一種醇脫氫酶的高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種醇脫氫酶的高通量篩選方法。提供了一種利用脂肪族或芳基取代的酮與2,4?二硝基苯肼在堿性條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)，并在96孔板中建立了針對脂肪族或芳基取代的酮醇脫氫酶的高通量篩選方法。本發(fā)明使用深孔板進(jìn)行微型化細(xì)胞培養(yǎng)，不需要對細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，突破了傳統(tǒng)通過檢測額外添加的昂貴輔酶NAD(P)H吸光度變化的篩選方式，具有成本低廉，操作簡便，反應(yīng)靈敏，檢測準(zhǔn)確，對設(shè)備要求低，通用性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠快速對檢測整細(xì)胞樣品中醇脫氫酶的活性和反應(yīng)轉(zhuǎn)化率進(jìn)行測定。CCTCC NO: M201138520111111
【專利說明】
-種醇脫氨酶的高通量篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種酶的篩選方法，特別設(shè)及一種醇脫氨酶的高通量篩選方法，屬于 生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性醇是公認(rèn)的有機(jī)合成中非常重要且應(yīng)用廣泛的中間體，許多藥物都W手性醇 為主要擱塊單元，例如抗組胺藥物苯橫酸貝他斯汀，降血脂藥立普妥和抗血小板凝集素氯 化格雷等。不對稱還原前手性幾基化合物合成手性醇是原子經(jīng)濟(jì)性最高、最具應(yīng)用開發(fā)潛 力的策略。
[0003] 醇脫氨酶(Alcohol dehy化ogenase，簡稱ADH)是生物體內(nèi)重要的氧化還原酶，能 夠可逆地催化幾基基團(tuán)的還原和徑基基團(tuán)的氧化，在生物催化和生物醫(yī)藥領(lǐng)域都有廣泛地 應(yīng)用。醇脫氨酶可催化幾基還原，合成對應(yīng)的醇，特別是立體選擇性地合成手性醇類化合 物。
[0004] 許多天然醇脫氨酶在工業(yè)化生產(chǎn)過程中存在成本高、活性低、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，審U 約了醇脫氨酶在規(guī)模化生產(chǎn)中的應(yīng)用。隨著基因工程和蛋白質(zhì)工程的不斷發(fā)展，可W對醇 脫氨酶的活性、對映體選擇性、穩(wěn)定性等進(jìn)行改造，獲得性能優(yōu)良的突變株，使其更適用于 工業(yè)化生產(chǎn)的要求。常用的高通量篩選醇脫氨酶方法是監(jiān)測反應(yīng)體系在340nm波長下吸光 值的變化，原理在于脫氨酶依賴于輔酶NAD(P化提供還原力，而NAD(P化在340nm處有特征吸 收峰。運(yùn)一檢測方法需要對細(xì)胞進(jìn)行凍融、溶菌酶破壁或超聲破碎處理等W使胞內(nèi)的酶釋 放;測定過程需要消耗價(jià)格昂貴的輔酶；由于運(yùn)是一種對底物消耗的間接的測定方法，在對 于NADH依賴型的醇脫氨酶篩選過程中，通常因具有較高的本底消耗而導(dǎo)致篩選過程出現(xiàn)假 陽性。因此常見的醇脫氨酶高通量篩選方法存在費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜、不適用于整細(xì)胞篩選 和背景干擾較大等缺點(diǎn)。
[0005] 脂肪族或芳基取代的酬含有的幾基能夠與2,4-二硝基苯阱反應(yīng)生成對應(yīng)的2,4- 二硝基苯腺，在堿性環(huán)境下呈紅至紅棟色。利用醇脫氨酶可催化脂肪族或芳基取代酬的還 原，通過測定反應(yīng)體系中殘余酬的含量計(jì)算被醇脫氨酶還原的酬的量，從而獲得醇脫氨酶 的催化活力（附圖1)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有醇脫氨酶篩選過程中存在的輔酶成本高、背景干擾 大和不適用于整細(xì)胞篩選等缺點(diǎn)。
