一種腫瘤靶向性藤黃酸類化合物及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬于天然藥物領(lǐng)域，公開(kāi)了一種腫瘤靶向性藤黃酸類化合物及其制備方法和用途。該化合物具有如式(I)所示的結(jié)構(gòu)。其中，G為藤黃酸類化合物；P為低聚化乙二醇或其一端氨基化的衍生物；FA為葉酸或葉酸類似物；FA以酯鍵或酰胺鍵與P偶聯(lián)，P以端羥基與G的羧基偶聯(lián)。通過(guò)體外MTT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤細(xì)胞株(HeLa和HepG2細(xì)胞)具有更好的抑制效果，比藤黃酸類藥物強(qiáng)4?10倍，但對(duì)正常肝細(xì)胞LO2的毒性低6倍以上。該葉酸修飾的藤黃酸類化合物具有葉酸受體介導(dǎo)靶向腫瘤細(xì)胞的特性，可克服藤黃酸類抗癌藥物選擇性低和易多耐藥性的問(wèn)題，達(dá)到通過(guò)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)自噬等途徑清除癌細(xì)胞的效果。G?P?FA(I)。
【專利說(shuō)明】
一種腫瘤靶向性藤黃酸類化合物及其制備方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于天然藥物領(lǐng)域，特別涉及一種腫瘤靶向性藤黃酸類化合物及其制備方 法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是嚴(yán)重危害人類健康的一大頑癥，現(xiàn)已成為僅次于心血管病的第二大殺手， 尋找抗癌藥物和研究其作用機(jī)理，尤其是開(kāi)發(fā)具有靶向腫瘤效應(yīng)的藥物，具有重要意義。
[0003] 總藤黃酸(含藤黃酸、新藤黃酸和別藤黃酸)是從藤黃分泌干燥樹(shù)脂中提取分離獲 得的藤黃酸類活性成分，據(jù)現(xiàn)有研究報(bào)道其具有優(yōu)異的抗癌活性，但該類化合物的癌細(xì)胞 靶向選擇性缺乏、水溶性差、毒性大等不足，嚴(yán)重限制了其在臨床上的使用。
[0004] 葉酸受體（folate receptor,FR)是一種跨膜糖蛋白，主要有FR-α,-β，-γ三種亞 型，分子量較小，對(duì)葉酸及類似物有較高的親和力(Kd = 0.1~ΙΟηΜ)，且具有飽和性、特異性 及可逆性等特點(diǎn)?，F(xiàn)有研究報(bào)道FR在多種腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)，如FR-α在超過(guò)90%的卵 巢癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、腎癌、結(jié)腸癌及肺癌中高度表達(dá)，而FR-β主要在非上皮來(lái) 源的惡性腫瘤、粒細(xì)胞白血病和胰腺癌及關(guān)節(jié)炎活性巨噬細(xì)胞和肝臟炎癥中高表達(dá)。FR-γ 則在一些造血細(xì)胞如惡性白血病中過(guò)度表達(dá)。在正常組織中高度保守，F(xiàn)R很少表達(dá)甚至不 表達(dá)，且與癌細(xì)胞表面的FR不同，呈極性分布，其與水溶液維生素 B家族中的葉酸(folate， folic acid，F(xiàn)A)及類似物的親和力比腫瘤細(xì)胞表面的FR結(jié)合力弱很多，幾乎不結(jié)合。FR可 以通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用將FA及類似物，或FA綴合物由細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，且 于FA相對(duì)分子質(zhì)量小、易于修飾和穿透癌細(xì)胞、免疫原性低，具有到達(dá)靶點(diǎn)時(shí)間短、血液清 除速度快、穿透力強(qiáng)、人體免疫反應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)。這為FR介導(dǎo)的腫瘤組織靶向成像和藥物靶向 于癌癥及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(FR同樣異常高表達(dá))的治療奠定了良好的基礎(chǔ)。
[0005] 通過(guò)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)和專利檢索，尚未發(fā)現(xiàn)有葉酸類似物偶聯(lián)藤黃酸類藥物實(shí)現(xiàn)癌癥 或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的靶向給藥方案先例。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種腫瘤靶向性藤 黃酸類化合物;該類化合物是通過(guò)葉酸修飾的藤黃酸類化合物。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種上述腫瘤靶向性藤黃酸類化合物的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述腫瘤靶向性藤黃酸類化合物的用途。
