。
【專利說明】
-種PS1基因條件性敲除f I ox大鼠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于動物基因工程和基因遺傳修飾領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及基于CRISPR/化s9 技術(shù)的PS1基因條件性敲除的flox大鼠模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在實驗動物領(lǐng)域，雖然小鼠是當前更為流行的動物模型，但對許多研究者而言，大 鼠仍是首選。原因是相對小鼠，大鼠除體型更大更適合體內(nèi)成像、電生理、手術(shù)等操作外，在 生理、行為、代謝等方面與人類更接近，并且在部分疾病模型中，基因工程大鼠彌補了基因 工程小鼠的局限性，例如許多屯、血管類疾病可W在大鼠而不能在小鼠上實現(xiàn)，研究表明大 鼠具有更準確的炎癥疾病和包括帕金森、亨廷頓氏病、阿爾茲海默癥在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病 表型等。因此在神經(jīng)行為研究的初期，大鼠是最常用的模式動物。大鼠行為表現(xiàn)多樣、情緒 敏感，適應(yīng)新環(huán)境、探索性強，具有行為情緒的變化特征，在許多標準的神經(jīng)藥理學任務(wù)中 表現(xiàn)良好，廣泛應(yīng)用于行為學及行為異常、高級神經(jīng)活動的研究。
[0003] 阿爾茲海默癥(Alzheimer,AD)是病因尚不明確的，且最常見、最為嚴峻的老年神 經(jīng)退行性疾病之一。AD患者的癥狀主要表現(xiàn)為漸進性記憶障礙、認知功能障礙、人格改變及 語言障礙等精神癥狀，嚴重影響社交、職業(yè)與生活動能;疾病后期的患者無法識別親人、生 活無法自理。因此AD是一個給家庭和社會造成巨大沖擊的老年疾病。目前沒有有效的治療 手段。自上世界80年代到目前對AD發(fā)病機制進行了大量研究，但確切的發(fā)明機制仍不明確。 阿爾茲海默癥的標志性癥狀之一為e-淀粉樣蛋白沉淀形成的斑塊(plaque),而0-淀粉樣沉 淀的產(chǎn)生是APP蛋白經(jīng)過一系列蛋白酶切割產(chǎn)生的短膚聚集而來。在此切割過程中，最關(guān)鍵 的蛋白酶是丫 -分泌酶。研究表明組成丫-分泌酶的PS1蛋白的基因中至少有200多個突變與 阿爾茨海默氏癥病人相關(guān)，部分家族性AD的患者(FAD)還攜有APP基因突變。運些突變成為 研究AD發(fā)病機制的切入點。
[0004] PS1基因編碼產(chǎn)物早老蛋白l(presenilin-l)是丫-分泌酶催化亞單元的重要組成 部分。近年來的研究表明，PS1不僅參與胚胎發(fā)育的調(diào)控，并且參與0-APP代謝途徑、Notch信 號通路、E-ca化erin細胞間相互作用、Wnt信號通路的調(diào)控等。PS1與散發(fā)性及家族性阿爾茲 海默癥(AD)、家族反常性瘦瘡、擴展性屯、肌病(Dilated Cardiomyopathy)等疾病都具有相 關(guān)性。
[0005] Jie化en等人制備了PS1基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)該小鼠圍產(chǎn)期致死，中樞骨架嚴重變 形，前腦細胞缺失及神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴重;表明PS1參與了胚胎期形成正常中樞骨骼、神經(jīng)和 神經(jīng)元過程。PSUPS2均為丫 -分泌酶的主要組分。Dorit B Donoviel等人制備了PS2基因敲 除小鼠，發(fā)現(xiàn)該小鼠并無異常表型，隨后他們嘗試制備PS1、PS2雙敲小鼠，發(fā)現(xiàn)該小鼠胚胎 階段即表現(xiàn)出多種模式形成缺陷而導致胚胎致死?；痑kui化等人采用傳統(tǒng)的ES細胞打祀 的制備了PS1前腦特異性條件敲除小鼠，該小鼠可正常存活、無嚴重崎形，且表現(xiàn)出神經(jīng)退 化的特征，但并未出現(xiàn)e-淀粉樣沉淀。目前還有多種常見的AD轉(zhuǎn)基因小鼠，但多為家族性AD 基因突變相關(guān)的過表達突變株APP或PS1，甚至兩者共同表達的雙轉(zhuǎn)基因模式，但運些模型 都尚不能較全面的模擬AD。
