一種利用talen技術(shù)構(gòu)建可敲除小鼠cramp基因質(zhì)粒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種利用TALEN技術(shù)構(gòu)建可敲除小鼠 CRAMP基因質(zhì)粒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 如何對(duì)基因組的進(jìn)行精確高效的靶向修飾一直以來(lái)是一個(gè)難題。傳統(tǒng)的基因打靶 技術(shù)的理論基礎(chǔ)是細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生的同源染色體隨機(jī)互換，使用這種技術(shù)進(jìn)行基因打靶， 效率非常低，通常只有1(T6-10'近年發(fā)展很快的序列特異的核酸酶可以用于精確的基因 組靶向修飾，它們一般為融合蛋白，組成是一個(gè)特異序列的DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)非特 異的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。修飾機(jī)制是受限由DNA識(shí)別域?qū)⒑怂醿?nèi)切酶定位到需要編輯的基 因組區(qū)域，非特異性核酸內(nèi)切酶就會(huì)切斷雙鏈DNA，這樣形成的DNA雙鏈斷裂就會(huì)激活DNA 自我修復(fù)，而DNA自我修復(fù)的過(guò)程中則會(huì)出現(xiàn)基因突變，從而實(shí)現(xiàn)特定基因的敲除，或是引 入新的同源序列與其進(jìn)行同源重組，實(shí)現(xiàn)特定基因的敲入。如今研宄最清晰、應(yīng)用最廣泛的 序列特異核酸酶是鋅指核酸酶（Zinc-fingernucleases，ZFNs)。
[0003] 盡管鋅指核酸酶技術(shù)的出現(xiàn)促使基因靶向修飾技術(shù)向前邁進(jìn)了一大步，但是ZFN 技術(shù)還存在很多缺陷，例如對(duì)位點(diǎn)識(shí)別的不確定性，打靶效率低下，并且脫靶率較高。并且 目前對(duì)于許多研宄者而言，設(shè)計(jì)出特異性靶向基因組目的序列的鋅指核酸酶仍然是一個(gè)相 當(dāng)大的技術(shù)挑戰(zhàn)。近期有研宄發(fā)現(xiàn)黃單胞桿菌屬的植物病原菌中存在的一種轉(zhuǎn)錄激活因子 樣效應(yīng)物（transcriptionactivator-likeeffector，TALE)通過(guò)結(jié)合宿主的DNA和啟動(dòng) 特定的效應(yīng)物基因來(lái)使植物致病或者引發(fā)防御。這種識(shí)別是基于一系列（34個(gè)）有簡(jiǎn)并性 的氨基酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)的。與ZFN相似的是，TALEs也是由12個(gè)或以上特異識(shí)別DNA的串聯(lián) "蛋白模塊"和兩側(cè)的N-末端及C-末端序列組成。這一系列模塊的氨基酸大多數(shù)序列都是 重復(fù)的，而不同的地方基本上是在重復(fù)序列的12和13位，這些重復(fù)的氨基酸序列叫做重復(fù) 可變序列（RVDs)。第12和13位殘基是靶向識(shí)別的關(guān)鍵位點(diǎn)，被稱作di-residues。然而不 同于每個(gè)鋅指蛋白識(shí)別特異性的三聯(lián)體堿基，TALEs上的每個(gè)RVDs僅能識(shí)別一個(gè)堿基，并 且沒(méi)有明顯的前后核酸依賴性。TALEs可被設(shè)計(jì)識(shí)別和結(jié)合所有的目的DNA序列。在TALEs 上附加一個(gè)核酸酶就生成了轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs)。TALENs可與DNA結(jié) 合并在特異位點(diǎn)對(duì)DNA鏈進(jìn)行切割，從而敲除或?qū)胄碌倪z傳物質(zhì)。
[0004] 中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN201410528743. 6,公開(kāi)了一對(duì)革巴向斑馬魚(yú)Forkheadboxnl基 因的Talen識(shí)別序列及其用于革El向敲除斑馬魚(yú)Forkheadboxnl基因的mRNA的制備方法。 中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN201310455151. 1公開(kāi)了一種靶向整合外源DNA序列到大鼠和小鼠Rosa26 位點(diǎn)的方法，其通過(guò)構(gòu)建TALEN質(zhì)粒、小鼠同源重組模板質(zhì)粒和大鼠同源重組模板質(zhì)粒，并 將該相應(yīng)的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入小鼠或大鼠細(xì)胞中，能獲得穩(wěn)定細(xì)胞株表達(dá)各種外源基因。中國(guó) 專(zhuān)利文獻(xiàn)CN201310124191. 8,公開(kāi)了一種穿透型TAT-TALEN蛋白及內(nèi)源性基因被敲除的細(xì) 胞的制備方法和應(yīng)用。