[0009] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] -種腫瘤靶向性藤黃酸類化合物，該化合物具有如式(I)所示的結(jié)構(gòu)：
[0011] G-P-FA
[0012] (I)
[0013] 其中，G為藤黃酸類化合物；
[0014] P為HOCH2 (CH2OCH2) nCH2〇H 或 HOCH2 (CH2OCH2) nCH2NH2，其中 η為0 或 1 ~10之間的自然 數(shù)；
[0015] FA為葉酸或葉酸類似物，優(yōu)選葉酸；
[0016] 所述FA以酯鍵或酰胺鍵與P偶聯(lián)，P以端羥基與G的羧基偶聯(lián)。
[0017] 所述藤黃酸類化合物為藤黃酸、新藤黃酸、別藤黃酸、藤黃新酸或它們的混合物。 藤黃酸、新藤黃酸、別藤黃酸和藤黃新酸的混合物可以稱為總藤黃酸。
[0018] 藤黃酸(Gambogic acid，GA)的化學(xué)式為：
[0019]
[0020] 新滕黃酸（Gambogenic acid，NGA)的化學(xué)式為：
[0021]
[0022] 別藤黃酸(Allogambogic acid，AA)的化學(xué)式為：
[0023]
[0024] 所述P的平均分子量為61~600。
[0025] 所述 P 的優(yōu)選分子量 61、62、105、106、149、150、237、238、281、282、325、326、413、 414、501 或 502,記為 P61、P62、P105、P106、P149、P150、P237、P238、P281、P282、P325、P326、 P413、P414、P501或P502。
[0026] 所述葉酸類似物是可與P上NH2或0H偶聯(lián)的葉酸類似生物，優(yōu)選為5-甲基四氫葉 酸、5-甲酰基四氫葉酸、甲氨蝶呤或5,10-亞甲基四氫葉酸。
[0027] 上述腫瘤靶向性藤黃酸類化合物的制備方法，包括以下操作步驟：
[0028] (1)取葉酸溶于a溶劑中，在脫水劑N，N'_二環(huán)己基碳二亞胺或1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，以及催化劑對(duì)二甲氨基吡啶作用下，0°C攪拌反應(yīng)1~6h;然后 與葉酸等摩爾比加入低聚化乙二醇，從冰浴中升高溫度至室溫，避光攪拌過(guò)夜;過(guò)濾除副產(chǎn) 物，濾液濃縮，冰乙醚沉淀重結(jié)晶或制備液相純化，凍干即得葉酸偶聯(lián)低聚化乙二醇；
[0029] 或取葉酸及類似物的活性酯溶解于無(wú)水DMS0/TEA中，加入與葉酸活性酯等摩爾的 低聚化乙二醇一端氨基化的衍生物，無(wú)水條件下反應(yīng)過(guò)夜，真空凍干分離或色譜純化，即得 葉酸偶聯(lián)低聚化乙二醇氨基化衍生物；
[0030] 所述低聚化乙二醇為HOCH2(CH2OCH2)nCH 2OH，所述低聚化乙二醇一端氨基化的衍生 物為H0CH2 (CH2OCH2) nCH2NH2)，其中η為0或1~10之間的自然數(shù)；
[0031] (2)將藤黃酸類化合物溶于a溶劑中，在脫水劑Ν，Ν'_二環(huán)己基碳二亞胺或1-(3-二 甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，以及催化劑對(duì)二甲氨基吡啶作用下，0°C攪拌反應(yīng)1 ~6h;然后按藤黃酸類化合物摩爾比1:1-3的量加入步驟(1)所得葉酸偶聯(lián)低聚化乙二醇或 葉酸偶聯(lián)低聚化乙二醇氨基化衍生物，從冰浴中升高溫度至室溫，避光攪拌過(guò)夜;過(guò)濾液濃 縮，冰乙醚或異丙醇重結(jié)晶，層析或制備液相純化，凍干即可獲得結(jié)構(gòu)如式（I)所示的腫瘤 靶向性藤黃酸類化合物。
[0032] 步驟（1)所述a溶劑為CH2C12、DMS0或DMF;所述攪拌反應(yīng)的時(shí)間為2.5h;所述室溫為 25°C ;所述無(wú)水DMS0/TEA中DMS0和TEA的體積比為2:1;
[0033] 步驟⑵所述a溶劑為CH2C12、DMS0或DMF;所述攪拌反應(yīng)的時(shí)間為2.5h;所述室溫為 25。。。
[0034] 步驟（1)所述葉酸、脫水劑和催化劑的摩爾比為1:1:1~1: 30:30;步驟(2)所述藤 黃酸類化合物、脫水劑、催化劑的摩爾比為1:1:1~1:25:25。
[0035] 具有通式(I)結(jié)構(gòu)的腫瘤靶向性藤黃酸類化合物的合成示意圖如圖1所示。
[0036] 上述腫瘤靶向性藤黃酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療癌癥疾病的 藥物中的用途。
