豬繁殖障礙性疾病RNA病毒的EvaGreen實時熒光定量PCR引物及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬繁殖障礙性疾病RNA病毒的EvaGreen實時熒光定量PCR引物，包括以下引物對：PRRSV?Sense：5?TTTGTGGTGTATCGTGCCGT?3；PRRSV?Antisense：5?GCACAGACTGCGTAAATGCT?3；CSFV?Sense：5?ATAATGGGGCATACCTGCCG?3；CSFV?Antisense：5?TCGGGTAAGGTTGTGATC?3；并提供了利用其檢測豬繁殖障礙性疾病RNA病毒的方法。本發(fā)明引物及方法特異、快速、敏感，能同時檢測PRRSV、CSFV等RNA病毒。
【專利說明】
豬繁殖障礙性疾病RNA病毒的EvaGreen實時黃光定量PCR引物 及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子病毒學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種豬繁殖障礙性疾病RM病毒的 EvaGreen實時巧光定量PCR引物及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國是世界養(yǎng)豬第一大國，豬繁殖障礙性疾病一直是養(yǎng)豬業(yè)的常見疾病，給豬場 和養(yǎng)豬戶造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病病因復(fù)雜，一般為多病原的混合感染，臨床上較 難控制，治療效果往往不理想，造成豬群生長緩慢或停滯、病殘豬和死亡豬只增多，飼料效 率、生長速度W及豬群整體的均勻度降低，治療成本增加，影響了豬群的繁殖與改良，威脅 著養(yǎng)豬業(yè)尤其是規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。豬繁殖障礙性疾病主要是由PRRSV、PCV2、CSFV、PPV、 PRV等的一種或幾種病毒的混合感染引起的，因此建立快速有效的檢測方法非常有必要。
[0003] 其中PRRSVXSFV病毒為RNA病毒，目前的診斷方法包括近年發(fā)展起來的PCR和實時 巧光定量PCR。實時巧光定量PCR有巧光染料和巧光探針之分，巧光探針特異性較好但成本 高，而常用的巧光染料SYBR GreenI因擴(kuò)增時要求濃度低而導(dǎo)致擴(kuò)增信號相對較弱，無法解 決由低濃度造成的染料重分布問題，而且低烙點(diǎn)的cDNA鏈可能由于染料重分布問題而無 法檢測到，使其檢測的可靠性因此而降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述問題，本發(fā)明提供一種豬繁殖障礙性疾病RNA病毒的多重EvaGreen實時 巧光定量PCR引物及其檢測方法，該方法特異、快速、敏感，能同時檢測PRRSV、CSFV等RNA病 〇
[0005] 為解決W上問題，本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)： 設(shè)計一種豬繁殖障礙性疾病RNA病毒的EvaGreen實時巧光定量PCR引物，包括W下引物 對(PRRSV、CSFV各自的上下游引物）： PRRSV-Sense:日-TTTGTGGTGTATCGTGCCGT-3 PRRSV-Antisense:日-GCACAGACTGCGTAAATGCT-3 CSFV-Sense:日-ATAATGGGGCATACCTGCCG-3 CSFV-Antisense:5-TCGGGTAAGGTTGTGATC-3。
[0006] 設(shè)計一種豬繁殖障礙性疾病RNA病毒的EvaGreen實時巧光定量PCR檢測方法，包括 W下步驟： (1) 別提取PRRSV、CSFV標(biāo)準(zhǔn)品病毒液中的總RNA，將所得總RNA分別按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA; (2) 取0.5化所得 cDNA，加入10XPCR buffer 5化，2.5mmol/L 的dNTP混合物4 化、 SOpmolAiL的上下游引物各山L、抓/化的化q DNA聚合酶0.扣L，加滅菌雙蒸水至反應(yīng)總體積 50化，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增程序為：95°C預(yù)變性3 min，94°C 30 s，52°C 30s，72°C 30s，共30個循環(huán)，72°C延伸lOmin;PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5yL PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢 目的條帶，回收目的片段，PRRSV、CSFV的目的條帶分別為300、149bp; (3 )將回收的目的片段與P G E M - T E a S y載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，（用質(zhì)粒提取試劑盒)提取重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定， 獲得陽性重組質(zhì)粒； (4)用紫外分光光度計分別測定陽性重組質(zhì)粒在26化m和28化m處的吸光度，并計算出 重組質(zhì)粒的DNA濃度與純度；將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，制備成1.0X10<^~1.0X 