一種蘭州百合pr1基因定量檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】一種蘭州百合病程相關(guān)蛋白PR1基因定量檢測(cè)的試劑盒及其檢測(cè)方法，試劑盒主要包括特異性引物、第一鏈cDNAs合成試劑、熒光定量PCR反應(yīng)試劑以及陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品；特異性引物由蘭州百合PR1基因和內(nèi)參18S rRNA基因的特異性引物組成；陽性對(duì)照品為蘭州百合PR1基因標(biāo)準(zhǔn)品以及內(nèi)參18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品；陰性對(duì)照品為DEPC水；本發(fā)明針對(duì)蘭州百合PR1基因提供了一種快速、敏感、特異的定量檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，為蘭州百合PR1基因的表達(dá)及檢測(cè)診斷提供了技術(shù)支持。
【專利說明】
-種蘭州百合PR1基因定量檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種蘭州百合病程相關(guān)蛋白PR1基因定量檢測(cè)的試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 百合是一種集觀賞、食用和藥用于一體的重要經(jīng)濟(jì)作物，長(zhǎng)期無性繁殖使病毒不 斷積累，嚴(yán)重影響了產(chǎn)量和品質(zhì)；其中百合斑駁病毒(LMoV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和百合隱 癥病毒化SV)是最常見的S種病毒，感染率高達(dá)70%;病毒病造成百合種源嚴(yán)重退化，已是制 約百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素，如何對(duì)病毒實(shí)現(xiàn)有效防治是百合產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展急需解決的關(guān) 鍵問題；目前，百合病毒防治技術(shù)非常落后，病毒防治主要采用殺滅傳播介體曬蟲的方法， 盡管能一定程度阻止病毒傳播，然而已侵染的病毒仍會(huì)在百合上復(fù)制增殖;百合作為世界 著名的球根花弁，至今還未開發(fā)出有效的百合病毒抑制劑，關(guān)于病毒抑制劑抗百合病毒作 用機(jī)制的研究鮮有報(bào)道，使得現(xiàn)階段對(duì)百合病毒病的防治非常盲目。
[0003] 通常病毒抑制劑抗植物病毒的作用方式有:抑制病毒侵染、抑制病毒增殖或誘導(dǎo) 寄主產(chǎn)生抗性;誘導(dǎo)抗性作為一種有效的抗病手段，已在許多病害體系中得到應(yīng)用，已有研 究發(fā)現(xiàn)，某些病毒抑制劑可W誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)，提高寄主對(duì)病毒的抵抗力;江山等 ( 1996)發(fā)現(xiàn)病毒抑制劑可W誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins，PRs);PRs是植物體內(nèi)的一類蛋白質(zhì)，受病原體或其他外界因子的脅迫而誘導(dǎo)表 達(dá)，在植物抵御疾病、響應(yīng)外界壓力W及適應(yīng)不良環(huán)境方面發(fā)揮著重要作用;根據(jù)病程相關(guān) 蛋白家族成員的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能等特點(diǎn)，將其分為17類，即PR1~PR17,其中 PR1被證實(shí)具有抗病毒擴(kuò)散、限制真菌入侵和保護(hù)植物抵御逆境脅迫等功能;如在PRla轉(zhuǎn)基 因煙草研究中發(fā)現(xiàn)，PR1基因 W組成型高效表達(dá)，導(dǎo)致煙草增加了對(duì)巧巾卵菌侵染的耐受 性;也有研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)辣椒PR1蛋白基因的煙草，表現(xiàn)出對(duì)重金屬脅迫的抗性增強(qiáng)，同時(shí)也對(duì) 卵菌病原物W及細(xì)菌性病原物等多種病原菌的抗性增強(qiáng)；目前已經(jīng)從多種植物中發(fā)現(xiàn)了 PR1蛋白，例如葡萄、煙草、番茄等;通常，PRs蛋白在健康植株中表現(xiàn)微弱，當(dāng)被不同的誘導(dǎo) 因子誘導(dǎo)時(shí)迅速產(chǎn)生并積累，其與植物誘導(dǎo)抗性之間有密切的關(guān)聯(lián)；因而研究病毒抑制劑 對(duì)PRs蛋白的誘導(dǎo)能力，是了解抗病毒制劑對(duì)植物是否具有誘導(dǎo)抗性作用的一個(gè)重要內(nèi)容。
[0004] 在我們對(duì)百合抗病毒技術(shù)的開發(fā)研究中，初步篩選了2種適用于大田的百合病毒 抑制劑，其對(duì)蘭州百合主要病毒CMV的復(fù)制均有較好的抑制作用；同時(shí)，從病毒感染的蘭州 百合植株中也檢測(cè)到了 PR1基因的表達(dá);為了進(jìn)一步明確病毒抑制劑對(duì)PR1基因表達(dá)的影 響，本研究建立了一種蘭州百合病程相關(guān)蛋白PR1基因定量檢測(cè)的試劑盒及檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種蘭州百合PR1基因定量檢測(cè)的試劑盒及檢測(cè)方法。