[0037] 所述藥物中含有治療有效量的腫瘤靶向性藤黃酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的 鹽及藥學(xué)上可接受的載體。
[0038] 所述藥學(xué)上可接受的鹽可以是：葉酸偶聯(lián)的藤黃酸、新藤黃酸或別藤黃酸的化學(xué) 結(jié)構(gòu)上酚羥基成鈉、鎂、鈣鹽或其他鹽。
[0039]本發(fā)明的原理是：
[0040] 本發(fā)明基于葉酸受體介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞靶向內(nèi)吞原理，以葉酸修飾藤黃酸類化合物解 決藤黃酸類化合物的腫瘤靶向問(wèn)題，同時(shí)葉酸和連接基團(tuán)低聚合度的PEG衍生物（H0CH 2 (CH2OCH2) nCH20H 或 H0CH2 (CH2OCH2) nCH2NH2，MW 小于 600，其中 η = 0，1 ~10)具有很好的水溶 性、生物相容性和無(wú)免疫源性等優(yōu)點(diǎn)，可以獲得具有腫瘤靶向作用的葉酸偶聯(lián)藤黃酸類藥 物，提高藥效，增加腫瘤細(xì)胞選擇性，降低毒副作用，更適合抗癌臨床使用。
[0041] 本發(fā)明的葉酸偶聯(lián)藤黃酸類化合物技術(shù)制備工藝簡(jiǎn)單，藤黃酸類化合物的提取分 離純化可參考相關(guān)文獻(xiàn)來(lái)制備（陳葆仁，藤黃抗癌成分的研究I、藤黃酸的分離和結(jié)構(gòu)的鑒 定。江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)1980;37(2): 1-7;呂歸寶，楊秀賢，黃喬書。藤黃中新藤黃酸的分離及其 結(jié)構(gòu)。藥學(xué)學(xué)報(bào) 1984; 19(8) :636-639.)
[0042] 本發(fā)明人在設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)發(fā)明中發(fā)現(xiàn)通過(guò)水溶性分子葉酸化學(xué)修飾的藤黃酸類化 合物(含總藤黃酸、藤黃酸、新藤黃酸、別藤黃酸和藤黃新酸)具有更好的水溶性，顯著增加 了腫瘤細(xì)胞選擇性，提高了抗癌活性，大大降低了原型藥物的毒性，與藤黃酸鈉鹽比較(小 鼠腹腔注射的LD5Q = 38.8mg/kg)，部分葉酸修飾藤黃酸類藥物的LD5Q顯著增加(G-P62-FA， G-P106-FA，G-P150-FA 和 G-P238-FA的小鼠腹腔注射 LD5Q 分別為 75.12、74.6、81.21和 92.4mg/kg，以藤黃酸值換算）。
[0043] 2 %兔紅細(xì)胞溶血試驗(yàn)表明本發(fā)明的葉酸修飾的藤黃酸類化合物在4h內(nèi)未見(jiàn)紅細(xì) 胞溶血聚集，等價(jià)藤黃酸劑量>20mg。家兔耳緣靜脈刺激性實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的葉酸修飾藤黃 酸類化合物溶解在生理鹽水中靜脈滴注無(wú)血管刺激性。
[0044] 經(jīng)過(guò)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)MTT法測(cè)試表明，本發(fā)明化合物對(duì)具有葉酸受體陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤 細(xì)胞（宮頸癌HeLa和肝癌HepG2等)體外生長(zhǎng)抑制作用IC 5Q比原型藥物(藤黃酸為例）顯著提 高4-10倍。對(duì)正常肝臟細(xì)胞L02毒性數(shù)據(jù)表明本發(fā)明化合物比原型藥物對(duì)非癌細(xì)胞具有大 于6倍的IC 5Q值，提示葉酸修飾藤黃酸類藥物具有更低的毒性和更好的腫瘤靶向性。溶解度 實(shí)驗(yàn)表明，與原型相比（藤黃酸不溶于水，報(bào)道約〇.〇18mg/ml)，葉酸修飾后的藤黃酸類化合 物水溶性明顯提高(約為1.4-20mg/ml)，對(duì)藥物劑型制備及血管給藥等更加方便。
[0045] 在癌細(xì)胞靶向分子葉酸的介導(dǎo)驅(qū)動(dòng)下，本發(fā)明的葉酸偶聯(lián)藤黃酸類藥物在機(jī)體內(nèi) 可以很快進(jìn)入葉酸受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞;優(yōu)選的短鏈乙二醇及其衍生物連接橋可改善藥 物水溶性，同時(shí)又可以降低偶聯(lián)物分子大小從而提高其癌組織穿透性。