109copies/山的病毒重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板； 巧)將PRRSV、CSFV標(biāo)準(zhǔn)陽性模板分別進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而可W 得出拷貝數(shù)X與Ct值之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式； 所述巧光定量PCR反應(yīng)的體系為：標(biāo)準(zhǔn)陽性模板1化，上述4個對應(yīng)引物各1化，10 X PCR buffer f5]iL，25mmol/L Mg2+4化，2.5mmol/L dNTP 4.化L，10X EvaGreen 扣L，Taq DM Polymerase 2U，加 d加 2〇至反應(yīng)體系總體積為50化；反應(yīng)條件為：95°C 3min;95°C 15s，60°C lmin，40個循環(huán)，烙解曲線程序為:95°C 15s，60 °C 1 min，95°C 15s，60 °C開始 收集巧光信號制作烙解曲線； (6)提取待測樣品基因組cDNA，進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，將所得各目的片段的Ct值代入 標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到待測樣品中各病毒RNA的拷貝數(shù)。
[0007] 所述巧光定量PCR反應(yīng)的體系為:待測樣品基因組cDNA模板化L(約10化g)，上述 4個對應(yīng)引物各化L，10XPCRbuffer扣L，25mmol/LMg2+4化，2.5mmol/LdNTP4.5化，10 X EvaGreen扣LJaq DNA Polymerase 2U，加 d地2〇至反應(yīng)體系總體積為50化；反應(yīng)條件 為:95°C 3min;95°C 15s，60°C lmin，40個循環(huán)，烙解曲線程序為:95°C 15s，60 °C 1 min， 95°C 15s，6(TC開始收集巧光信號制作烙解曲線。
[0008] 本發(fā)明具有積極有益的技術(shù)效果： (1)標(biāo)準(zhǔn)品cDNA各個稀釋度的溶解溫度接近，反應(yīng)過程中未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和明顯 引物二聚體，從而說明本發(fā)明的引物設(shè)計合理，特異性好，抗干擾，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件得 到了很好的優(yōu)化。
[0009] (2)本發(fā)明在綜合考量目標(biāo)病毒RNA序列的保守區(qū)、是否形成二級結(jié)構(gòu)、G+C含量、 堿基隨機(jī)分布、長度等眾多因素的基礎(chǔ)之上，并經(jīng)過必要的修飾及大量的試驗驗證，最終設(shè) 計并篩選出了特異性和高靈敏性的檢測引物和EvaGreen巧光染料體系，建立的巧光定量 PCR檢測體系，特異性強(qiáng)，靈敏度高，且有良好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。
[0010] (3)本發(fā)明篩選使用的新型巧光染料EvaGreen對PCR干擾極小，能夠使用高濃度而 使擴(kuò)增信號強(qiáng)于SYBR Green I、擴(kuò)增時間比SYBR Green I短，而且高濃度的巧光染料能消 除"染料重分布"的缺陷，具有更高的敏感性和穩(wěn)定性，因此研究發(fā)現(xiàn)EvaGreen更適合于多 重實時巧光PCR。
【具體實施方式】
[0011] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合具體實施例，對本 發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0012] W下實施例中所用試劑及材料來源如下： pGEM-T Easy質(zhì)粒載體、T4 DNA連接酶均購自Promega公司產(chǎn)品。EX TaqDNA聚合酶為寶 生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。RNA抽提試劑化izol為V-gene公司產(chǎn)品；Eva Green染料為 Biotium公司產(chǎn)品；PTC 200PCR儀，Bio2 Rad實時巧光定量PCR儀。其它未特別說明的試劑、 原料及儀器設(shè)備均來源于市售產(chǎn)品。
[0013] 豬繁殖呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬攝病毒(CSFV)及PK-15細(xì)胞株均購自中國獸藥 監(jiān)察所。工程菌JM109感受態(tài)細(xì)胞為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。