[0006] 技術(shù)方案如下： 一種蘭州百合PR1基因定量檢測(cè)的試劑盒，主要包括特異性引物、第一鏈cDNAs合成試 劑W及巧光定量PCR反應(yīng)試劑，特異性引物由蘭州百合PR1基因和內(nèi)參18S rRNA基因的特異 性引物組成，特異性引物的序列如下： 蘭州百合PR1 基因上游引物Pl:5'- GCCACTACACGCAGGTTGTG -3' 蘭州百合PR1 基因下游引物P2:5' -GCCTCTCGCCGACGTAATTC -3' 內(nèi)參 18S rRNA基因上游引物P3:5'- GGGGAAACTTACCAGGTCCA -3' 內(nèi)參 18S rRNA基因下游引物P4:5' -CAGACAAATCGCTCCACCAA -3' 其中，擴(kuò)增蘭州百合PR1基因的片段長(zhǎng)度為126bp，擴(kuò)增內(nèi)參18S rRNA基因片段長(zhǎng)度為 mbp。
[0007] 本發(fā)明的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)。
[0008] 為達(dá)到定量檢測(cè)的要求，所述試劑盒還包括陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，陽性對(duì)照 品為蘭州百合PR1基因標(biāo)準(zhǔn)品W及內(nèi)參18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對(duì)照品為DEPC水；陽性對(duì) 照品序列如下： 蘭州百合PR1基因標(biāo)準(zhǔn)品： 邑CC曰Ct曰C曰C邑C曰邑邑tt邑t邑t邑邑C邑邑曰邑C曰CCC邑CC邑曰etc邑邑Ct邑C邑C曰曰邑邑邑t邑邑ttt邑t邑曰C邑邑C邑邑C邑曰 tgtgttc曰tg曰曰ctgc曰曰ct曰eg曰cccgccgggg曰曰tt曰cgtcggcg曰g曰ggc; 內(nèi)參18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品： gggg曰曰曰ett曰CC曰ggtcc曰g曰C曰t曰gt曰曰gg曰ttg曰C曰g曰ctg曰g曰gctctttcttg曰ttet曰tgggtggtg 邑t邑cat邑邑CC邑ttetta邑tt邑邑t邑邑a邑C邑attt邑tet邑。
[0009] 可將上述陽性對(duì)照品序列構(gòu)建到質(zhì)粒載體中，測(cè)定質(zhì)粒濃度后換算為拷貝數(shù)，然 后用雙蒸水將陽性質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，W10倍系列稀釋的質(zhì)粒溶液作為模板進(jìn)行巧光 定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)品Ct值的關(guān)系可繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得待測(cè)樣 品cDNAs的Ct值后，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可獲得待測(cè)樣品起始cDNAs的精確拷貝數(shù)，再經(jīng)過內(nèi)參 校正后最終獲得待測(cè)樣品PR1基因的標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)。
[0010] 本發(fā)明還設(shè)及W上所述的檢測(cè)蘭州百合PR1基因表達(dá)的試劑盒的檢測(cè)方法，其包 括的步驟如下： 步驟① W蘭州百合葉片、莖桿或種球?yàn)榇郎y(cè)樣品，提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)合成 cDNAs； 步驟②巧光定量PCR: W待測(cè)樣品cDNAs作為模板，用檢測(cè)PR1基因表達(dá)的上下游引物、 檢測(cè)內(nèi)參基因18S rRNA表達(dá)的上下游引物分別進(jìn)行巧光定量PCR擴(kuò)增；WDEPC水為陰性對(duì) 照于相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟③數(shù)據(jù)采集與分析:上述步驟②反應(yīng)結(jié)束后，利用計(jì)算機(jī)分析軟件自動(dòng)獲得擴(kuò)增 曲線和溶解曲線，W闊值線剛好超過正常陰性對(duì)照的最高點(diǎn)設(shè)定闊值線，若待測(cè)樣品巧光 增長(zhǎng)曲線超過闊值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且溶解曲線形成單一的溶解峰，則判斷為陽 性。
[0011] 定量檢測(cè)時(shí)，所述檢測(cè)方法同時(shí)W10倍系列稀釋的蘭州百合PR1基因和18S rRNA 基因標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)粒溶液進(jìn)行巧光定量PCR檢測(cè)，分別根據(jù)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值與各標(biāo)準(zhǔn)品Ct值 的關(guān)系繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得待測(cè)樣品cDNAs的Ct值后，對(duì)照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測(cè)樣品 cDNAs中PR1基因和18S rRNA基因的起始模板拷貝數(shù)，按照W下公式得到經(jīng)過內(nèi)參歸一化校 正后的待測(cè)樣品PR1基因的標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)：