[0046] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:通過(guò)體外MTT檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) 其對(duì)腫瘤細(xì)胞株(HeLa和HepG2細(xì)胞)具有更好好的抑制效果，比藤黃酸類藥物強(qiáng)4-10倍，但 對(duì)正常肝細(xì)胞L02的毒性低6倍以上。該葉酸修飾的藤黃酸類化合物具有葉酸受體介導(dǎo)靶向 腫瘤的特性，可克服藤黃酸類抗癌藥物選擇性低和易多耐藥性的問(wèn)題，達(dá)到通過(guò)細(xì)胞凋亡、 誘導(dǎo)自噬等途徑清除癌細(xì)胞的效果。
【附圖說(shuō)明】
[0047] 圖1為本發(fā)明具有通式（I)結(jié)構(gòu)的腫瘤靶向性藤黃酸類化合物化合物的合成示意 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0049] 實(shí)施例1
[0050] 1)葉酸-乙二醇的制備:取葉酸（1.0g，2.3mmol)溶于40ml的DMS0中，在脫水劑(N， N ' -二環(huán)己基碳二亞胺，DCC，0 · 47g，2 · 3mmo 1)和催化劑（對(duì)二甲氨基吡啶，DMAP，0 · 29g， 2.3mmol)作用下，0°C攪拌4h;然后按葉酸等摩爾比加入乙二醇(HOCH2CH2OH)，從冰浴中升高 溫度至室溫25°C，避光攪拌過(guò)夜24h;過(guò)濾除副產(chǎn)物，濾液濃縮，冰乙醚沉淀重結(jié)晶或制備液 相純化，凍干即得葉酸-乙二醇偶聯(lián)產(chǎn)物(HOCH 2CH2OCO_FA)。
[0051 ] 2)葉酸-乙二醇-藤黃酸的制備：取藤黃酸(0.15mmol)溶于60ml的DMS0中，在脫水 劑DCC (3. Ommo 1)和催化劑DMAP (3. Ommo 1)作用下，0 °C攪拌6h;然后按藤黃酸摩爾比1:3倍加 入葉酸-乙二醇偶聯(lián)產(chǎn)物(HOCH2CH2OCO_FA)，從冰浴中升高溫度至室溫25°C，避光攪拌過(guò)夜。 過(guò)濾液濃縮，冰乙醚或異丙醇重結(jié)晶，層析或制備液相純化，凍干即可獲得癌細(xì)胞靶向性藤 黃酸類化合物GA-COOCH 2CH2OCO_FA(收率約65% )。
[0052] 1顯1?(50010^，01^0):3.6和4.2左右為乙二醇上氫的峰，其他峰為藤黃酸和葉酸 上氫的峰；1.24-1.46(GA:C24-H，C25-H，6H)，1.56-2.16(GA:C19-H，C20-H，C21-H，C34-H， C35-H，C36-H，C39-H，C40-H，21H)，2·26-2·66(GA:C22-H，C26-H，C29-H，6H，F(xiàn)A:C27-H，2H)， 2.96(GA :C11-H，1H)，3.23(GA:C31-H，2H)，4.45-4.63(FA:C13-H，C24-H，3H)，5.27(GA:C37-H，1H)，5.84(GA :C32-H，1H)，6.04(GA:C3-H，1H)，6.71(GA:C27-H，1H)，6.84-6.92(GA:C4-H， (：10-!1，2!^厶 :苯環(huán)上(：16-!1，(：17-!1，2!1;)，7.61(卩厶:苯環(huán)上(：18-!1，(：19-!1，2!〇。
[0053] IR:紅外光譜中明顯增加了 1728CHT1的酯羰基峰，說(shuō)明藤黃酸和葉酸通過(guò)乙二醇的 酯鍵連接上。
[0054] 實(shí)施例2
[0055] 1)葉酸-乙二醇282的制備：取葉酸（1.0g，2.3mmol)溶于40ml的DMS0中，在脫水劑 (DCC，0.47g，2.3mmol)和催化劑(DMAP，0.29g，2.3mmol)作用下，0 °C 攪拌 4h;然后按葉酸等 摩爾比加入乙二醇282(H0CH2(CH20CH2)5CH 20H)，從冰浴中升高溫度至室溫25°C，避光攪拌過(guò) 夜24h;過(guò)濾除副產(chǎn)物，濾液濃縮，冰乙醚沉淀重結(jié)晶或制備液相純化，凍干即得葉酸-乙二 醇282偶聯(lián)產(chǎn)物(HOCH2 (CH2OCH2) 5CH2OCO-FA)。
[0056] 2)葉酸-乙二醇282-藤黃酸的制備:取藤黃酸(0.15mmol)溶于60ml的DMS0中，在脫 水劑DCC( 3. Ommo 1)和催化劑DMAP (3. Ommo 1)作用下，0 °C攪拌6h;然后按藤黃酸摩爾比1:3倍 加入葉酸-乙二醇282偶聯(lián)產(chǎn)物(H0CH2(CH20CH 2)5CH20C0-FA)，從冰浴中升高溫度至室溫25 °C，避光攪拌過(guò)夜;過(guò)濾液濃縮，冰乙醚或異丙醇重結(jié)晶，層析或制備液相純化，凍干即可獲 得癌細(xì)胞靶向性藤黃酸類化合物GA-C00CH 2 (CH2OCH2) 5CH20C0-FA。