[0006] 由于目前現(xiàn)有的模型小鼠存有的各種缺陷，相比小鼠，大鼠在認知行為檢測及電 生理記錄上有明顯優(yōu)勢，而且目前大鼠模型相對缺乏，其主要原因是大鼠基因工程技術(shù)的 限制嚴重阻礙了大鼠模型的發(fā)展。直到2008年才建立了可用于基因打祀的大鼠胚胎干細胞 (小鼠是1981年），但建立的胚胎干細胞分化和生殖細胞傳代效率低下，嚴重限制了大鼠 ES 打祀技術(shù)的應(yīng)用。此后，不依賴ES細胞的基因修飾技術(shù)不斷完善，包括轉(zhuǎn)座子及逆轉(zhuǎn)座子、 TALE化、ZFN技術(shù)，但運些技術(shù)制備基因工程大鼠的效率低下，且只能實現(xiàn)系統(tǒng)敲除，不易實 現(xiàn)條件敲除，運對致死基因和特定組織的研究不利。
[0007] CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas (CRISPR-associated)系統(tǒng)是一種原核生物特有的針對外源性遺傳物質(zhì)的免疫系統(tǒng)，通過 序列特異的RNA介導，切割降解外源性DNA，包括隧菌體和外源質(zhì)粒。CRISPR/tas系統(tǒng)可W作 為一種具有位點特異性的基因編輯系統(tǒng)，其最大的特點是操作簡單、成本低、作用高效。 2013年，科學家首次報道CRI SPR/Cas系統(tǒng)在細胞上應(yīng)用成功，隨后，在斑馬魚、果蛹、小鼠、 大鼠、豬中迅速得到應(yīng)用。CRISPR/化S系統(tǒng)憑借其巨大優(yōu)勢迅速成為基因編輯工具中的侵 侵者，在基因功能研究、疾病模型、基因治療等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。近幾年隨著CRISPR/ 化s9技術(shù)的發(fā)展，大鼠基因修飾模型已經(jīng)具有可行性。目前尚未見到CRISPR/Cas9系統(tǒng)表達 敲除fPSl基因大鼠模型的報道。
[0008] 綜上所述，目前PS1基因的功能未知，也沒有相關(guān)的大鼠模型用于研究，因此本領(lǐng) 域迫切需要能研究PS1基因，進而用于有關(guān)的藥物開發(fā)的合適動物模型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種條件性敲除PS1基因的載體及其應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)介導同源重組PS1基因修飾W獲得條 件性敲除PS1基因的f lox大鼠。
[0011] 本發(fā)明首先提供一種質(zhì)粒LScK0，WpUC19載體骨架，載體上引入兩個LoxP位點和 多克隆位點。
[0012] 優(yōu)選地，質(zhì)粒LScKO是用EcoR巧日化ndin酶切PUC19載體，將核巧酸序列如SEQ ID NO. 10所示的片段連至PUC19載體得到。
[0013] 本發(fā)明提供一種條件性敲除PS1基因的同源重組載體，通過W下步驟制備得到：
[0014] (1似野生型大鼠基因組為模板，PCR擴增A、B、CS段同源重組片段;B片段為PS1基 因的第4外顯子，其核巧酸序列如SEQ ID NO.9所示，A、C片段為PS1基因的第4外顯子的同源 左、右臂，其核巧酸序列分別如SEQ ID NO.7-8所示；
[001引（2)將A、B、C片段分別與上述的LScKO載體連接，構(gòu)建條件性敲除PS1基因的同源重 組載體。
[0016] 優(yōu)選地，擴增A、B、C片段的引物分別如SEQ ID N0.1-2、SEQ ID N0.3-4、SEQ ID NO. 5-6 所示。
[0017] 本發(fā)明提供了上述同源重組載體在制備轉(zhuǎn)基因大鼠中的應(yīng)用。
