鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法
【專利摘要】鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：鼠肝臟DNA的獲取，探針引物的制備，基因組DNA酶切，酶切產(chǎn)物的電泳，轉(zhuǎn)膜，雜交和洗膜、信號檢測。本發(fā)明的應(yīng)用能有效的避免鼠疫菌檢測過程中假陽性的出現(xiàn)，能準(zhǔn)確判斷樣本的陰陽性，避免傳統(tǒng)方法中的分離培養(yǎng)、鼠疫噬菌體裂解試驗和動物實驗等的繁瑣步驟，能夠快速、準(zhǔn)確的判斷樣本，可廣泛用于口岸不同媒介生物監(jiān)測點的鼠類樣品檢測。
【專利說明】
鼠疫菌Southern印巧雜交檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種生物病原體的檢測技術(shù)手段，特別是一種應(yīng)用Southern印記雜交 法快速檢測鼠疫菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，鼠疫菌的監(jiān)測方法主要為W下幾種：
[0003] 鼠疫菌檢測的經(jīng)典方法-常規(guī)檢測方法檢測鼠疫菌，檢測步驟主要包括顯微鏡涂 片檢查、分離培養(yǎng)、鼠疫隧菌體裂解試驗和動物實驗，包括涂片后進行革蘭染色、Wayson染 色或免疫巧光法觀察，分別從細菌形態(tài)鑒定、F1抗原檢測、毒力判定幾個方面全方位的鑒定 了鼠疫菌，運種方法有利于研究者對鼠疫疫源地和流行強度的研究，但是運種方法耗時長、 過程復(fù)雜、需要研究者具有較豐富的研究經(jīng)驗。
[0004] 免疫學(xué)檢測法的研究基礎(chǔ)仍是針對芙膜抗原-F1抗原展開的實驗研究。國內(nèi)主要 采用的方法是間接血凝試驗（IHA)和反向血凝試驗(RIHA)，但是由于其敏感性和特異性相 對較低，操作復(fù)雜的特點，很少用于口岸的檢測檢驗，至今為止，IHA是國內(nèi)外一致公認鼠疫 追溯診斷的有效方法，也是我國應(yīng)用最為廣泛的一種血清學(xué)診斷方法。但是IHA不能對鼠疫 患者進行早期診斷，而且有報道IHA出現(xiàn)假陽性結(jié)果;RIHA基層應(yīng)用較多，但此種方法受到 試劑、溶液酸堿度等的影響，使得特異性受到一定限制。近年來，國外興起的快速診斷技術(shù)- 膠體金免疫層析法（Immunochromatogra地y Assay)應(yīng)用于鼠疫的快速診斷效果較好，在醫(yī) 學(xué)檢驗中得到了廣泛應(yīng)用，其敏感性和特異性都超過了化ISA等診斷手段。
[0005] 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測是時下比較熱口的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于很多領(lǐng) 域中，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，鼠疫研究領(lǐng)域中PCR逐步得到應(yīng)用與完善。PCR作為 檢測手段，引物設(shè)計非常重要，選擇合適的鼠疫耶爾森氏菌特異的DNA祀序列是決定試驗系 統(tǒng)特異性和靈敏性的關(guān)鍵所在。但是由于PCR檢測受到實驗條件、儀器儲備等多方面的限制 W及容易導(dǎo)致結(jié)果假陽性的出現(xiàn)，使得該技術(shù)在鼠疫檢測中的應(yīng)用較少，不能全面的推廣。
[0006] 全自動微生物分析系統(tǒng)(AMS)是一種由傳統(tǒng)生化反應(yīng)及微生物檢測技術(shù)與計算機 技術(shù)相結(jié)合，運用概率最大近似值模型法進行自動微生物檢測的技術(shù)，該系統(tǒng)具有準(zhǔn)確、快 速、操作簡單、用材節(jié)約、自動化強等優(yōu)點，因其技術(shù)要求高，操作條件受到限制，一直未能 在實際應(yīng)用中得到推廣。