[0057] 七匪以500MHz，DMS0): 3.6和4.2左右為乙二醇282上氫的強(qiáng)峰，其他峰為藤黃酸和 葉酸上氫的峰；1.24-1.46(6厶<24-!1，〇25-!1，6!〇，1.56-2.16(6厶 :(：19-!1，〇20-!1，〇21-!1，〇34-H，C35-H，C36-H，C39-H，C40-H，21H)，2·26-2·66(GA:C22-H，C26-H，C29-H，6H，F(xiàn)A:C27-H， 2H)，2.96(GA:C11-H，1H)，3.23(GA:C3卜H，2H)，4.45-4.63(FA:C13-H，C24-H，3H)，5.27(GA: C37-H，1H)，5.84(GA:C32-H，1H)，6.04(GA:C3-H，1H)，6.71(GA :C27-H，1H)，6.84-6.92(GA: 〇4-!1，(：10-!1，2!^厶:苯環(huán)上(：16-!1，(：17-!1，2!1 ;)，7.61(卩厶:苯環(huán)上(：18-!1，(：19-!1，2!〇。
[0058] IR:紅外光譜中明顯增加了 1727CHT1的酯羰基峰，說(shuō)明藤黃酸和葉酸通過(guò)乙二醇 282以酯鍵連接上。
[0059] 實(shí)施例3
[0060] 1)葉酸活性酯（γ -NHS-FA)的制備:取葉酸（1.0g，2.3mmol)溶解于40ml無(wú)水DMS0 中，加入0.5ml TEA三乙胺混合并于無(wú)水環(huán)境下室溫避光攪拌過(guò)夜；然后混合0.47g (2.31111]1〇1)的0(^和0.268(2.31]11]1〇1)順3，避光攪拌2411，過(guò)濾除去副產(chǎn)物二環(huán)己脲，低溫真空 干燥除去DMS0和TEA，得到葉酸活性酯。
[0061] 2)葉酸-乙醇胺的制備：將真空干脆的葉酸活性酯溶解于1.5ml的無(wú)水DMS0/TEA (體積比2:1)混合溶液中，取與葉酸活性酯等摩爾的乙醇胺加入混合溶液中于無(wú)水條件下 反應(yīng)過(guò)夜，真空干脆反應(yīng)液即得葉酸偶聯(lián)乙醇胺(hoch2ch2nhco-fa)。
[0062] 3)葉酸-乙醇胺-藤黃酸的制備：取藤黃酸(0.15mmol)溶于60ml的無(wú)水DMS0中，在 脫水劑DCC (3. Ommo 1)和催化劑DMAP (3. Ommo 1)作用下，0 °C攪拌6h;然后按藤黃酸摩爾比1:3 倍加入葉酸偶聯(lián)乙醇胺(H0CH2CH2NHC0-FA)，從冰浴中升高溫度至室溫25 °C，避光攪拌過(guò)夜。 過(guò)濾液濃縮，冰乙醚或異丙醇重結(jié)晶，層析或制備液相純化，凍干即可獲得癌細(xì)胞靶向性藤 黃酸類化合物GA-COOCH2CH2NHCO-FA ο
[0063] hNMRGOOMHz，DMS0): 3.6和4.2左右為乙醇胺上2個(gè)-CH2-上氫的峰，其他峰為藤黃 酸和葉酸上氫的峰；1 · 24-1 · 46(GA: C24-H，C25-H，6H)，1 · 56-2 · 16(GA: C19-H，C20-H，C21-H， C34-H，C35-H，C36-H，C39-H，C40-H，21H)，2.26-2.66(GA:C22-H，C26-H，C29-H，6H，F(xiàn)A:C27-H，2H)，2.96(GA :C11-H，1H)，3.23(GA:C31-H，2H)，4.45-4.63(FA:C13-H，C24-H，3H)，5.27 (GA :C37-H，lH)，5.84(GA:C32-H，lH)，6.04(GA:C3-H，lH)，6.71(GA:C27-H，lH)，6.84-6.92 (GA:C4-H，C10-H，2H ;FA:苯環(huán)上C16-H，C17-H，2H;)，7.61(FA:苯環(huán)上C18-H，C19-H，2H)， 8.07(NH,寬峰）。
[0064] IR:紅外光譜中明顯增加了 1500-1650(^1的酰胺峰和1727CHT1的酯羰基峰，說(shuō)明 藤黃酸和葉酸通過(guò)乙二醇胺的酰胺鍵和酯鍵連接上。
[0065] 實(shí)施例4
[0066] 1)葉酸-乙二醇的制備:取葉酸（1.0g，2.3mmol)溶于40ml的DMS0中，在脫水劑(N， N ' -二環(huán)己基碳二亞胺，DCC，0 · 47g，2 · 3mmo 1)和催化劑（對(duì)二甲氨基吡啶，DMAP，0 · 29g， 2.3mmol)作用下，0°C攪拌4h;然后按葉酸等摩爾比加入乙二醇(HOCH2CH 2OH)，從冰浴中升高 溫度至室溫25°C，避光攪拌過(guò)夜24h;過(guò)濾除副產(chǎn)物，濾液濃縮，冰乙醚沉淀重結(jié)晶或制備液 相純化，凍干即得葉酸-乙二醇偶聯(lián)產(chǎn)物(HOCH 2CH2OCO_FA)。
[0067] 2)葉酸-乙二醇-新藤黃酸的制備：取新藤黃酸(0.15mmol)溶于60ml的DMS0中，在 脫水劑DCC (3 · Ommo 1)和催化劑DMAP (3 · Ommo 1)作用下，0 °C攪拌6h;然后按新藤黃酸摩爾比 1:3倍加入葉酸-乙二醇偶聯(lián)產(chǎn)物(HOCH2CH2OCO_FA)，從冰浴中升高溫度至室溫25°C，避光攪 拌過(guò)夜。過(guò)濾液濃縮，冰乙醚或異丙醇重結(jié)晶，層析或制備液相純化，凍干即可獲得癌細(xì)胞 靶向性藤黃酸類化合物NGA-COOCH 2CH2OCO_FA。