其中，所述標(biāo)準(zhǔn)品序列如下： 蘭州百合PR1基因標(biāo)準(zhǔn)品： 邑CC曰Ct曰C曰C邑C曰邑邑tt邑t邑t邑邑C邑邑曰邑C曰CCC邑CC邑曰etc邑邑Ct邑C邑C曰曰邑邑邑t邑邑ttt邑t邑曰C邑邑C邑邑C邑曰 tgtgttc曰tg曰曰ctgc曰曰ct曰eg曰cccgccgggg曰曰tt曰cgtcggcg曰g曰ggc; 內(nèi)參18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品： gggg曰曰曰ett曰CC曰ggtcc曰g曰C曰t曰gt曰曰gg曰ttg曰C曰g曰ctg曰g曰gctctttcttg曰ttet曰tgggtggtg 邑t邑cat邑邑CC邑ttetta邑tt邑邑t邑邑a邑C邑attt邑tet邑。
[001 ^ 優(yōu)選的，所述步驟①中反轉(zhuǎn)錄RT程序?yàn)?待測(cè)樣品總RNA與PR1基因下游引物P2和 18S rRNA基因下游引物P4混合后，70°C變性lOmin，迅速置冰上急冷2min;再加入反轉(zhuǎn)錄RT 緩沖液、dNTP混合物和反轉(zhuǎn)錄酶等，于42°C水浴化，70°C保溫15min，制成待測(cè)樣品cDNAs， 置冰上待用。
[0013] 優(yōu)選的，所述步驟②中巧光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 30sec，95°C 5sec，60°C 30sec，35個(gè)循環(huán);95°C 15sec，60°C lmin，95°C 15sec;上述反應(yīng)結(jié)束后，利用計(jì)算機(jī)分析 軟件自動(dòng)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線和溶解曲線。
[0014] 本發(fā)明針對(duì)蘭州百合PR1基因提供了一種快速、敏感、特異的定量檢測(cè)試劑盒和檢 巧巧法，為蘭州百合PR1基因的表達(dá)及檢測(cè)診斷提供了重要的技術(shù)支持。
【附圖說明】
[001引圖1:蘭州百合PR1基因標(biāo)準(zhǔn)品巧光定量PCR擴(kuò)增曲線圖；1-5分別對(duì)應(yīng):5.87 X 108copies/]iL、5.87Xl〇7 copies/]iL、5.87Xl〇6 copies/]iL、5.87Xl〇5 copies/]iL、5.87Xl〇4 copies/jiL 標(biāo)準(zhǔn)品。
[0016]圖2:蘭州百合18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品巧光定量PCR擴(kuò)增曲線圖；1 -6分別對(duì)應(yīng):3.29 Xl〇9 copies/]iL、3.29Xl〇8 copies/]iL、3.29Xl〇7 copies/]iL、3.29Xl〇6 copies/]iL、3.29 X l〇5 copies/]iL、3.29X l〇4 copies/uL標(biāo)準(zhǔn)品。
[0017]圖3:蘭州百合PRl基因標(biāo)準(zhǔn)品巧光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[001引圖4:蘭州百合18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品巧光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0019 ]圖5:蘭州百合PR1基因標(biāo)準(zhǔn)品巧光定量PCR溶解曲線圖。
[0020] 圖6:蘭州百合18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品巧光定量PCR溶解曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，W使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可W更好的 理解本發(fā)明并能予W實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
[0022] 標(biāo)準(zhǔn)品的獲得 1、總RNA的提取 將50mg感染CMV和LSV的蘭州百合葉片在液氮中研磨，用植物總RNA提取試劑盒(天根生 化科技(北京)有限公司)進(jìn)行感病組織總RNA的提取。
[0023] 2、引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所皋蘭生態(tài)與農(nóng)業(yè)綜合試驗(yàn)站微生物實(shí)驗(yàn) 室首次從蘭州百合上克隆的PR1基因序列，W及GenBank上登錄的百合18S rRNA基因序列 (GenBank登錄號(hào)：D29775)設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物P1、P2及P3、P4,由生工生物工程(上海） 股份有限公司合成。
[0024] 3、陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 1)RT反應(yīng) 利用蘭州百合PR1下游引物P2、內(nèi)參18S rRNA下游引物P4 W及M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RT反 應(yīng)，合成cDNAs第一鏈。
[0025] 10化RT反應(yīng)體系如下：2化總RNA，PR1下游引物P2、18S rRNA下游引物P4(各lOy mol/L)各化L，化L DEPC-此0,70°C變性10 min,迅速置冰上急冷2 min;再加入化L M-MLV buffer 巧X)，化L dNTP混合物（各 10mmol/L)，0.3化L RNase抑制劑（3011/化），0.3扣L M- MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200U /化）和0.3化L DEPC-H20;混合后42°C水浴lh，70°C保溫15 min,置冰上 待用。