[0014] 實施例1 一種PRRSV、CSFV病毒的多重實時巧光定量PCR檢測方法，包括W下步驟： 首先，根據(jù)PRRSV、CSFV病毒DNA的高度保守區(qū)序列、兼顧引物之間兼容性，設(shè)計2對特異 引物，設(shè)計擴(kuò)增片段長度分別為300、149bp: PRRSV-Sense:日-TTTGTGGTGTATCGTGCCGT-3 PRRSV-Antisense:日-GCACAGACTGCGTAAATGCT-3 CSFV-Sense:日-ATAATGGGGCATACCTGCCG-3 CSFV-Antisense:5-TCGGGTAAGGTTGTGATC-3; (1) 參照化i zo 1 Reagent試劑盒使用說明書分別提取PRRSV、CSFV標(biāo)準(zhǔn)品病毒液中的總 RNA，將所得總RNA分別按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA; (2) 取0.5化所得 cDNA，加入10XPCR buffer 5化，2.5mmol/L 的dNTP混合物4 化、 SOpmolAiL的上下游引物各山L、抓/化的化q DNA聚合酶0.扣L，加滅菌雙蒸水至反應(yīng)總體積 50化，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增程序為：95°C預(yù)變性3 min，94°C 30 s，52°C 30s，72°C 30s，共30個循環(huán)，72°C延伸lOmin;PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5yL PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢 目的條帶，回收目的片段，PRRSV、CSFV的目的條帶分別為300、149bp; (3 )將回收的目的片段與P G E M - T E a S y載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，（用質(zhì)粒提取試劑盒)提取重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定， 獲得陽性重組質(zhì)粒； (4)用紫外分光光度計分別測定陽性重組質(zhì)粒在26化m和28化m處的吸光度，并計算出 重組質(zhì)粒的DNA濃度與純度；將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，制備成1.0X10<^~1.0X 109copies/山的病毒重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板； 巧)將PRRSV、CSFV標(biāo)準(zhǔn)陽性模板分別進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增完成后經(jīng)烙解曲線分 析，擴(kuò)增產(chǎn)物均能形成特異溶解峰值，其中PRRSV溶解峰值為80.7°C，CSFV溶解峰值為83.6 °C;建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而可W得出拷貝數(shù)X與Ct值之間的線性關(guān)系，曲線表達(dá)式系統(tǒng)自動分 析軟件顯示Ct值與標(biāo)準(zhǔn)陽性模板濃度的對數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系。
[001引所述巧光定量PCR反應(yīng)的體系為：標(biāo)準(zhǔn)陽性模板1化，上述4個引物各liiL，10X PCR buffer f5]iL，25mmol/L Mg2+4化，2.5mmol/L dNTP 4.化L，10X EvaGreen 扣L，Taq DNA Polymerase 2U，加 d加 2〇至反應(yīng)體系總體積為50化；反應(yīng)條件為：95°C 3min;95°C 15s，60°C lmin，40個循環(huán)，烙解曲線程序為:95°C 15s，60 °C 1 min，95°C 15s，60 °C開始 收集巧光信號制作烙解曲線。
[0016] PRRSV的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9969，斜率為-3.37，截距為40.03，從而可 W得出拷貝數(shù)X與Ct值之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式:Ct = -3.37Xlgx +40.03;CSFV的標(biāo)準(zhǔn) 曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9989，斜率為-3.35，截距為38.79，從而可W得出拷貝數(shù)X與Ct值 之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式:Ct = -3.35Xlgx +38.79;其中，口1?1?5￥標(biāo)準(zhǔn)品濃度在106~ 50(3〇口163/化內(nèi)有良好線性關(guān)系，擴(kuò)增效率為0.995(1?2>0.99);〔5。￥標(biāo)準(zhǔn)品濃度在106~ 50 copies/化內(nèi)有良好線性關(guān)系，擴(kuò)增效率為0.998(R2>0.99)。
[0017] (6)提取待測樣品基因組cDNA，進(jìn)行巧光定量PCR反應(yīng)，將所得各目的片段的Ct值 代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到待測樣品中各病毒RNA的拷貝數(shù)。