[0068] hNMRGOOMHz，DMS0): 3.6和4.2左右為乙二醇上氫的峰，其他峰為藤黃酸和葉酸 上氫的峰；1.24-1.46(GA:C24-H，C25-H，6H)，1.56-2.16(GA:C3-H，C19-H，C20-H，C21-H， C34-H，C35-H，C36-H，C39-H，C40-H，23H)，2.26-2.66(GA:C22-H，C26-H，C29-H，6H，F(xiàn)A:C27-H，2H)，2.96(GA :C11-H，1H)，3.23(GA:C31-H，2H)，4.45-4.63(FA:C13-H，C24-H，3H)，5.27 (GA :C37-H，1H)，5.84(GA:C32-H，1H)，6.71(GA:C27-H，1H)，6.84-6.92(GA :C10-H，1H;FA:苯 環(huán)上(：16-!1，(：17-!1，2!1;)，7.61(卩厶 :苯環(huán)上(：18-!1，(：19-!1，2!〇。
[0069] IR:紅外光譜中明顯增加了 1728CHT1的酯羰基峰，說(shuō)明新藤黃酸和葉酸通過(guò)乙二醇 的酯鍵連接上。
[0070] 實(shí)施例5:腫瘤靶向性藤黃酸類化合物注射液的制備
[0071]取等量于藤黃酸20g的經(jīng)由實(shí)施例1制備的腫瘤靶向性藤黃酸類化合物(GA-P62-FA)，溶解于注射用水中，加入氯化鈉5.0g攪拌均勻，稀鹽酸調(diào)節(jié)pH= 5.0，然后加入0.5 %的 注射用活性炭，60°C恒溫30min，脫炭后，濾液加注射用水至1000ml，0.22μηι的無(wú)菌濾膜過(guò) 濾，2ml/支分裝于玻璃曲頸安瓿中，熔封，100°C流通蒸汽濕熱滅菌40min，然后貼標(biāo)簽保存。
[0072] 實(shí)施例6:腫瘤靶向性藤黃酸類化合物凍干粉針劑的制備
[0073] 取等量于新藤黃酸20g的經(jīng)由實(shí)施例4制備的腫瘤靶向性藤黃酸類化合物粉末，加 入注射用葡萄糖粉末25g攪拌均勾，按40mg/瓶無(wú)菌分裝于玻璃曲頸安瓿中，密封然后貼標(biāo) 簽保存。
[0074] 實(shí)施例7 :腫瘤靶向性藤黃酸類化合物的血管刺激性試驗(yàn)
[0075] 取用注射用水50ml稀釋實(shí)施例1制備的腫瘤靶向性藤黃酸類化合物10mg，實(shí)驗(yàn)家 兔6只，隨機(jī)3組，其中生理鹽水作對(duì)照，給家兔左耳緣靜脈滴注葉酸偶聯(lián)藤黃酸注射液，右 耳緣靜脈滴注同體積生理鹽水，3h內(nèi)滴注完成。滴注完成后取注射點(diǎn)下端lcm處的血管及 心、肝、脾、肺、胰腺、腎和腦組織進(jìn)行固定福爾馬林溶液，石蠟包埋切片，HE染色，數(shù)字病理 學(xué)分析評(píng)價(jià)。
[0076] 經(jīng)觀察給藥后每日家兔的飲食、毛發(fā)、肛門、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動(dòng)狀態(tài)等 均正常，無(wú)中毒表現(xiàn)。至約48h左右，處死的動(dòng)物，觀察直腸粘膜光滑平整，無(wú)異常;其余留存 家兔逐日監(jiān)測(cè)，無(wú)異常出現(xiàn)。到第七天處死動(dòng)物，觀察體重和參照《中藥新藥研究指南》對(duì)血 管刺激進(jìn)行分級(jí)。家兔血管刺激性試驗(yàn)的病理組織學(xué)檢查結(jié)果為耳廓、表皮無(wú)異常，真皮血 管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)腫脹，毛細(xì)血管管壁無(wú)出血、壞死或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨層、軟骨細(xì)胞無(wú)增生 或壞死，軟骨細(xì)胞排列整齊;肝臟、心肌組織、腦組織、肺部、腎臟和胰腺組織均無(wú)異常。但藤 黃酸類藥物注射液的耳廓表皮明顯異常，真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，毛細(xì)血管管壁出血、壞死 或有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)。生理鹽水對(duì)照組耳廓表皮無(wú)異常，真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)腫脹，毛細(xì)血 管壁無(wú)出血、壞死或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨細(xì)胞排列整齊，無(wú)增生或壞死，軟骨層、軟骨細(xì)胞無(wú) 增生或壞死。癌細(xì)胞靶向性藤黃酸類化合物藥物組與生理鹽水組在病理學(xué)組織上無(wú)明顯差 異。