[001引本發(fā)明提供了特異性祀向大鼠 PS1基因的sgRNA，其DNA序列如W下任一對所示： 沈Q ID NO.20-21;沈Q ID NO.22-23;SEQ ID NO.24-25;沈Q ID NO.26-27;SEQ ID NO.28- 29；SEQ ID NO.30-31；SEQ ID NO.32-33；SEQ ID NO.34-35；SEQ ID NO.36-37；SEQ ID NO.38-39;SEQ ID NO.40-41;SEQ ID NO.42-43;沈Q ID NO.44-45;沈Q ID NO.46-47;沈Q ID NO.48-49;SEQ ID NO.50-51。
[0019] 優(yōu)選地，特異性祀向大鼠 PSI基因的sgRNA為表3中的sgRNA-2和sgRNA-13，其DNA序 列分別如沈Q ID NO.22-23所示或如沈Q ID NO.44-45所示。
[0020] 本發(fā)明提供了含有上述SgRNA的CRISPR/tas9打祀載體。
[0021] 本發(fā)明提供了一種條件性敲除PS1基因的flox大鼠的制備方法，包括W下步驟：
[0022] 1)選4-5周齡發(fā)育良好的SD雌鼠，腹腔注射孕馬血清促性腺激素20IU，48小時后注 射人絨毛促性腺激素20IU;
[0023] 2)所述SD雌鼠經(jīng)過步驟1)的激素超排處理后，與SD公鼠合籠，次日清晨挑選檢栓 成功的雌鼠，從檢栓成功的雌鼠得到單細胞受精卵；
[0024] 3)選8周齡W上的正常SD雌鼠與輸精管結(jié)扎過的SD公鼠合籠，次日選取檢栓成功 的雌鼠，即為假孕SD雌鼠；
[0025] 4)將權(quán)利要求4所述的SgRNA和化s9mRNA及權(quán)利要求2所述的同源重組載體溶液利 用顯微注射方法直接注入單細胞受精卵的胞漿內(nèi)，通過調(diào)節(jié)半定量儀的注射時間和注射壓 力來調(diào)整合適的注射量，W溶液明顯流入胞漿而不至于導致細胞死亡為止;其中化s9mRNA 和重組載體的濃度范圍在30-5化gAiL，sgRNA的濃度范圍在15-30ngAiL，優(yōu)選的濃度分別是 30ng/]iL 及 15]1邑/化；
[0026] 5)注射后的受精卵在培養(yǎng)基中短暫培養(yǎng)后，移植到假孕SD雌鼠的輸卵管內(nèi)，待產(chǎn) 仔后，經(jīng)PCR鑒定陽性的大鼠即為陽性大鼠。
[0027] 本發(fā)明提供了上述同源重組載體與CRISPR/Cas9打祀載體在制備研究阿爾茨海默 病相關(guān)動物模型中的應(yīng)用。
[00%]本發(fā)明提供了上述同源重組載體與CRISPR/Cas9打祀載體在制備與阿爾茨海默病 相關(guān)疾病動物模型用于治療藥物研發(fā)中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明提供了一種條件性敲除PS1基因的動物模型，其基因組中含有本發(fā)明所述 的同源重組載體。
[0030] 優(yōu)選地，所述動物為大鼠、小鼠、斑馬魚。
[0031] 利用本方法構(gòu)建的flox大鼠具備W下優(yōu)點：1)制備過程簡單，操作簡便、效率高； 2)可與不同Cre工具大鼠交配，即可得到組織特異性敲除PS1基因的大鼠，便于研究PS1基因 在不同組織中的功能；3)還可選擇與啟動子誘導表達化e的工具大鼠交配，獲得誘導性表達 組織特異性敲除PS1基因的大鼠，運在研究阿爾茲海默癥等老年性疾病中可能有助于更好 的模擬人類AD疾病的機理，進而用于有關(guān)的藥物開發(fā)。
【附圖說明】
[0032] 圖1為PS1基因大鼠構(gòu)建的基因打祀策略。
[0033] 圖2為LScKO質(zhì)粒圖譜。
[0034] 圖3為重組載體酶切電泳圖，M為標準條帶，1、2、3、4分別為4個克隆的酶切結(jié)果。
[0035] 圖4為pT7-sgRNA質(zhì)粒圖譜。
[0036] 圖5A為針對5'端祀位點設(shè)計的8組S排NA活性檢測結(jié)果，其SgRNA編號為S排NA1- sgRNAS，圖5B為針對3 '端祀位點設(shè)計的8組sgRNA活性檢測結(jié)果，其sgRNA編號為s排NA9- sgRNAl 6，其中，NC為陰性對照，PC為陽性對照，WT為空白。
[0037]圖6A為首建鼠第一對引物的PCR結(jié)果，圖6B為首建鼠第二對引物的PCR結(jié)果，+:陽 性對照;陰性對照;其它未標注的條帶為非陽性的大鼠。