[0007] Southern印記雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的具體方法之一。其基本原理 是:具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則形成雙鏈，此雜 交過程是高度特異的。Southern印記雜交技術(shù)十分靈敏，在理想的條件下，用放射性同位素 標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即便每條電泳帶僅含化神NA也能被清晰地檢測出 來。
[000引在1978年，簡悅威等醫(yī)學(xué)家在鑲狀細胞貧血癥的基因診斷中就采用過Southern雜 交的方法，取得了基因診斷的突破。2005年，楊娥等人采用Southern印記雜交技術(shù)檢測 HPV1抓NA在宮頸癌組織中的物理狀態(tài);2007年，郭新梅等人采用Southern印記雜交技術(shù)檢 測木糖異構(gòu)酶基因是否整合入轉(zhuǎn)基因植株中；2014年，張偉溪等人采用Southern印記雜交 檢測證實外源基因 W單拷貝方式整合到5個轉(zhuǎn)基因株系體內(nèi)，并取得了較好的實驗結(jié)果。多 年來，Southern印記雜交技術(shù)因其特異性強，靈敏性高的特點，多用在檢測遺傳病診斷、外 源基因檢測、DNA圖譜分析、PCR產(chǎn)物分析等方面。但在鼠疫菌檢測方面并未找到相關(guān)的文獻 及技術(shù)操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明的目的在于提供一種采用Southern印記雜交技術(shù)建立一種邊境口岸鼠疫檢 測的新方法，廣泛用于口岸不同媒介生物監(jiān)測點的鼠類樣品檢測。本發(fā)明的應(yīng)用能有效的 避免鼠疫菌檢測過程中假陽性的出現(xiàn)，能準(zhǔn)確判斷樣本的陰陽性，避免傳統(tǒng)方法中的分離 培養(yǎng)、鼠疫隧菌體裂解試驗和動物實驗等的繁瑣步驟，能夠快速、準(zhǔn)確的判斷樣本。
[0010] 本發(fā)明的目的是運樣實現(xiàn)的：鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，其特征在于:包 括W下步驟：鼠肝臟DNA的獲取，探針引物的制備，基因組DNA酶切，酶切產(chǎn)物的電泳，轉(zhuǎn)膜， 雜交和洗膜、信號檢測。
[0011] 本發(fā)明的目的還可W運樣實現(xiàn)：
[0012] 所述的探針引物的制備為:實驗通過NCBI查閱鼠疫菌特異基因 Pla的序列，設(shè)計引 物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR反應(yīng))從去毒的鼠疫菌基因組片段質(zhì)粒上擴增基因 Pla的部分序 列并測序;采用Dig-加 TP在Klenow酶的作用下，經(jīng)隨機引物PCR擴增可滲入到新合成的DNA 分子中，從而完成DNA探針的標(biāo)記。
[001引所述的探針引物的具體制備方法為：
[0014] 1)探針序列：
[0015] CGATTACTGATGTAATTATGGGGTTTCCGATTGATACGGAGATGGAGAAAGACAGTGAATATTCAAATA AGATCCGCCAGGAAAGTAAAATTTCAAAAACTGAAGGGACCGTGTCTTACGAACAGAAAATAACTGTTGAAACAGGT CAGGAAAAAGACGGTGTGAAAGTCTACCGTGTCATGGTTCTTGAGGGAACGATTGCCGAATCTATTGAACATCTCGA TAAGAAAGAGAACGAAGACATTCTGAATAATAACCGAAATCGCATCGTCCTAGCGGACAACACTGTCATTAACTTTG ACAATATTAGTCAACTGAAGGAATTTTTACGTCGTTCGGTAAATATTGTTGACCACGATATTTTCTCCAGTAATGGT TTTGAAGGGTTTAATCCGACAAGTCATTTTCCGTCTAATCCTAGTAGCGATTATTTTAACAGTACCGGTGTTACATT CGGTTCCGGGGTTGACCTTGGTCAGCGCCAA