[0007] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[000引本發(fā)明提供了一種醇脫氨酶的高通量篩選方法，運(yùn)是一種基于深孔板的微型化培 養(yǎng)及基于脂肪族或芳基取代的酬與幾基檢測試劑2,4-二硝基苯阱偶聯(lián)顯色的篩選方法。具 體方法如下：
[0009]將含有醇脫氨酶基因的大腸桿菌的單菌落稀釋后接種于裝有液體培養(yǎng)基的深孔 板中，于30~40°C下，100~15化pm的搖床中培養(yǎng)6~12h;然后轉(zhuǎn)接至新的含有培養(yǎng)基的深 孔板中，于30~40°C下，100~15化pm的搖床中培養(yǎng)1~化，加入終濃度為0.2mM IPTG(異丙 基-e-D硫代化喃半乳糖巧），于20~30°C，100~15化pm的搖床中繼續(xù)培養(yǎng)5~lOh;將深孔板 低溫離屯、后去除上清液，加入50~2(K)化含有脂肪族或芳基取代的酬、葡萄糖及葡萄糖脫氨 酶的緩沖液重新懸浮細(xì)胞，之后在30~40°C下，100~15化pm的搖床中反應(yīng)10~60min;將2， 4-二硝基苯阱溶液加入酶促反應(yīng)液中顯色5~30min，再加入K0H或NaO田容液顯色，測定特征 吸收波長下吸光值，W未加入細(xì)胞或酶液的樣本作為陰性對照，吸光值與陰性對照組相差 越大即表示脫氨酶的活力越高。
[0010] 本發(fā)明中所使用的顯色試劑2,4-二硝基苯阱為一種幾基檢測試劑，可W與含有幾 基的脂肪族或芳基取代的酬反應(yīng)生成對應(yīng)的苯腺化合物，并在堿性條件下顯示紅至紅棟 色，該物質(zhì)在500~550nm下有特征吸收峰。本方法即是通過測定酶促反應(yīng)體系中殘余的脂 肪族或芳基取代的酬與2,4-二硝基苯阱反應(yīng)后在堿性環(huán)境下形成的紅至紅棟色化合物完 成高通量篩選，本發(fā)明所述方法可W快速鑒定待篩選微生物菌株或脫氨酶的活性。
[0011] 本發(fā)明方法可用于未知樣品中醇脫氨酶的篩選，待測樣品為微生物或酶液。醇脫 氨酶的單克隆菌落，來源于對原始基因序列進(jìn)行人工突變后或隨機(jī)突變獲得的單克隆菌落 的突變體，或未經(jīng)突變的含醇脫氨酶的菌落。
[0012] 本發(fā)明也可用于已知微生物或酶液可催化還原脂肪族或芳基取代的酬底物譜的 鑒定。
[0013] 所述培養(yǎng)基為:膜蛋白腺lOg/L，酵母提取物5g/L，氯化鋼lOg/L，自然抑，12rc滅 菌20min。
[0014] 所述的深孔板可W是6孔板、12孔板、48孔板、96孔板。深孔板=明治蓋從上之下依 次由帶孔不誘鋼蓋、除菌微濾膜片和硅膠孔墊=層組成，不誘鋼蓋及硅膠孔墊的孔與深孔 板的深孔對應(yīng)，W保證各微孔獨(dú)立地與外界交換空氣。深孔板中培養(yǎng)基裝液量為深孔板孔 容積的10~30 %。
[0015] 所述酬為脂肪族或芳基取代的酬，其中優(yōu)選為下列之一 :4-氯苯基-化晚-2-基-甲 酬、二苯酬、苯基苯乙酬、4-氯二苯甲酬、2,4'-二氯二苯甲酬、3,4'-二氯二苯甲酬、4,4'-二 氯二苯甲酬、苯甲酬、4-氯苯乙酬、4-氨基苯乙酬、2-糞乙酬、2-下酬、2,3-下二酬、2,3-戊二 酬、2,3-己二酬、2,5-己二酬。
[0016]所述緩沖液為抑5.0~9.0的憐酸氨二鐘-憐酸二氨鐘緩沖液，其中優(yōu)選為pH6.5 ~7.0的。
[0017] 所述2，4-二硝基苯阱溶液的濃度為1~5 %的硫酸或鹽酸溶液，其中2，4-二硝基苯 阱的濃度為2~20mM。
[0018] 所述堿液為K0H或NaOH，所述堿液的濃度為0.5~2.5M。
[0019] 底物與產(chǎn)物的具體分析條件為：使用Daicel Chiralcel 0B-H(5wii，250mmX 4.6mm)液相色譜柱，流動(dòng)相為正己燒:異丙醇(90:10，v/v)。流速ImL/min，柱溫30°C，紫外檢 測波長254nm，進(jìn)樣量5~15化.