[0077]實(shí)施例8:細(xì)胞毒檢測(cè)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)
[0078] GA和NGA及其葉酸偶聯(lián)物(GA-P62-FA、GA-P282-FA、NGA-P62-FA)的體外抗癌效應(yīng) 評(píng)價(jià)。鑒于藤黃酸類化合物是廣譜抗癌細(xì)胞毒劑，本實(shí)施例中采用多種癌組織來(lái)源的葉酸 受體陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞(HeLa、HepG2和SK-0V-3)對(duì)實(shí)施例1、2和4制備的相應(yīng)偶聯(lián)產(chǎn)物 GA-P62-FA、GA-P282-FA和NGA-P62-FA及其原型化合物GA和NGA進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)，同時(shí)L02肝臟 細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行正常細(xì)胞的毒實(shí)驗(yàn)測(cè)試。
[0079] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞的大小接種2~10 X103個(gè)于96孔板上，待生長(zhǎng)24h 后，棄上清，然后按以下分組給藥:癌細(xì)胞設(shè)不加藥組和加藥組（濃度0.0625~5μΜ對(duì)癌細(xì) 胞，濃度0.5~100μΜ對(duì)L02細(xì)胞），順鉑(Cisplatin)為陽(yáng)性藥物參照，藤黃酸和新藤黃酸作 母體化合物對(duì)照比較，對(duì)實(shí)施例1、2和4制備的相應(yīng)偶聯(lián)產(chǎn)物GA-P62-FA、GA-P282-FA和NGA-P62-FA進(jìn)行細(xì)胞毒性檢測(cè)。每組設(shè)4~6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72h后，棄上清，加入100μΙ含0.5mg/ml 的MTT(四氮唑鹽)無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)4h，加入100μ1 DMS0(二甲亞砜），放置于微型振蕩儀上 振蕩10min，再置于酶標(biāo)儀上570nm處檢測(cè)0D值。正常人細(xì)胞系L02做對(duì)照。每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。
[0080] 結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加，與相應(yīng)不加藥對(duì)照組比較，細(xì)胞增殖活性分別下 降，說(shuō)明化合物呈濃度依賴性抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。而對(duì)正常肝細(xì)胞系L02細(xì)胞的增殖活 性未有明顯變化，顯示出該化合物對(duì)正常細(xì)胞具有低毒特性(表1)。
[0081 ] 表1不同細(xì)胞的IC5Q值(7 2h)及不同化合物IC5Q比值
[0082]
[0083] 頭 jMiyijy
[0084] 腫瘤靶向性藤黃酸類化合物的LD5Q試驗(yàn)
[0085]取18-22g的健康小鼠60只，10只/組，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水。按等摩 爾量的藤黃酸對(duì)不同偶聯(lián)組藥物進(jìn)行小鼠腹腔注射給藥，按〇.2ml/10g體重給藥，溶解溶媒 為陰性參照進(jìn)行等體積給藥，藤黃酸鈉鹽組為原藥對(duì)照，觀察各組小鼠出現(xiàn)的反應(yīng)癥狀、死 亡時(shí)間并記錄死亡數(shù)目數(shù)，首24h內(nèi)多次觀察，后續(xù)每天觀察3次，連續(xù)觀察12天，計(jì)算LD 50的 大概數(shù)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葉酸偶聯(lián)的藤黃酸大大降低了原型藥物的毒性，與藤黃酸鈉鹽比 較(小鼠靜脈注射的LD 5Q = 38.8mg/kg)，部分葉酸修飾的癌細(xì)胞靶向性藤黃酸類化合物的 LD5〇 顯著增加（G-P62-FA，G-P106-FA，G-P150-FA 和 G-P238-FA 的小鼠靜脈注射 LD5〇 分別為 75.12、74.6、81.21和92.411^/1^，以藤黃酸值換算）。