[003引圖7A為fPSl大鼠第一對引物的PCR結(jié)果，圖7B為fPSl大鼠第二對引物的PCR結(jié)果， + :陽性對照;陰性對照。
[0039] 圖8為fPSl大鼠 southern blot結(jié)果。
【具體實施方式】
[0040] W下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0041] NotI、HindIII、EcoRI、NdeI酶購自肥B，貨號為分別R3189S、R310M、R3101M、 R011 ILeToplO感受態(tài)細胞購自 Tiangen公司，貨號為CB104-02; NucleoBond液Xtra Maxi Plus EF購自Macher巧-Nagel，貨號為740426<Xas9mRNA來源：SIGMA，貨號：CAS9MRNA-1EA。
[0042] 實施例1 PSl基因同源重組載體的構(gòu)建
[0043] 該載體設(shè)計是將PS1基因的第4外顯子敲除，從而實現(xiàn)失活整個基因。首先從野生 型SD大鼠組織基因組DNA擴增3段同源重組片段(A，B和C)，分別通過酶切連接的方式連接至 LScKO載體，構(gòu)建PS1條件性基因敲除載體質(zhì)粒。LScKO載體圖譜見圖2。骨架來源(載體骨架 為PUC19，來自化kara，貨號3219)經(jīng)發(fā)明人設(shè)計改造，載體上引入LoxP位點和多克隆位點， 見圖2。具體改造方式如下：由質(zhì)粒合成公司合成片段DNA(如SEQ ID腸.10)，用6。〇1?1和 Hindlll酶切PUC19載體，將合成的片段連至PUC19載體上，經(jīng)測序公司測序驗證，結(jié)果表明 獲得了正確的目的質(zhì)粒。
[0044] 1、S段同源重組片段引物設(shè)計
[0045] 根據(jù)實驗設(shè)計方案，設(shè)計擴增同源重組片段(A，B和C)的引物，利用NCBI引物設(shè)計 軟件設(shè)計結(jié)果見表1。
[0046] 表1同源重組片段擴增引物
[0047]
[004引 2、同源重組片段的PCR擴增
[0049] W野生型SD大鼠組織基因組DNA為模板，使用KOD-Plus-酶擴增S段同源重組片段 (A、巧口 C)
[0050] 反應(yīng)體系（20化)如下：
[0化3]表2 PCR擴增反應(yīng)條件：
[0化1:
[0052:
[0化4]
[0化5] 相不同引物退火溫度見表1，
[0056] 帥每個循環(huán)降0.7°C，退火溫度為首次反應(yīng)溫度。
[0057] 3、目的片段與載體質(zhì)粒連接
[005引依次將B、A、C =個片段依次連接至載體質(zhì)粒，具體連接位置見圖2,連接反應(yīng)體系 (10化)如下：
[0化9]
[0060] 其中W上反應(yīng)體系載體WlOng為優(yōu);室溫反應(yīng)至少20min(也可過夜處理）。
[0061] 將最終反應(yīng)得到的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌T0P10感受態(tài)細胞中，涂平板并挑取 單菌落接種于含lOOmg/L氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12-16小時，8000 X g離屯、 lOmin收集菌體。使用Nucle〇B〇nd?Xtra Maxi Plus EF大提試劑盒，按照說明書方法提 取質(zhì)粒。
[0062] 4、重組載體的鑒定
[0063] 隨機挑選四個克隆，用限制性內(nèi)切酶齡《、化11(1111、6(3〇1?1和炯61對重組載體進行 酶切，而后進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖3所示。連接正確的結(jié)果為：
[0064] NotI、HindIII:應(yīng)得到 1235bp巧300bp [00化]EcoRI:應(yīng)得到484bp+2437bp+3614bp
[0066] Ndel:應(yīng)得到 2914bp+362 化 P