[0005] 關(guān)于靶向敲除小鼠CRAMP基因的TALEN識(shí)別序列、質(zhì)粒及利用TALEN技術(shù)靶向敲 除小鼠CRAMP基因的方法，目前還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種用于定向敲除鼠源性細(xì)胞 CRAMP基因的TALEN識(shí)別序列對(duì)。
[0007] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種利用上述識(shí)別序列對(duì)構(gòu)建的小鼠CRAMP基因敲 除的載體質(zhì)粒。
[0008] 本發(fā)明的另一的目的是，提供上述載體質(zhì)粒的用途。
[0009] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供一種內(nèi)源性CRAMP基因敲除的細(xì)胞的制備方法。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0011] 一種用于定向敲除鼠源性細(xì)胞CRAMP基因的TALEN識(shí)別序列對(duì)，所述TALEN識(shí)別 序列對(duì)由左臂識(shí)別序列和右臂識(shí)別序列組成；所述左臂識(shí)別序列如SEQIDNO. 9所示；所 述右臂識(shí)別序列如SEQIDNO. 12所示。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0013] 利用上述識(shí)別序列構(gòu)建的小鼠CRAMP基因敲除的載體質(zhì)粒，包括TALENL鏈和 TALENR鏈。
[0014] 所述的TALENL鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO. 1所示序列的堿基編碼；所述的TALENR鏈?zhǔn)?由SEQIDNO. 2所示序列的堿基編碼。
[0015] 將該載體質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄生成mRNA后注射到小鼠的受精卵中就能夠得到CRAMP 敲除的嵌合體小鼠，轉(zhuǎn)染到鼠源性細(xì)胞中就能夠得到相應(yīng)的CRAMP基因敲除的細(xì)胞株。
[0016] 為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0017] 所述的載體質(zhì)粒在定向敲除鼠源性細(xì)胞的CRAMP基因，構(gòu)建CRAMP基因敲除的小 鼠中的應(yīng)用。
[0018] 為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0019] 一種內(nèi)源性CRAMP基因敲除的細(xì)胞的制備方法，將所述的編碼TALENL鏈和編碼 TALENR鏈的核苷酸序列分別插入原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染入含有內(nèi)源性的CRAMP基因的細(xì) 胞中以敲除CRAMP基因，從而獲得內(nèi)源性CRAMP基因被敲除的細(xì)胞。
[0020] 利用本發(fā)明的載體質(zhì)粒構(gòu)建獲得了CRAMP基因敲除的細(xì)胞株3T3Aiamp和 LLC廣cramp。
[0021] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0022] 采用先進(jìn)的TALEN基因敲除技術(shù)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異TALENs識(shí)別序列，該識(shí)別序列針 對(duì)CRAMP基因，可構(gòu)建載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到鼠源性細(xì)胞中，通過(guò)藥物篩選，有限稀釋挑選單克隆 而快速的獲得所需的純細(xì)胞株。本發(fā)明的質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)錄生成mRNA后注射到小鼠的受精 卵中就能夠快速得到CRAMP基因敲除的R)代嵌合體小鼠。本發(fā)明具有構(gòu)建CRAMP載體質(zhì) 粒周期短、轉(zhuǎn)染效率高、定向敲除準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)；應(yīng)用本發(fā)明在對(duì)CRAMP基因進(jìn)行敲除的同時(shí) 不會(huì)引入任何外源性基因，不存在隨機(jī)插入到細(xì)胞的基因組中引入插入性突變的風(fēng)險(xiǎn)，并 且在進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用后逐漸被細(xì)胞降解不會(huì)一直存在于細(xì)胞內(nèi)。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 附圖1是TALEN質(zhì)粒構(gòu)建及活性鑒定流程。
[0024] 附圖2是TALEN的左、右臂識(shí)別序列。
[0025] 附圖3是CRAMP-L2氨基酸標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)結(jié)果一。
[0026] 附圖4是CRAMP-L2氨基酸標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)結(jié)果二。