[0016] 2)探針的標(biāo)記：
[0017] 本探針用地高辛標(biāo)記技術(shù)，用化學(xué)方法把類固醇類半抗原地高辛分子連接在加 TP 上(Dig-加 TP);用隨機引物及DNA多聚酶，W探針DNA為模板，合成互補DNA，化學(xué)修飾過的 加 TP同時滲入到標(biāo)記的DNA探針中；雜交后用堿性憐酸酶標(biāo)記的抗地高辛單抗與標(biāo)記探針 DNA中的Dig-加 TP結(jié)合，加入顯色底物，在堿性憐酸酶作用下，轉(zhuǎn)變成藍色的化合物；
[001引3)探針的制備方法：
[0019]隨機引物標(biāo)記的DNA帶有地高辛-11-加 TP，運一標(biāo)記采用的是地高辛高效引物試 劑，運是一種含有隨機六碳糖，dNTP混合物的5 X濃度標(biāo)記混合物，其中dNTP混合物包括堿 性標(biāo)記的地高辛-11-加 TP，標(biāo)記級的Klenow酶和適合的反應(yīng)緩沖液;利用PCR技術(shù)擴增鼠疫 菌PLA基因的特異性片段，進行純化并用roche試劑盒標(biāo)記探針;具體步驟如下：
[0020] a)向一個反應(yīng)管仲中加入化g模板DNA和高壓滅菌的雙蒸水，終體積達l&iL
[0021 ] b)沸水浴10分鐘W變性DM,然后迅速插入冰水混合物中；
[0022] C)充分混合DIG-High Prime,并取化L加入到變性DNA中，混合并簡單離屯、；37°C解 育1小時或者過夜；
[0023] d)65°C加熱10分鐘終止反應(yīng)。
[0024] 所述的基因組DNA酶切條件為37°C，1小時，酶切體系如下：
[0025]
[0026] 所述的轉(zhuǎn)膜為:將酶切好的樣本基因組進行電泳，利用真空累將膠內(nèi)DNA片段轉(zhuǎn)印 到帶有正電荷的尼龍膜上。
[0027] 所述的雜交為:對已標(biāo)記的探針進行變性并將其混入雜交液中，將轉(zhuǎn)印膜放入雜 交液中浸泡地。
[002引所述的洗膜為:用足夠的2XSSC 0.5%SDS連續(xù)振蕩洗涂兩次，每次5分鐘。
[0029] 所述的信號檢測為:對雜交膜進行顯色處理，采用圖像儀曝光后觀察結(jié)果。
[0030] 本發(fā)明的技術(shù)效果是：鼠疫菌具有較強的傳染性，獲得其樣品比較困難，也導(dǎo)致了 其鑒定比較困難。將Southern印記雜交技術(shù)應(yīng)用于鼠疫檢測的研究，在該菌種的研究應(yīng)用 中為首次。依據(jù)鼠疫菌本身的菌種特點，在本發(fā)明中設(shè)計了特異性較強的探針引物，回避掉 在W往PCR研究中采用兩個基因同時檢測確定陽性的問題。同時依據(jù)菌種特點在Southern 印記雜交檢測實驗步驟中對所設(shè)及到的時間、溫度等條件作出了明確的限制。
[0031] 本發(fā)明的應(yīng)用能有效的避免鼠疫菌檢測過程中假陽性的出現(xiàn)，能準(zhǔn)確判斷樣本的 陰陽性，避免傳統(tǒng)方法中的分離培養(yǎng)、鼠疫隧菌體裂解試驗和動物實驗等的繁瑣步驟，能夠 快速、準(zhǔn)確的判斷樣本，可廣泛用于口岸不同媒介生物監(jiān)測點的鼠類樣品檢測。
【附圖說明】
[0032] 圖1本發(fā)明檢測方法技術(shù)路線圖
[0033] 圖2利用特異性引物PCR方法檢測樣本的電泳圖
[0034] 圖3對雜交膜進行顯色處理后采用圖像儀曝光后顯示出的pla雜交片段圖
【具體實施方式】
[0035] 本發(fā)明鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，具體操作步驟如下：