[0020] 篩選效果的判斷：（1)初篩:未加入細(xì)胞或酶液的樣本的陰性對照組顏色為紅至紅 棟色，加入含醇脫氨酶細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系的顏色為棟黃至淺黃色，篩選出 比對照顏色淺的含醇脫氨酶細(xì)胞或酶液。（2)復(fù)篩:在初篩獲得的含醇脫氨酶細(xì)胞中，選出 單位時(shí)間內(nèi)在對應(yīng)苯腺化合物最大吸收波長下吸光度變化量最大的醇脫氨酶的細(xì)胞或酶 液。
[0021 ]本發(fā)明的積極效果在于：（1)使用深孔板進(jìn)行微型化培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了高通量培養(yǎng)和篩 選；（2)突破了傳統(tǒng)通過檢測額外添加的昂貴輔酶NAD(P)H吸光度變化的篩選方式，具有成 本低廉，操作簡便，反應(yīng)靈敏，檢測快速準(zhǔn)確，背景干擾低和對設(shè)備要求低；（3)同時(shí)適用于 酶液和細(xì)胞體系的高通量篩選，通用性強(qiáng)，能夠快速對檢測細(xì)胞或酶液樣品中醇脫氨酶的 活性進(jìn)行測定，為醇脫氨酶的高通量篩選提供了便利。
【附圖說明】
[0022] 圖1顯色法醇脫氨酶高通量篩選的原理示意圖
[0023] 圖2酶促反應(yīng)體系各成分全波長掃描圖；
[0024] 圖3 4-氯苯基-化晚-2-基-甲酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0025] 圖4二苯基甲酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[00%]圖5苯基苯乙酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0027]圖6 4-氯二苯基甲酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[002引圖7 2,4'-二氯二苯基甲酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[00巧]圖8 3,4'-二氯二苯基甲酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0030] 圖9 4,4'-二氯二苯基甲酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0031] 圖10苯乙酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0032] 圖11 4-氯苯乙酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0033] 圖12 4-氨基苯乙酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0034] 圖13 2-糞乙酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0035] 圖14 2-下酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0036] 圖15 2,3-下二酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0037] 圖16 2,3-戊二酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[003引圖17 2,3-己二酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0039] 圖18 2,3-己二酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0040] 圖19顯色法和液相法測得的酶促反應(yīng)過程反應(yīng)體系中殘余4-氯苯基-化晚-2-基- 甲酬濃度的比較；