[0026] 2)PCR 反應(yīng) 利用上述cDNAs為模板，在rag DNA聚合酶作用下分別進(jìn)行PR1和18S rRNA基因的PCR 擴(kuò)增。
[0027] PCR反應(yīng)體系為25化，包括：1化cDNAs(約50ng)，0.化L Tag DNA聚合酶巧U/y 1)，2.化1 10XPCR buffer,化L dNTP混合物（各2.5mmol/L)，0.5化上游引物P1 或P3(l化 mol/L)，0.5化下游引物P2或P4( 10皿ol/L)，18.3化 d地2〇。
[002引 PCR擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性4min; 94 °C變性30s，60 °C退火45s，72 °C延伸Imin，循 環(huán)擴(kuò)增30次，最后72°C延伸7min。
[0029] PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，回收目的片段，按照克隆載體試劑盒(大 連寶生物(TaKaRa)工程有限公司）的說明將目的片段連接在PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化D冊(cè)a感受 態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑平板篩選;隨機(jī)挑取3個(gè)白斑菌落分別接種在氨節(jié)LB培養(yǎng)基上，37 °C搖 菌12~16h;使用(大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司）的質(zhì)粒微量抽提試劑盒提取質(zhì)粒;分 另峨化L質(zhì)粒，在與上述PCR反應(yīng)體系相同的條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增;將PCR檢測(cè)得到的陽性重 組質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序;測(cè)序證實(shí)序列完全正確的陽性質(zhì)粒， 即為標(biāo)準(zhǔn)品，蘭州百合PR1和18S rRNA基因?qū)?yīng)的片段長(zhǎng)度分別為126bp和lllbp;用 NanoDrop ND-1000核酸/蛋白分析儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的0〇26日nm和0〇28日加1值，根據(jù)0〇26日加1和 OD28〇nm值計(jì)算質(zhì)粒濃度，換算為拷貝數(shù)/體積，然后用雙蒸水將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋。
[0030] 4、結(jié)果： 經(jīng)測(cè)序，上述設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)品與預(yù)期完全相符，10倍系列稀釋的PR1基因標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范 圍為：5.87X 104~5.87X 108 copies/化；18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍為:3.29X 104~ 3.29X 109 copies/化;回收的標(biāo)準(zhǔn)品片段序列如下： 蘭州百合PR1基因標(biāo)準(zhǔn)品序列： 邑CC曰Ct曰C曰C邑C曰邑邑tt邑t邑t邑邑C邑邑曰邑C曰CCC邑CC邑曰etc邑邑Ct邑C邑C曰曰邑邑邑t邑邑ttt邑t邑曰C邑邑C邑邑C邑曰 tgtgttc過tg過過ctgc過過ct過eg過cccgccgggg過過tt過cgtcggcg過g過ggc; 蘭州百合18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品序列： gggg過過過ett過CC過ggtcc過g過C過t過gt過過gg過ttg過C過g過ctg過g過gctctttcttg過ttet過tgggtggtg 邑t邑cat邑邑cc邑ttctta邑tt邑邑t邑邑a邑c邑attt邑tct邑。
[0031 ]巧光定量PCR檢測(cè)蘭州百合PRl基因表達(dá)方法的建立 1、待測(cè)樣品總RNA提取及cDNAs合成 采用天根生化科技(北京)有限公司的植物總RNA提取試劑盒，按照說明書提取待測(cè)蘭 州百合葉片的總RNA，根據(jù)實(shí)施例1中RT第一鏈cDNAs合成體系，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNAs。
[0032] 2、巧光定量PCR反應(yīng) W上述cDNAs為模板，用蘭州百合PR1基因上下游引物P1、P2及內(nèi)參18S rRNA基因上下 游引物P3、P4分別在Stra化gene公司的Mx3000p巧光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0033] PCR反應(yīng)液組成如下： 上述cDNAs模板 化1 SYBR Premix Ex 7a/^(2X) lOyL 上游引物(PI或P3) 0.化L 下游引物（P2或P4) 0.化L Rox Reference Dye II (50X ) 0.化1 PCR-grade water 6.8yL PCR反應(yīng)條件為:95°C 30sec，95°C 5sec，60°C 30sec，35個(gè)循環(huán);95°C 15sec，60°C lmin，95°C 15sec。上述反應(yīng)結(jié)束后，利用計(jì)算機(jī)分析軟件自動(dòng)獲得待測(cè)樣品PRl基因和18S rRNA基因的擴(kuò)增曲線和溶解曲線。