[0036] 一、采用寶生物DNA提取試劑盒(No. 9765)提取鼠肝臟組織獲取總DNA。
[0037] 二、探針引物的制備
[003引 鼠疫菌引物探針序列為自行設(shè)計，通過R0C皿的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Stader Kit II試劑盒進行探針標(biāo)記。采用紫外交聯(lián)儀固定DNA探針，用雜 交檢測方法進行信號檢測，確定探針濃度。
[0039] 鼠疫桿菌有很強的傳染性，能引起烈性傳染病，屬我國法定甲類傳染病之一。鼠疫 在世界歷史上曾有過多次大流行，死亡眾多，曾經(jīng)是危害人類最嚴重的烈性傳染病之一。盡 管人間鼠疫在許多國家現(xiàn)已不再是一個嚴重問題，但一些疫源地還連續(xù)發(fā)現(xiàn)零星暴發(fā)。然 而其病源鑒定比較困難，準(zhǔn)確率不高。然而基因雜交技術(shù)的準(zhǔn)確性非常高。本實驗利用鼠疫 菌的特異性基因，制作特異性探針，利用DNA雜交技術(shù)鑒定病源。即將Southern blot應(yīng)用在 鼠疫菌的檢測鑒定上，將其簡化形成試劑盒的形式，應(yīng)用于邊防檢疫口岸。
[0040] 1)探針序列：
[0041 ] CGATTACTGATGTAATTATGGGGTTTCCGATTGATACGGAGATGGAGAAAGACAGTGAATATTCAAATA AGATCCGCCAGGAAAGTAAAATTTCAAAAACTGAAGGGACCGTGTCTTACGAACAGAAAATAACTGTTGAAACAGGT CAGGAAAAAGACGGTGTGAAAGTCTACCGTGTCATGGTTCTTGAGGGAACGATTGCCGAATCTATTGAACATCTCGA TAAGAAAGAGAACGAAGACATTCTGAATAATAACCGAAATCGCATCGTCCTAGCGGACAACACTGTCATTAACTTTG ACAATATTAGTCAACTGAAGGAATTTTTACGTCGTTCGGTAAATATTGTTGACCACGATATTTTCTCCAGTAATGGT TTTGAAGGGTTTAATCCGACAAGTCATTTTCCGTCTAATCCTAGTAGCGATTATTTTAACAGTACCGGTGTTACATT CGGTTCCGGGGTTGACCTTGGTCAGCGCCAA
[0042] 2)探針的標(biāo)記：
[0043] 本探針用的是地高辛標(biāo)記技術(shù)，用化學(xué)方法把類固醇類半抗原地高辛分子連接在 加 TP上化ig-加 TP)。用隨機引物及DNA多聚酶，W探針DNA為模板，合成互補DNA，化學(xué)修飾過 的加 TP同時滲入到標(biāo)記的DNA探針中。雜交后用堿性憐酸酶標(biāo)記的抗地高辛單抗與標(biāo)記探 針DNA中的Dig-加 TP結(jié)合，加入顯色底物，在堿性憐酸酶作用下，轉(zhuǎn)變成藍色的化合物。
[0044] 3)探針的制備方法：
[0045] 隨機引物標(biāo)記的DNA帶有地高辛-11-加 TP，運一標(biāo)記采用的是地高辛高效引物試 劑，運是一種含有隨機六碳糖，dNTP混合物的5 X濃度標(biāo)記混合物，其中dNTP混合物包括堿 性標(biāo)記的地高辛-11-加 TP，標(biāo)記級的Klenow酶和適合的反應(yīng)緩沖液。利用PCR技術(shù)擴增鼠疫 菌PLA基因的特異性片段，進行純化并用roche試劑念標(biāo)記探針。
[0046]
[0047] S、基因組DNA酶切
[004引對鼠肝臟組織DNA進行酶切，酶切條件為37°C，化，酶切體系如下：
[0049]

[0050] 四、電泳
[0051 ] 對酶切鼠肝臟組織DNA進行電泳：1%濃度瓊脂糖凝膠，100ml TBE buffer中加入 lOiil lOmg/ml漠化乙錠化B)，將凝膠放置其中染色30分鐘，照相。
[00對五、轉(zhuǎn)膜
[0053] 1.將膠裁成9.8cm X 8.0cm大小，于平皿中用蒸饋水沖洗一次；