[0018] 在一個PCR管內(nèi)內(nèi)同時加入巧中病毒模板進(jìn)行EvaGreen多重實時巧光PCR，經(jīng)擴(kuò) 增、烙解后得到了2個明顯的峰，并經(jīng)重復(fù)試驗，最終穩(wěn)定2種病毒擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值，其中 PRRSV的Tm值為81.2±0.2°C，CSFV為85.7±0.3°C，不同Tm值間可W直接在烙解曲線上 明顯分辨出來。
[0019]特異性試驗： 在多重反應(yīng)體系下加入?〇^2、？?￥、？1?1?5￥、〔5。￥、巧￥、？1?￥和(1地2〇為模板，在相應(yīng)目的 片段Tm值處PRRSV、CSFV都有特異的目的峰產(chǎn)生，而PCV2、PPV、PRV、JEV及d地2〇的對照組沒 有目的峰產(chǎn)生，表明構(gòu)建的EvaGreen多重實時巧光PCR反應(yīng)體系特異性較好。
[0020] 靈敏性試驗： PRRSV在EvaGreen多重實時巧光PCR體系下靈敏度測定及相應(yīng)擴(kuò)增曲線顯示PRRSV在濃 度106~lOOcopies/化為模板時烙解曲線均產(chǎn)生明顯目的峰，SOcopiesAiL及d地2〇為模 板時沒有產(chǎn)生目的峰，表明PRRSV重組質(zhì)粒的靈敏度可達(dá)lOOcopiesAiLsCSFy在EvaGreen 多重實時巧光PCR體系下靈敏度測定及相應(yīng)擴(kuò)增曲線，顯示CSFV在濃度106~200copiesAi L為模板時烙解曲線均產(chǎn)生明顯目的峰，lOOcopies/化及d地20為模板時沒有產(chǎn)生目的峰， 表明CSFV重組質(zhì)粒的靈敏度可達(dá)200copiesAiL。
[0021] 穩(wěn)定及重復(fù)性試驗： 通過對每種病毒在多重EvaGreen實時巧光PCR后的烙解曲線Tm值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各 病毒目的片段Tm值批內(nèi)3次重復(fù)性，其中PRRSVXSFV的相應(yīng)Tm值變異系數(shù)分別為0.25% 和0.13%; 3次批間重復(fù)性試驗PRRSV、CSFV的相應(yīng)Tm值變異系數(shù)分別為0.46%、0.32%，批內(nèi)批 間變異系數(shù)均小于5%，顯示EvaGreen多重實時巧光PCR體系穩(wěn)定性較好。
[0022] 將巧中病毒分別在EvaGreen單重實時巧光PCR中（105、104及10 3copiesAiL)3個濃 度Ct值重復(fù)性檢測。其中PRRSV批間重復(fù)變異系數(shù)(Coefficient of variation,CV)分別為 1.22%、2.13%，批內(nèi)重復(fù)中CV分別為1.03%、1.89%; CSFV批間重復(fù)中CV分別為0.99%、1.98%， 批內(nèi)重復(fù)中CV分別為0.69%、1.73%。巧中豬病毒的3個濃度梯度在兩種重復(fù)試驗中的變異系 數(shù)均小于5%，表明重復(fù)性良好。巧中豬病毒在104copiesAiL標(biāo)準(zhǔn)品時，EvaGreen單重巧光PCR 批內(nèi)3次重復(fù)性試驗烙解曲線均在各自的溶解溫度附近，顯示在同一濃度下烙解曲線具有 較好批內(nèi)重復(fù)性。
[0023] 臨床樣本檢測 將檢測樣品基因組cDNA各化L(約10化g)加入EvaGreen多重實時巧光PCR反應(yīng)體系中， 其余組成為：4 個引物各化L，10X PCR buffer 化L，25mmol/L Mg2+4化，2.5mmol/L dNTP 4.f5]iL，10X EvaGreen fSuLJaq DNA Polymerase 2U，加 d地2〇至反應(yīng)體系總體積為50化； 反應(yīng)條件為：95°C 3min;95°C 15s，60°C lmin，40個循環(huán)，烙解曲線程序為：95°C 15s，60 °C 1 min，95°C 15s，60 °C開始收集巧光信號制作烙解曲線。通過制作烙解曲線可W獲得 相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值。利用本研究建立EvaGreen多重實時巧光PCR方法與普通PCR對60 份血清和60份組織樣品分別進(jìn)行檢測(見表1)，其中普通PCR和EvaGreen多重實時巧光 PCR對60份血清樣品的檢測結(jié)果符合率為100%，只檢測出CSFV和PRRSV兩種豬病毒，CSFV 的陽性率為20.0%，PRRSV的陽性率為23.3%，CSFV與PRRSV混合感染占總樣品數(shù)10.0%;在對 60份組織樣品的檢測過程中，EvaGreen多重實時巧光PCR較普通PCR體現(xiàn)了更高的靈敏度， 〔5尸￥通過￡￥曰6'6611多重實時巧光口〇?檢出率為25.0%，而普通口〇?中檢出率為21.6%，陰性 檢測結(jié)果兩者一致。在血清樣品檢測中CSFV與PRRSV混合感染占總陽性樣品感染率為 50.0%;在組織樣品檢測中CSFV與PRRSV混合感染占總陽性樣品感染率為38.4%，從上述檢 測結(jié)果可知，無論是在血清樣品還是組織樣品中，CSFV與PRRSV雙重感染比較普遍，同時由 于EvaGreen多重實時巧光PCR具有高于普通PCR的靈敏度，能進(jìn)一步確保檢測結(jié)果的可靠 性。
[0024] 表1實時巧光PCR與普通PCR方法檢測樣品結(jié)果
【主權(quán)項】