[0034] WDEPC水為陰性對(duì)照于相同條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若待測(cè)樣品cDNAs模板的巧光增 長(zhǎng)曲線超過闊值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且溶解曲線形成單一的溶解峰，則判斷為陽性。
[0035] 同時(shí)，在相同條件下W10倍系列稀釋的PR1標(biāo)準(zhǔn)品和18S rRNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增，并 分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0036] 測(cè)得待測(cè)樣品cDNAs的Ct值后，分別對(duì)照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測(cè)樣品cDNAs中 PR1基因 W及18S rRNA基因的起始模板拷貝數(shù)，按照W下公式得到經(jīng)過內(nèi)參歸一化校正后 的待測(cè)樣品PR1基因的標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)：
[0037] 檢測(cè)結(jié)果 蘭州百合PR1基因和18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品的巧光定量PCR擴(kuò)增曲線結(jié)果參見圖1和圖2， PRl基因標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為l:5.87X 108 copiesA^L、2:5.87X107copiesA^L、3:5.87X106 copies/iiL、4:5.87Xl〇5 copies/iiL、5:5.87Xl〇4 copies/化;18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品濃度分 別為l:3.29X 109 copies/liL、2:3.29X 108 copies/liL、3:3.29X107copies/liL、4:3.29X 1〇6 copies/]iL、5:3.29Xl〇5 copies/]iL、6:3.29Xl〇4 copies/uL。
[003引圖3和圖4分別為蘭州百合PRl基因和18S rRNA基因?qū)?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中PRl基因 回歸方程:Y =-3. ：346禮0G(X)+45.54，RSq: 0.998，PCR的擴(kuò)增效率為99.0%; 18S rRNA基因 回歸方程:￥=-3.113禮06(乂)+40.61，1?59:0.999，口〔如勺擴(kuò)增效率為109.5%;其中￥:對(duì)應(yīng) 的Ct值;X:基因的精確拷貝數(shù)。
[0039] 圖5和圖6分別為蘭州百合PR1基因和18S rRNA基因的溶解曲線，其中PR1基因和 18S rRNA基因的目的產(chǎn)物溶解溫度分別在88°C和83°C左右，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，形成特異的溶 解峰，沒有雜峰出現(xiàn)，且峰值較為一致，說明本發(fā)明定量結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。
[0040]根據(jù)巧光檢測(cè)的Ct值W及擴(kuò)增曲線和溶解曲線，判斷待測(cè)樣品PR1基因是否有表 達(dá);若巧光檢測(cè)結(jié)果呈典型的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，如圖1和圖5所示，判斷為陽性，所測(cè)樣 品中PR1基因有表達(dá)，PR1基因的表達(dá)量可根據(jù)上述PR1基因的標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)公式計(jì)算得到;若 沒有典型的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，則判斷為陰性，所測(cè)樣品中PR1基因無表達(dá)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種蘭州百合PR1基因定量檢測(cè)試劑盒，包括特異性引物、第一鏈cDNA合成試劑以及 熒光定量PCR反應(yīng)試劑，所述特異性引物由蘭州百合PR1基因和內(nèi)參18S rRNA基因的特異性 引物組成，所述特異性引物的序列如下： 蘭州百合PR1 基因上游引物Pl:5'_ GCCACTACACGCAGGITGTG -3' 蘭州百合PR1 基因下游引物P2:5' -GCCTCTCGCCGACGTAAITC -3' 內(nèi)參 18S rRNA基因上游引物P3:5'_ GGGGAAACTTACCAGGTCCA -3' 內(nèi)參 18S rRNA基因下游引物P4:5' -CAGACAAATCGCTCCACCAA -3'； 其特征在于所述試劑盒還包括陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，所述陽性對(duì)照品為蘭州百合 PR1基因標(biāo)準(zhǔn)品以及內(nèi)參18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品，所述陰性對(duì)照品為DEPC水;所述陽性對(duì)照品 序列如下： 蘭州百合PR1基因標(biāo)準(zhǔn)品：內(nèi)參18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品：其特征在于將上述陽性對(duì)照品序列構(gòu)建到質(zhì)粒載體中，測(cè)定陽性質(zhì)粒濃度后換算為拷 