[0067] 根據(jù)電泳結(jié)果圖中條帶的大小初步判斷重組載體全部構(gòu)建正確，再將3、4號質(zhì)粒 送測序公司進行測序驗證，結(jié)果表明獲得了目的重組載體的質(zhì)粒。
[0068] 實施例2 CRISPR/Cas9打祀質(zhì)粒的構(gòu)建
[0069] UsgRNA片段設(shè)計、合成與構(gòu)建：
[0070] =^。 …"山化
[0071]
[0072]
[0073] 1、具體設(shè)計如下：
[0074] (a)在NCBI上尋找PS1基因的相關(guān)信息；該基因 ID號為29192,位于第6號染色體上， 約47.9純6，
[00"75] (b)利用Crispr 軟件化 ttpV/crispr.mit.edu/)設(shè)計 sgRNA 片段
[0076] (C)在NCBI數(shù)據(jù)庫上對選擇的祀點進行分析，確定敲除區(qū)域。選擇脫祀位點較少的 sgRNA位點，最后將祀位點定在4號外顯子上。
[0077] 2、針對5'端祀位點設(shè)計的8組SgRNA,其SgRNA編號為sgRNAl-sgRNAS，針對3'端祀 位點設(shè)計的8組SgRNA,其SgRNA編號為sgRNA9-sgRNA16,序列見表3。使用本公司自主開發(fā)的 UCA活性檢測方法檢測SgRNA活性，5 '祀位點活性檢測結(jié)果見圖5A，3 '祀位點活性檢測結(jié)果 見圖5A。優(yōu)選活性最高的兩對sgRNA(分別sgRNA-2和sgRNA-13)用于基因編輯，將片段退火 為雙鏈片段；
[007引退火的條件如下:將一對SgRNA單鏈用水溶解至終濃度為lOOiiM，各取15化混合，放 入沸水浴5min，然后自然緩慢降至低于40°C即可。
[0079] 3、將上述兩對SgRNA退火后的雙鏈片段分別連接到pT7-sgRNA載體中得到連接產(chǎn) 物(SgRNA表達質(zhì)粒），并利用構(gòu)建的質(zhì)粒進行W T7啟動子介導的體外轉(zhuǎn)錄，即W T7啟動子作 為體外轉(zhuǎn)錄的啟動子，利用RNA聚合酶在體外實現(xiàn)從DNA到mRNA的轉(zhuǎn)錄過程。
[0080] (a)連接反應(yīng)的體系如下：
[0081；
[0082] 至M注巧iU-3Umin，巧化里3U化TUFiU恐交念細肥甲，然后取20化L涂布于Kan抗 性的平板，37°C培養(yǎng)12小時后挑選2個克隆接種含有Kan抗性的LB培養(yǎng)基（5ml)中，37°C， 25化pm搖培至少12小時后，小提質(zhì)粒送測序公司測序。
[0083] pT7-sgRNA載體圖譜見圖4如下。該質(zhì)粒骨架來源化kara，貨號3299。由質(zhì)粒合成公 司合成含有T7啟動子及SgRNA scaffold的片段DNA(如SEQ ID NO. 11所示)并依次通過酶切 化coRI及BamHI)連接至骨架載體上，經(jīng)專業(yè)測序公司測序驗證，結(jié)果表明獲得了目的質(zhì)粒。
[0084] (b)體外轉(zhuǎn)錄
[00化]測序通過后，使用Ambion體外轉(zhuǎn)錄試劑盒MEGA sho;rtsc;riptTM Kit(貨號AM1354) 按照說明書方法，對上述的2個陽性克隆進行體外轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)離屯、、收集柱純化后得 到SgRNA的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)。
[00化]實施例3利用針對口別基因的CRISPR-化s9系統(tǒng)mRNA生產(chǎn)flox大鼠
[0087] 1、顯微注射及受精卵移植
[0088] 取SD大鼠的原核期受精卵，利用顯微注射儀將預(yù)混好的實施例2獲得的2組S排NA 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、Cas9mRNA和實施例1制得的重組載體的混合物，注射至大鼠受精卵的胞漿內(nèi)， 注射后的受精卵轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中短暫培養(yǎng)，然后移植至受體雌鼠的輸卵管中發(fā)育，轉(zhuǎn)移177 個胚胎獲得32只首建鼠（即founder鼠）。