[0化4] 2.加入100ml 0.25mol/L的鹽酸脫嚷嶺，室溫振蕩15min，至漠酪藍完全變成黃色。
[0055] 3.用蒸饋水沖洗2次。加入變性液（1.5mol/L化Cl、0.5mol/L NaOH)室溫振蕩 30min;至漠酪藍完全恢復(fù)到原來的藍色。
[0056] 4.用蒸饋水沖洗2次。加入中和液（1.5111〇1/1化(：1、1.〇111〇1/1化13-(：1，抑7.4)室 溫振蕩2次，每次15min;
[0057] 5.用蒸饋水沖洗2次。加入2 X SSC平衡凝膠和尼龍膜5min;
[0化引 6、虹吸印記法轉(zhuǎn)膜26小時：
[0059] 1)在方盤上放置平板，其上放置濾紙，濾紙兩端搭入盤內(nèi)浸入2XSSC中，用玻璃棒 趕走濾紙和平板之間的氣泡。
[0060] 2)將凝膠倒置于平臺上，正面朝下，切掉右下角，并用保鮮膜封閉四周W防止吸水 紙接觸凝膠的邊緣從而接觸平板造成液流的短路。
[0061 ] 3)將尼龍膜放于膠上，趕走氣泡。
[0062] 4)膜上放兩張濾紙，其上再放20層吸水紙。
[0063] 5)吸水紙上放一平板，其上放500g左右的重物，目的是建立液體從液池經(jīng)凝膠向 尼龍膜的上行通路，W洗脫凝膠中的DNA并使其聚集到尼龍膜上。
[0064] 6)室溫下過夜轉(zhuǎn)膜，持續(xù)16小時W上，期間換紙2-3次。
[0065] 7)完成轉(zhuǎn)膜后，膠染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。并標(biāo)記好序號、加樣孔位置和對應(yīng)分子量 標(biāo)準(zhǔn)的位置，尼龍膜和凝膠直接接觸的一面為正面。
[0066] 8)用2XSSC漂洗尼龍膜一次，濾紙吸干，紫外交聯(lián)儀下照射固定DNA(500化J/cm2) 5min〇
[0067] 六、雜交
[006引1)預(yù)雜交:取8.0ml 65°C預(yù)熱的Hyb高效雜交液化yb-100)，加入雜交管中，排盡氣 泡，65 °C雜交爐中預(yù)雜交化(8-15轉(zhuǎn)/分）。
[0069] 2)探針變性:將已標(biāo)記好的探針沸水浴中變性10分鐘，立即放冰水浴冷卻1 Omin。
[0070] 3)雜交:排盡預(yù)雜交液，在8.0ml新Hyb高效雜交液化yb-100)加入4.化1新變性好 的探針，混勻。65 °C雜交儀中雜交過夜。
[0071] 屯、洗膜、信號檢測
[0072] l)雜交后室溫下，20mL2XSSC/0.1%SDS洗膜2X5min。
[0073] 2)50°C，20mL0.1 XSSC/0.1 %SDS洗涂2X 15min。（洗液需要先預(yù)熱到50°C)
[0074] 3)再將膜置于20mL洗涂緩沖液中平衡2-5min。
[0075] 4)將膜在lOmL阻斷液中阻斷30min(在搖床上輕輕搖動）。
[0076] 5)封閉完成后倒出阻斷液，加入稀釋好的lOmL抗體溶液，浸膜至少30min。
[0077] 6)去除抗體溶液，用20mL洗涂緩沖液緩慢洗膜2次，每次15min。
[0078] 7)去除洗涂緩沖液，在20mL檢測液中平衡膜2次，每次2min。
[0079] 8)用檢測緩沖液稀釋30化L NBT/BCIP化學(xué)顯色底物，在約15mL新鮮制備的顯色
[0080] 液中反應(yīng)顯色，在顯色過程中勿搖動。
[0081 ] 9)當(dāng)達到所需的點或帶強度后，用50ml雙蒸水或TE緩沖液洗涂5min終止反應(yīng)，照 相記錄結(jié)果。
[0082] 本發(fā)明應(yīng)用Southern印記雜交技術(shù)對鼠疫菌的檢測方法進行了如下實驗研究并 取得意想不到的效果。
[0083] 1.鼠疫菌特異性基因 Pla的引物設(shè)計及鑒定，實驗通過NCBI查閱鼠疫菌特異基因 Pla的序列，設(shè)計引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR反應(yīng))從去毒的鼠疫菌基因組片段質(zhì)粒（中國 檢驗檢疫科學(xué)研究院贈送)上擴增基因 Pla的部分序列并測序。