[0086]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種腫瘤靶向性藤黃酸類化合物，其特征在于:該化合物具有如式(I)所示的結(jié)構(gòu)： G-P-FA (I) 其中，G為藤黃酸類化合物； P為HOCH2 (CH2OCH2) nCH2OH 或HOCH2 (CH2OCH2) nCH2NH2，其中 η為 0或 1 ~10之間的自然數(shù)； FA為葉酸或葉酸類似物； 所述FA以酯鍵或酰胺鍵與Ρ偶聯(lián)，Ρ以端羥基與G的羧基偶聯(lián)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤靶向性藤黃酸類化合物，其特征在于:所述藤黃酸類 化合物為藤黃酸、新藤黃酸、別藤黃酸、藤黃新酸或它們的混合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤靶向性藤黃酸類化合物，其特征在于:所述Ρ的平均 分子量為61~600。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤靶向性藤黃酸類化合物，其特征在于:所述Ρ的分子 量61、62、105、106、149、150、237、238、281、282、325、326、413、414、501或502。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤靶向性藤黃酸類化合物，其特征在于:所述葉酸類似 物為5-甲基四氫葉酸、5-甲酰基四氫葉酸、甲氨蝶呤或5,10-亞甲基四氫葉酸。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤靶向性藤黃酸類化合物的制備方法，其特征在于包 括以下操作步驟： (1) 取葉酸溶于a溶劑中，在脫水劑Ν，Ν'_二環(huán)己基碳二亞胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，以及催化劑對(duì)二甲氨基吡啶作用下，〇°C攪拌反應(yīng)1~6h;然后與葉酸 等摩爾比加入低聚化乙二醇，從冰浴中升高溫度至室溫，避光攪拌過(guò)夜;過(guò)濾除副產(chǎn)物，濾 液濃縮，冰乙醚沉淀重結(jié)晶或制備液相純化，凍干即得葉酸偶聯(lián)低聚化乙二醇； 或者，取葉酸的活性酯或葉酸類似物的活性酯溶解于無(wú)水DMSO/TEA中，加入與葉酸的 活性酯等摩爾的低聚化乙二醇一端氨基化的衍生物，無(wú)水條件下反應(yīng)過(guò)夜，真空凍干分離 或色譜純化，即得葉酸偶聯(lián)低聚化乙二醇氨基化衍生物； 所述低聚化乙二醇為HOCH2(CH2OCH2)nCH 2OH，所述低聚化乙二醇一端氨基化的衍生物為 HOCH2 (CH2OCH2) nCH2NH2)，其中η為0或1~10之間的自然數(shù)； (2) 將藤黃酸類化合物溶于a溶劑中，在脫水劑Ν，Ν'_二環(huán)己基碳二亞胺或1-(3-二甲氨 基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，以及催化劑對(duì)二甲氨基吡啶作用下，0°C攪拌反應(yīng)1~6h; 然后按藤黃酸類化合物摩爾比1:1-3的量加入步驟（1)所得葉酸偶聯(lián)低聚化乙二醇或葉酸 偶聯(lián)低聚化乙二醇氨基化衍生物，從冰浴中升高溫度至室溫，避光攪拌過(guò)夜;過(guò)濾液濃縮， 冰乙醚或異丙醇重結(jié)晶，層析或制備液相純化，凍干即可獲得結(jié)構(gòu)如式(I)所示的腫瘤靶向 性藤黃酸類化合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:步驟（1)所述a溶劑為CH2C12、DMS0或 DMF;所述攪拌反應(yīng)的時(shí)間為2.5h;所述室溫為25°C ;所述無(wú)水DMSO/TEA中DMSO和TEA的體積 比為2:1; 步驟（2)所述a溶劑為CH2C12、DMS0或DMF;所述攪拌反應(yīng)的時(shí)間為2.5h;所述室溫為25 Γ。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)所述葉酸、脫水劑和催化劑的 摩爾比為1:1:1~1:30:30;步驟(2)所述藤黃酸類化合物、脫水劑、催化劑的摩爾比為1:1:1 ~1:25:25〇9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤靶向性藤黃酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制 備治療癌癥疾病的藥物中的用途。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于:所述藥物中含有治療有效量的腫瘤靶向 性藤黃酸類化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽及藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106083898SQ201610378426
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】彭詠波, 劉騰, 李雄
【申請(qǐng)人】彭詠波