[0089] 顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因大鼠的具體方法如下：
[0090] 1)選4-5周齡發(fā)育良好的SD雌鼠，腹腔注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)20IU，48小 時后注射人絨毛促性腺激素化CG) 20IU;
[0091] 2)所述SD雌鼠經(jīng)過步驟1)的激素超排處理后，與SD公鼠按1:1合籠，次日清晨挑選 檢栓成功的雌鼠，從檢栓成功的雌鼠得到單細胞受精卵；
[0092] 3)選8周齡W上的正常SD雌鼠與輸精管結(jié)扎過的SD公鼠按1:1合籠，次日選取檢栓 成功的雌鼠，即為假孕SD雌鼠；
[0093] 4)將預(yù)混好的Cas9mRNA/sgRNA混合物及重組載體溶液利用顯微注射方法直接注 入單細胞受精卵的胞漿內(nèi)，通過調(diào)節(jié)半定量儀的注射時間和注射壓力來調(diào)整合適的注射 量，W溶液明顯流入胞漿而不至于導致細胞死亡為止;其中化s9mRNA和重組載體的濃度范 圍在30-50ng/化，sgRNA的濃度范圍在15-30ng/化，優(yōu)選的濃度分別是30ng/化及15ng/化；
[0094] 5)注射后的受精卵在培養(yǎng)基中短暫培養(yǎng)30min后，移植到假孕SD雌鼠的輸卵管內(nèi)， 待產(chǎn)仔后，經(jīng)PCR鑒定陽性的大鼠即為陽性大鼠。本次共轉(zhuǎn)移177個胚胎得到32只founder 贏D
[00巧]2、陽性大鼠的鑒定
[0096] 對32只大鼠的鼠尾基因組DNA進行PCR分析，引物針對PS1基因的第4外顯子，引物 對序列如下：
[0097] 第一對引物；
[0098] 上游引物:GACTCCACAGTCATGGTCACACTGT
[0099] 下游引物:GACGCCTAGATTGTGCTACTCTCAGCT
[0100] 第二對引物：
[0101 ]上游引物:CGTGCTAGATCGACTGCTAGAGTGAC
[0102] 下游引物:GCCTGGCACTCACCTTGTAGCACC
[0103] 如果重組載體插入正確，則有PCR條帶，產(chǎn)物長度應(yīng)為2993bp;如果重組載體未插 入，則無 PCR條帶。
[0104] PCR體系與實施例1中同源重組片段的PCR擴增體系一致;PCR擴增反應(yīng)條件如表4: [01化]表4
[0106]
[0107] *每個循環(huán)降〇.7°C
[0108] 32只大鼠中，共有3只經(jīng)鑒定為陽性大鼠。3只大鼠的PCR鑒定結(jié)果見圖，陽性為一 條2993bp的特異條帶。其中，編號為3、6和7的為陽性大鼠。見圖6A和圖6B。
[0109] 實施例4 fPSl大鼠的鑒定、繁育和傳代擴群
[0110] fPSl首建鼠（founder鼠，即FO代大鼠）建成后，與野生型SD大鼠雜交進行傳代、培 育。培養(yǎng)方法按照常規(guī)大鼠飼養(yǎng)模式進行。同時對所得的子代大鼠進行PCR鑒定及Southern blot分析。
[0111] PCR分析方法同實施例3。應(yīng)用Southern blot方法對24只PCR確認為陽性大鼠進行 進一步確認，剪取鼠尾提取基因組DNA，選用Seal酶消化基因組，轉(zhuǎn)膜，雜交。探針P1、P2分別 位于片段A外側(cè)及片段C上。探針合成引物如下：
[0112]
[0113] 制備成功的基因工程大鼠經(jīng)探針雜交分別產(chǎn)生15.5化和6.化b或8. Ikb大小的條 帶，而野生型的SD大鼠基因組只有15.5化的條帶，不會有雜交條帶產(chǎn)生。實驗結(jié)果顯示雜交 條帶大小均與預(yù)期相符，證實有7只大鼠為陽性大鼠，編號分別為Fl-4、Fl-9、Fl-16、Fl-33、 Fl-37、Fl-47、Fl-49。
[0114] W上結(jié)果顯示實施例3中構(gòu)建的fPSl大鼠能夠穩(wěn)定傳代，且無隨機插入。PCR電泳 圖見圖7A和圖TBaSouthern blot結(jié)果見圖8。