[0084] Pla引物序列表格 「00851
[0086] 2.初步鑒定樣本的有效性，利用上述引物PCR方法檢測實際樣本，觀察是否有特異 性條帶的出現(xiàn)，初步對所得樣本的有效性進行判斷。驗證結(jié)果電泳圖片結(jié)果顯示如圖2所 /J、- 〇
[0087] 3. Southern印記實驗的簡單過程和圖片結(jié)果，利用上述特異性引物從去毒的鼠疫 菌基因組片段質(zhì)粒（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院贈送)上擴增鼠疫菌特異基因 Pla的部分序 列，純化產(chǎn)物，并用地高辛標(biāo)記此片段制備雜交探針，利用DNA雜交技術(shù)使探針與所收集樣 本中的特異性序列結(jié)合并顯色，從而對所得樣本做有效性判斷。實驗步驟及結(jié)果如下：
[00則 （1)測定樣本模板濃度:DNA濃度用紫外分光光度計測定，核酸的光吸收值位于波 長260nm處，蛋白質(zhì)則位于280nm，分別測定后，其0D260/0D280的比值應(yīng)大于1.8.低于此值， 說明DNA中仍殘留較多的蛋白質(zhì)，此時可用酪、氯仿繼續(xù)抽提純化。若比值大于1.9表明DNA 鏈破壞，斷裂嚴重，已成為小分子，因此操作應(yīng)輕柔。
[0089] (2)基因組DNA酶切：限制性內(nèi)切酶(RE)可裂解雙鏈DNA，每種酶的特點是具有高度 特異性的DNA裂解點和不同電離子強度的特殊反應(yīng)條件。單位(U)RE活性是在37°C1小時內(nèi) 能將化g DNA所有特異性位點切斷的酶用量。若用兩種W上不同的內(nèi)切酶，要注意RE的最適 鹽濃度，要由低向高逐級添加適量鹽逐個進行DNA切割。
[0090] (3)探針的制備:采用Dig-加 TP在Klenow酶的作用下，經(jīng)隨機引物引物PCR擴增可 滲入到新合成的DNA分子中，從而完成DNA探針的標(biāo)記。
[0091] (4)轉(zhuǎn)膜，將酶切好的樣本基因組進行電泳，利用真空累將膠內(nèi)DNA片段轉(zhuǎn)印到帶 有正電荷的尼龍膜上。
[0092] (5)雜交，對已標(biāo)記的探針進行變性并將其混入雜交液中，將轉(zhuǎn)印膜放入雜交液中 浸泡地。
[0093] (6)洗膜，用足夠的2XSSC 0.5%SDS連續(xù)振蕩洗涂兩次，每次5分鐘。
[0094] (7)信號檢測，對雜交膜進行顯色處理，采用圖像儀曝光后觀察結(jié)果。所得實驗結(jié) 果見圖3。
[00M]從W上Southern印記雜交實驗結(jié)果可見，目前的實驗基礎(chǔ)初步確定了本方法在鼠 疫Southern印記雜交檢測中的方法具有可行性和有效性。
【主權(quán)項】
1. 鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，其特征在于:包括以下步驟：鼠肝臟DNA的獲取， 探針引物的制備，基因組DNA酶切，酶切產(chǎn)物的電泳，轉(zhuǎn)膜，雜交和洗膜、信號檢測。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，其特征在于:探針引物的 制備:實驗通過NCBI查閱鼠疫菌特異基因Pla的序列，設(shè)計引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)從去毒 的鼠疫菌基因組片段質(zhì)粒上擴增基因 Pla的部分序列并測序;采用Dig-dUTP在Klenow酶的 作用下，經(jīng)隨機引物PCR擴增可摻入到新合成的DNA分子中，從而完成DNA探針的標(biāo)記。