[0027] 附圖5是CRAMP-R2氨基酸標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)結(jié)果一。
[0028] 附圖6是CRAMP-R2氨基酸標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)結(jié)果二。
[0029] 附圖7是細(xì)胞基因組測(cè)序套峰。
[0030]附圖8是基因敲除/突變位點(diǎn)分析。
[0031] 附圖9是WesternBlot檢測(cè)LLC1和LLClA-el:amp細(xì)胞中的cramp蛋白表達(dá)情況。 其中1為L(zhǎng)LC1細(xì)胞株；2-4為隨機(jī)挑選的轉(zhuǎn)入了Talen質(zhì)粒LLC1單克隆細(xì)胞株。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō) 明。應(yīng)理解，下述實(shí)施例僅用于發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中未注明具 體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照生產(chǎn)廠商所建議的條件。除非另行定義，文中 所使用的所用專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。
[0033] 實(shí)施例
[0034] 本實(shí)施例的TALEN質(zhì)粒構(gòu)建及活性鑒定流程見(jiàn)圖1。
[0035] 一、構(gòu)建可敲除CRAMP基因的TALEN原核表達(dá)載體。
[0036](一）NCBI下載小鼠CRAMP的基因組序列（SEQIDNO. 3)，選擇打靶目標(biāo)。目標(biāo)序 列：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于定向敲除鼠源性細(xì)胞CRAMP基因的TALEN識(shí)別序列對(duì)，其特征在于，所述TALEN 識(shí)別序列對(duì)由左臂識(shí)別序列和右臂識(shí)別序列組成；所述左臂識(shí)別序列如SEQIDNO. 9所示； 所述右臂識(shí)別序列如SEQIDNO. 12所示。
2. 利用權(quán)利要求1所述的識(shí)別序列構(gòu)建的小鼠CRAMP基因敲除的載體質(zhì)粒，其特征在 于，所述的載體質(zhì)粒包括TALENL鏈和TALENR鏈。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的小鼠CRAMP基因敲除的載體質(zhì)粒，其特征在于，所述的TALEN L鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO. 1所示序列的堿基編碼；所述的TALENR鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO. 2所示序 列的喊基編碼。
4. 權(quán)利要求3所述的載體質(zhì)粒在定向敲除鼠源性細(xì)胞的CRAMP基因，構(gòu)建CRAMP基因 敲除的小鼠中的應(yīng)用。
5. -種內(nèi)源性CRAMP基因敲除的細(xì)胞的制備方法，其特征在于，將權(quán)利要求3所述的編 碼TALENL鏈和編碼TALENR鏈的核苷酸序列分別插入原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染入含有內(nèi)源 性的CRAMP基因的細(xì)胞中以敲除CRAMP基因，從而獲得內(nèi)源性CRAMP基因被敲除的細(xì)胞。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一對(duì)用于定向敲除鼠源性細(xì)胞CRAMP基因的TALEN識(shí)別序列對(duì)及利用該識(shí)別序列構(gòu)建的載體質(zhì)粒。所述TALEN識(shí)別序列對(duì)的基因序列分別如序列表SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12所示。所述的載體質(zhì)粒包括TALEN L鏈和R鏈；所述的TALEN L鏈?zhǔn)怯蒘EQ ID NO.1所示序列的堿基編碼；所述的TALEN R鏈?zhǔn)怯蒘EQ ID NO.2所示序列的堿基編碼。本發(fā)明還公開(kāi)了一種內(nèi)源性CRAMP基因敲除的細(xì)胞的制備方法，將編碼TALEN L鏈和R鏈的核苷酸序列分別插入原核表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染入含有內(nèi)源性的CRAMP基因的細(xì)胞，從而得到內(nèi)源性CRAMP基因被敲除的細(xì)胞。
【IPC分類(lèi)】C12N15-85, C12N15-55, A01K67-027, C12N15-11, C12N15-12, C12N5-10
【公開(kāi)號(hào)】CN104694539
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510102677
【發(fā)明人】李冬, 吳軍錄, 權(quán)文強(qiáng)
【申請(qǐng)人】上海市同濟(jì)醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年3月9日