【主權(quán)項】
1. 一種質(zhì)粒LScKO,其特征在于，以PUC19載體骨架，載體上引入兩個LoxP位點和多克隆 位點。2. -種條件性敲除PS1基因的同源重組載體，其特征在于，通過以下步驟制備得到： (1) 以野生型大鼠基因組為模板，PCR擴增A、B、C三段同源重組片段;B片段為PS1基因的 第4外顯子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，A、C片段為PS1基因的第4外顯子的同源左、 右臂，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.7-8所示； (2) 將A、B、C片段分別與權(quán)利要求1所述的LscKO載體連接，構(gòu)建條件性敲除PS1基因的 同源重組載體。3. 權(quán)利要求2所述的同源重組載體在制備基因工程大鼠中的應(yīng)用。4. 特異性靶向大鼠 PS1基因的sgRNA，其特征在于，其DNA序列如以下任一對所示：SEQ ID NO.20-21；SEQ ID NO.22-23；SEQ ID NO.24-25；SEQ ID NO.26-27；SEQ ID NO.28-29； SEQ ID NO.30-31；SEQ ID NO.32-33；SEQ ID NO.34-35；SEQ ID NO.36-37；SEQ ID N0.38-39；SEQ ID NO.40-41；SEQ ID NO.42-43；SEQ ID NO.44-45；SEQ ID NO.46-47；SEQ ID NO .48-49;SEQ ID NO.50-51。5. 含有權(quán)利要求4所述sgRNA的CRI SPR/Cas9打靶載體。6. -種用于條件性敲除PS1基因的flox大鼠的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 選4-5周齡發(fā)育良好的SD雌鼠，腹腔注射孕馬血清促性腺激素20IU，48小時后注射人 絨毛促性腺激素20IU; 2) 所述SD雌鼠經(jīng)過步驟1)的激素超排處理后，與SD公鼠合籠，次日清晨挑選檢栓成功 的雌鼠，從檢栓成功的雌鼠得到單細胞受精卵； 3) 選8周齡以上的正常SD雌鼠與輸精管結(jié)扎過的SD公鼠合籠，次日選取檢栓成功的雌 鼠，即為假孕SD雌鼠； 4) 將權(quán)利要求4所述的sgRNA和Cas9mRNA及權(quán)利要求2所述的同源重組載體溶液利用顯 微注射方法直接注入單細胞受精卵的胞漿內(nèi)，通過調(diào)節(jié)半定量儀的注射時間和注射壓力來 調(diào)整合適的注射量，以溶液明顯流入胞漿而不至于導致細胞死亡為止;其中Cas9mRNA和重 組載體的濃度范圍在30-50ngAiL，sgRNA的濃度范圍在15-30ngAiL，優(yōu)選的濃度分別是 30ng/yL及15ng/yL; 5) 注射后的受精卵在培養(yǎng)基中短暫培養(yǎng)后，移植到假孕SD雌鼠的輸卵管內(nèi)，待產(chǎn)仔后， 經(jīng)PCR鑒定陽性的大鼠即為陽性大鼠。7. 權(quán)利要求2所述的同源重組載體與權(quán)利要求5所述的CRISPR/Cas9打靶載體在制備研 究阿爾茨海默病相關(guān)動物模型中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求2所述的同源重組載體與權(quán)利要求5所述的CRISPR/Cas9打靶載體在制備與 阿爾茨海默病相關(guān)疾病動物模型用于治療藥物研發(fā)中的應(yīng)用。9. 一種用于條件性敲除PS1基因的動物模型，其基因組中含有權(quán)利要求2所述的同源重 組載體。10. 如權(quán)利要求9所述的動物模型，所述動物為大鼠，小鼠或斑馬魚。
【文檔編號】A61K49/00GK106047930SQ201610548051
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月12日
【發(fā)明人】沈月雷
【申請人】北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司