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，其特征在于:所述的 探針引物的具體制備方法為： 1) 探針序列：2) 探針的標(biāo)記： 本探針用地高辛標(biāo)記技術(shù)，用化學(xué)方法把類固醇類半抗原地高辛分子連接在dUTP上 (Dig-dUTP);用隨機引物及DNA多聚酶，以探針DNA為模板，合成互補DNA，化學(xué)修飾過的dUTP 同時摻入到標(biāo)記的DNA探針中；雜交后用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛單抗與標(biāo)記探針DNA中 的Dig-dUTP結(jié)合，加入顯色底物，在堿性磷酸酶作用下，轉(zhuǎn)變成藍色的化合物； 3) 探針的制備方法： 隨機引物標(biāo)記的DNA帶有地高辛-11-dUTP，這一標(biāo)記采用的是地高辛高效引物試劑， 這是一種含有隨機六碳糖，dNTP混合物的5 X濃度標(biāo)記混合物，其中dNTP混合物包括堿性標(biāo) 記的地高辛-11-dUTP，標(biāo)記級的K1 enow酶和適合的反應(yīng)緩沖液；利用PCR技術(shù)擴增鼠疫菌 PLA基因的特異性片段，進行純化并用roche試劑盒標(biāo)記探針;具體步驟如下： a) 向一個反應(yīng)管仲中加入lyg模板DNA和高壓滅菌的雙蒸水，終體積達16yL; b) 沸水浴10分鐘以變性DNA，然后迅速插入冰水混合物中； c) 充分混合DIG-High Prime，并取4yL加入到變性DNA中，混合并簡單離心；37°C孵育1 小時或者過夜； d) 65°C加熱10分鐘終止反應(yīng)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，其特征在于:所述的基因 組DNA酶切條件為37°C，1小時，酶切體系如下： 組份 加量 IQxburter 4,5卩1 HindHI 內(nèi)切酶 65yl 樣品 DNA 25 ng ddH20 補足水至45pU于37°C水浴中酶切20h。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，其特征在于:所述的轉(zhuǎn)膜 為:將酶切好的樣本基因組進行電泳，利用真空栗將膠內(nèi)DNA片段轉(zhuǎn)印到帶有正電荷的尼龍 膜上。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，其特征在于:所述的雜交 為:對已標(biāo)記的探針進行變性并將其混入雜交液中，將轉(zhuǎn)印膜放入雜交液中浸泡4h。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，其特征在于:所述的洗膜 為:用足夠的2 X SSC 0.5%SDS連續(xù)振蕩洗滌兩次，每次5分鐘。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，其特征在于:所述的信號 檢測為:對雜交膜進行顯色處理，采用圖像儀曝光后觀察結(jié)果。9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，其特征在于:所述的基因 組DNA酶切條件為37°C，1小時，酶切體系如下： 組份 加量 1.0.x.buffer_ 4,5 (il HindHI 內(nèi)切酶 6,5 ii 1 〇 樣品 DNA 25 W g ddH20 補足水至45wl，于37SC水浴中酶切20h10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的鼠疫菌Southern印記雜交檢測方法，其特征在于:所述的轉(zhuǎn) 膜為:將酶切好的樣本基因組進行電泳，利用真空栗將膠內(nèi)DNA片段轉(zhuǎn)印到帶有正電荷的尼 龍膜上。
【文檔編號】C12Q1/04GK106047995SQ201610331104
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】靳木子, 郝廣福, 邰大鵬, 王莉娜, 云托婭, 白瀟
【申請人】靳木子