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于此： 實(shí)施例1:W含有還原4-氯苯基-化晚-2-基-甲酬脫氨酶的微生物為例，對酶促反應(yīng)體系中 各成分與2,4-二硝基苯阱生成的紅至紅棟色苯腺化合物進(jìn)行全波長掃描
[0042] 為了準(zhǔn)確測定酬與2,4-二硝基苯阱生成的紅至紅棟色苯腺化合物的含量，本發(fā)明 分別測定了反應(yīng)體系中各種化合物與2,4-二硝基苯阱的特征吸收波長。具體操作方法是將 4-氯苯基-化晚-2-基-甲酬(CPMK)，葡萄糖，葡萄糖酸-丫-內(nèi)醋，4-氯苯基-化晚-2-基-甲 醇(CPMA)，葡萄糖脫氨酶和NADPH等配制成濃度為0.5mM的溶液或按反應(yīng)需求量添加，吸取 100化于2mL的EP管中，加入10化L 2，4-二硝基苯阱溶液(20mM，含0.3 %硫酸），在搖床中30 °C，120巧m反應(yīng)30min后加入ImL KOH溶液（1. OM)和0.8mL去離子水。使用酶標(biāo)儀對樣品在 300~7(K)nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光吸收掃描。全波長掃描圖見圖2,可見CPMK與顯色劑2,4-二硝 基苯阱反應(yīng)后在堿性條件下生成的紅棟色化合物在500nm波長處有特征吸收峰，葡萄糖，葡 萄糖酸-丫-內(nèi)醋，CPMA，葡萄糖脫氨酶和NADPH等不能與顯色劑2,4-二硝基苯阱反應(yīng)，因此 選擇500nm為測量波長。實(shí)施例3:顯色法測定幾種脂肪族或芳基取代的酬的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法
[0043] 配制0.5~5mM的CPMK、二苯酬、苯基苯乙酬、4-氯二苯基甲酬、2，4 ' -二氯二苯基甲 酬、3,4'-二氯二苯基甲酬、4,4'-二氯二苯基甲酬、苯乙酬、4-氯苯乙酬、4-氨基苯乙酬、2- 糞乙酬、2-下酬、2，3-下二酬、2，3-戊二酬、2，3-己二酬、2，5-己二酬溶液，依次吸取10化L的 溶液加入2血的EP管中，加入10化L 2，4-二硝基苯阱溶液(20mM，含0.3 %硫酸），在搖床中30 °C，120巧m反應(yīng)30min后加入ImL K0H溶液（1.0M)和0.8mL去離子水，測定十六種酬樣品在 500nm處的吸光值的高低，繪制不同濃度的酬與吸光值的線性關(guān)系（附圖3~17)。可見到所 測幾種脂肪族或芳基取代的酬在一定濃度范圍內(nèi)與500nm波長吸光值之間具有良好的線性 關(guān)系，符合朗伯-比爾定律。
[0044] 實(shí)施例4:顯色法和液相檢測方法一致性的比較
[0045] 實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株Kluyveromyces SP.CCTCC 12011385(保藏于中國典型培養(yǎng)物 保藏中屯、(CCTCC)，地址：中國，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號NO. :M2011385，保藏日期： 2011年11月11日）是已證實(shí)含有醇脫氨酶的菌株。W終濃度2mM CPMK為底物，2.5mM葡萄糖 為輔底物溶于pH 7.0的憐酸二氨鐘-憐酸氨二鐘緩沖液（lOmL，lOOmM)，加入Kluyveromyces SP.CCTCC M2011385濕細(xì)胞(0.2g/10mL)，每隔20min取樣 100化，加入 100化 2,4-二硝基苯 阱溶液（20mM，含0.3 %硫酸），在搖床中30 °C，120rpm反應(yīng)30min后加入ImL K0H溶液（1.0M) 和0.8mL去離子水，測定運(yùn)些樣品在500皿處的吸光值。根據(jù)CPMK濃度與500皿波長吸光值之 間的線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶促反應(yīng)體系中殘余CPMK濃度，同時(shí)通過液相色譜法測定同 一樣品中CPMK的濃度，具體分析條件為：使用Daicel畑iralcel 0B-H(5wii，250mmX 4.6mm)液相色譜柱，流動(dòng)相為正己燒:異丙醇(90:10，v/v)。流速ImL/min，柱溫30°C，紫外檢 測波長254nm，進(jìn)樣量10化，驗(yàn)證顯色法與HPLC方法的一致性。由圖18可見兩種檢測方法數(shù) 據(jù)具有較高的吻合度。