1. 一種豬繁殖障礙性疾病RNA病毒的EvaGreen實時熒光定量PCR引物，其特征在于，包 括以下引物對： PRRSV-Sense:5-TTTGTGGTGTATCGTGCCGT-3; PRRSV-Antisense:5-GCACAGACTGCGTAAATGCT-3; CSFV-Sense:5-ATAATGGGGCATACCTGCCG-3; CSFV-Antisense:5-TCGGGTAAGGTTGTGATC-3。2. -種豬繁殖障礙性疾病RNA病毒的EvaGreen實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 分別提取PRRSV、CSFV標(biāo)準(zhǔn)品病毒液中的總RNA，再將所得總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA; (2) 分別取兩種所得cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR反應(yīng)結(jié)束后，取其PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠 電泳檢測目的條帶，回收目的片段，PRRSV、CSFV的目的條帶分別為300、149bp; (3) 將回收的目的片段分別與pGEM-T Easy載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，獲得陽性重組質(zhì)粒； (4) 用紫外分光光度計分別測定陽性重組質(zhì)粒在260nm和280nm處的吸光度，并計算出 重組質(zhì)粒的DNA濃度與純度；將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，制備成1.0X 10°~1.0X 109copiesAiL的病毒重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽性模板； (5 )將PRRSV、CSFV標(biāo)準(zhǔn)陽性模板利用權(quán)利要求1中所述的引物分別進(jìn)行熒光定量PCR反 應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得出拷貝數(shù)X與Ct值之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式； (6)提取待測樣品基因組cDNA，利用權(quán)利要求1中所述的引物進(jìn)行焚光定量PCR反應(yīng)，將 所得各目的片段的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得到待測樣品中各病毒RNA的拷貝數(shù)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的EvaGreen實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述瓊脂 糖凝膠含有0.5 ug/mL EB。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的EvaGreen實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述熒光 定量PCR的反應(yīng)體系為:基因模板lyL，權(quán)利要求1所述引物各1.0yL，10X PCR buffer 5yL， 25mmol/L Mg2+ 4yL,2.5mmol/L dNTP 4.5yL,10X EvaGreen 5yL,Taq DNA Polymerase 2U，加 ddH2〇至反應(yīng)體系總體積為50yL。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的EvaGreen實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述熒光 定量PCR的反應(yīng)程序為95°C 3min;95°C 15s，60°C lmin，40個循環(huán)，熔解曲線程序為:95°C 15s，60 °C 1 min，95°C 15s，60°C開始收集熒光信號制作熔解曲線。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的EvaGreen實時焚光定量PCR檢測方法，其特征在于:在所述步 驟（2)中，PCR擴(kuò)增方法為：分別取兩種所得cDNA 0.5yL，加入10XPCR buffer 5yL、 2.5mmol/L的dNTP混合物4yL、50pmolAxL的上下游引物各lyL、5U/yL的Taq DNA聚合酶0.5μ L，加滅菌雙蒸水至反應(yīng)總體積50yL，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增;擴(kuò)增程序為:95°C預(yù)變性3 min， 94°C 30 s，52°C 30s，72°C 30s，共30個循環(huán)，72°C延伸lOmin。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048092SQ201610603983
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月28日
【發(fā)明人】趙麗, 何金環(huán), 王瑞寧, 李艷玲, 連瑞麗, 陳忠杰, 盧婷婷, 李存法, 劉永錄
【申請人】河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院