貝數(shù)，然后用雙蒸水將上述陽性質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，以10倍系列稀釋的陽性質(zhì)粒溶液 作為模板，應(yīng)用上述特異性引物P1、P2及P3、P4分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)拷貝數(shù)的對(duì) 數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)品Ct值的關(guān)系可繪制得到PR 1基因和18S rRNA基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；同時(shí)將待測(cè)樣 品提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)，以合成的cDNAs為模板，應(yīng)用上述特異性引物P1、P2及 P3、P4在相同條件下進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，測(cè)得待測(cè)樣品cDNAs的Ct值后，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即 可獲得待測(cè)樣品起始cDNAs中PR1基因和18S rRNA基因的精確拷貝數(shù)，再經(jīng)過內(nèi)參校正后最 終獲得待測(cè)樣品PR1基因的標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘭州百合PR1基因定量檢測(cè)試劑盒，其中蘭州百合PR1基因標(biāo) 準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度為5.87 X 108 copies/yL;內(nèi)參18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度為3.29 X 109 copies/yLo3. -種如權(quán)利要求1所述的蘭州百合PR1基因定量檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于 包括如下步驟： 步驟①以蘭州百合葉片、莖桿或種球?yàn)榇郎y(cè)樣品，提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)合成 cDNAs; 步驟②熒光定量PCR:以待測(cè)樣品cDNAs作為模板，用蘭州百合PR1基因和內(nèi)參18S rRNA基因的特異性引物P1、P2以及P3、P4分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；以DEPC水為陰性對(duì)照 于相同條件下進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增;所述檢測(cè)方法同時(shí)以10倍系列稀釋的PR1基因和18S rRNA基因的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增； 步驟③數(shù)據(jù)采集與分析:上述步驟②反應(yīng)結(jié)束后，分別根據(jù)拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值與各標(biāo)準(zhǔn) 品Ct值的關(guān)系繪制得到PR1基因和18S rRNA基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線;利用計(jì)算機(jī)分析軟件自動(dòng)獲 得待測(cè)樣品PR1基因和18S rRNA基因的擴(kuò)增曲線以及溶解曲線，若待測(cè)樣品PR1基因熒光增 長(zhǎng)曲線超過閾值線，并呈良好的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且溶解曲線形成單一的溶解峰，則判斷為陽性， 所測(cè)樣品中PR1基因有表達(dá)； 若沒有典型的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，則判斷為陰性，所測(cè)樣品中PR1基因無表達(dá)； 若判斷陽性樣品中PR1基因的表達(dá)量，可將測(cè)得的陽性樣品cDNAs的Ct值分別對(duì)照相應(yīng) 的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得cDNAs中PR1基因以及18S rRNA基因的精確拷貝數(shù)，按照以下公式得到經(jīng)過 內(nèi)參歸一化校正后的陽性樣品PR1基因的標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)：
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106048067SQ201610673491
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月16日 公開號(hào)201610673491.5, CN 106048067 A, CN 106048067A, CN 201610673491, CN-A-106048067, CN106048067 A, CN106048067A, CN201610673491, CN201610673491.5
【發(fā)明人】張玉寶, 王亞軍, 謝忠奎, 王樂, 王若愚, 楊果, 郭志鴻, 邱陽
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所