[0046] 實(shí)施例5:產(chǎn)CPMK還原活性醇脫氨酶的微生物的篩選
[0047] 取一 96孔深孔板，每孔容積2.5mL，每孔加入40化L培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為:膜蛋白 腺lOg/L，酵母提取物5g/L，氯化鋼10g/L，12rC滅菌20min，待冷卻后加入終濃度為50iig/mL 硫酸卡那霉素。挑取含有醇脫氨酶的大腸桿菌單菌落接種于深孔液體培養(yǎng)基中，其中1#菌 株為原始菌株，于37°C下，120rpm的搖床中培養(yǎng)12h;然后轉(zhuǎn)接至新的含有培養(yǎng)基的深孔板 中，于37°C下，120rpm的搖床中培養(yǎng)化，加入終濃度為0.2mM IPTG(異丙基-0-D硫代化喃半 乳糖巧），于30°C，120rpm的搖床中繼續(xù)培養(yǎng)化;將深孔板低溫離屯、后去除上清液，加入10化 L含有CPMK(2. OmM)、葡萄糖(2.5mM)的緩沖液重新懸浮細(xì)胞，之后在30°C下，120巧m的搖床 中反應(yīng)30min;將10化L 2，4-二硝基苯阱溶液(20mM，含0.3 %硫酸)加入酶促反應(yīng)液中顯色 30min，再加入1血K0田容液（1.0M)顯色和8(K)化去離子水，測定500皿波長的吸光值。W未加 入細(xì)胞或酶液的樣本作為陰性對照，獲得與陰性對照500nm波長吸光值相差最大的實(shí)驗(yàn)組， 對應(yīng)編號分別為2#，36#，69#，它們與陰性對照組在500nm波長吸光值分別為：
[004引表1顯色法篩選醇脫氨酶產(chǎn)生菌結(jié)果
[0化0] 通過w上檢測結(jié)果，計(jì)算出1#原始菌株每克濕細(xì)胞酶活為95.6U，2#，36#，69#菌株 每克濕細(xì)胞酶活分別為180U，160U和220U，分別是原始對照菌株酶活的1.88倍，1.67倍和 2.30 倍。
[0化1 ] 實(shí)施例6:顯色法測定產(chǎn)醇脫氨酶微生物的底物譜
[0化2] 使用實(shí)驗(yàn)室保藏的醇脫氨酶的產(chǎn)生菌Kluyveromyces SP.CCTCC M2011385,分別 W終濃度2mM 2-下酬、苯乙酬、4-氯苯乙酬、4-氨基苯乙酬、2，3-下二酬、2，3-己二酬、2，3- 戊二酬、2,5-己二酬、2-糞乙酬、2,4'-二氯二苯基甲酬、苯基苯乙酬、4-氯二苯基甲酬、二 苯基酬、4，4 二氯二苯基甲酬、3，4 二氯二苯基甲酬、4-氯苯基-化晚-2-基-甲酬溶液為 底物，2.5mM葡萄糖為輔底物溶于抑7.0的憐酸二氨鐘-憐酸氨二鐘緩沖液（lOmL，lOOmM)， 加入Kluyveromyces SP.CCTCC M2011385濕細(xì)胞（0.2g/10mL)，在搖床中30°C，120巧m反應(yīng) 30min后將10化L 2,4-二硝基苯阱溶液(20mM，含0.3%硫酸)加入酶促反應(yīng)液中顯色30min， 再加入ImL K0田容液（1.0M)顯色和80化L去離子水，測定500nm波長吸光值，根據(jù)所測定十六 種脂肪族或芳基取代的酬濃度與50化m波長吸光值之間的線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶促反 應(yīng)體系中殘余脂肪族或芳基取代的酬濃度，從而得到Kluyveromyces sp. CCTCC M2011385 濕細(xì)胞還原十六種脂肪族或芳基取代酬的底物特異性。
[0053]表2Kluyveromyces SP.CCTCC M2011385濕細(xì)胞的底物特異性
[0化4]
[0055] 通過W上分析結(jié)果顯示，Kluyveromyces sp.CCTCC M2011385的醇脫氨酶對芳基 取代的酬具有較高的催化活性。
[0056] 上述結(jié)果表明，該顯色法可W適用于整細(xì)胞水平的高通量篩選和酶的表征。
[0057] 應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W對本發(fā)明做各種 改動(dòng)或修改，運(yùn)些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種醇脫氫酶的高通量篩選方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行： (1) 將含有醇脫氫酶產(chǎn)生菌接種于裝有液體培養(yǎng)基的深孔板中，在搖床中進(jìn)行液體發(fā) 酵培養(yǎng)； (2) 離心去除上清，獲得濕細(xì)胞，加入含有脂肪族或芳基取代的酮、葡萄糖及葡萄糖脫 氫酶的緩沖液在搖床中進(jìn)行酶促反應(yīng)； (3) 反應(yīng)結(jié)束后加入2,4_二硝基苯肼溶液，使酶促反應(yīng)體系中殘余脂肪族或芳基取代 的酮與2，4-二硝基苯肼充分反應(yīng)，生成對應(yīng)的苯腙化合物； (4) 加入KOH或NaOH溶液提供堿性環(huán)境，脂肪族或芳基取代的酮與2,4_二硝基苯肼反應(yīng) 所生成的苯腙化合物顯示紅至紅棕色，使用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)測定特征吸收波長下樣品 的吸光值，將未加入細(xì)胞或酶液的樣本作為陰性對照，按照之前所述相同條件下反應(yīng)，篩選 出特征吸收波長下吸光值較陰性對照低的菌株或酶液，完成初篩； (5) 將初篩所得到的菌株或酶液加入含有不同脂肪族或芳基取代的酮的緩沖液進(jìn)行反 應(yīng)，以未加入細(xì)胞或酶液的樣本作為陰性對照，復(fù)篩出單位時(shí)間內(nèi)特征吸收波長下吸光值 變化大的菌株，即為高酶活的醇脫氫酶菌株或酶液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醇脫氫酶高通量篩選方法，其特征在于初篩時(shí)2,4_二硝基苯 肼溶液的濃度為1 %~5 %的硫酸或鹽酸溶液，其中2，4-二硝基苯肼的濃度為2~20mM，并于 20~50°C和100~150r/min振蕩條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)5~30min。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醇脫氫酶高通量篩選方法，其特征在于初篩時(shí)KOH或NaOH溶液 添加量為〇. 5~2.5M，于20~50°C和100~150r/min振蕩條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)5~30min。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醇脫氫酶高通量篩選方法，其特征在于所用酶促反應(yīng)體系緩 沖液為pH 5.0~8.0的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液，脂肪族或芳基取代酮底物的終濃度 為1~50mM，葡萄糖終濃度為1~50mM，葡萄糖脫氫酶為1~10kU/L于20~50°C和120r/min振 蕩進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)10~60min。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的醇脫氫酶高通量篩選方法，其特征在于所述的脂肪族或芳基 取代酮底物通式為：式中：Ri為苯基、對氯苯基、苯甲基、萘基;R2為2-吡啶、苯基、甲基、乙基、臨氯苯基間氯 苯基、對氯苯基、乙?；?、丙酰基、丁?；?。
【文檔編號】C12Q1/32GK106047985SQ201610374447
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】倪曄, 許國超, 周婕妤, 韓瑞枝, 董晉軍
【申請人】江南大學(xué)