小型微生物生態(tài)系統(tǒng)法制備多功能復(fù)合微生物菌劑與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開小型微生物生態(tài)系統(tǒng)法制備多功能復(fù)合微生物菌劑與應(yīng)用。本發(fā)明首先建立小型微生物生態(tài)系統(tǒng)，將三種以上互不拮抗的微生物種子接種到小型微生物生態(tài)系統(tǒng)混合培養(yǎng)，獲得具有微生物復(fù)合酶的多種復(fù)合菌群種子，然后將分解不同植物材料酶類的真菌按常規(guī)方法培養(yǎng)，獲得真菌搖瓶種子，再將多種復(fù)合菌群種子與真菌搖瓶種子按比例接種到固體營養(yǎng)基固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后制備成多功能復(fù)合微生物菌劑。本發(fā)明可解決現(xiàn)有應(yīng)用于農(nóng)業(yè)與環(huán)境的微生物菌劑功能單一，適應(yīng)性差，菌種間協(xié)同作用能力弱，無法產(chǎn)生新的、功能強(qiáng)大的復(fù)合酶系、生產(chǎn)成本高的難題，實(shí)現(xiàn)微生物菌劑低成本、高效清潔化處理并資源化利用農(nóng)業(yè)與環(huán)境污染廢棄物。
【專利說明】
小型微生物生態(tài)系統(tǒng)法制備多功能復(fù)合微生物菌劑與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物制造及農(nóng)業(yè)與環(huán)境技術(shù)領(lǐng)域，涉及復(fù)合微生物菌劑與應(yīng)用，具體涉及小型微生物生態(tài)系統(tǒng)法制備多功能復(fù)合微生物菌劑與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在當(dāng)前，動(dòng)物排泄物、人類生產(chǎn)活動(dòng)產(chǎn)生的固體廢棄物對(duì)環(huán)境污染日趨嚴(yán)重，將這些污染物無害化處理、資源化利用面臨巨大挑戰(zhàn)。
[0003]在農(nóng)業(yè)與環(huán)境領(lǐng)域，用于實(shí)現(xiàn)染物無害化處理、資源化利用的各類微生物產(chǎn)品、生物菌劑不斷涌現(xiàn)，具有如下特點(diǎn):(I)大部分微生物產(chǎn)品技術(shù)含量低、產(chǎn)品雷同，制備簡單粗放；(2)自然挖掘與選育應(yīng)用于農(nóng)業(yè)與環(huán)境的優(yōu)良新菌種比較少；(3)工程菌技術(shù)要求高，且其功能具有特定性，釋放到環(huán)境中因土著微生物的存在，其穩(wěn)定性與安全性需要很長時(shí)間評(píng)估，無法短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模用于農(nóng)業(yè)與環(huán)境。
[0004]現(xiàn)有菌劑產(chǎn)品中的微生物大部分都是按照各種簡單方法反復(fù)配比進(jìn)行混合、液態(tài)發(fā)酵、載體吸附、干燥等工藝進(jìn)行制備。按照現(xiàn)有技術(shù)，在菌株培養(yǎng)與菌劑制備過程中，多種微生物混菌發(fā)酵一次性獲得產(chǎn)品比較少，且成本高昂。絕大多數(shù)采用單菌種純菌培養(yǎng)，最后將各個(gè)單菌種按照隨意確定的比例混合獲得產(chǎn)品，這些產(chǎn)品應(yīng)用到農(nóng)業(yè)與環(huán)境中，不能實(shí)現(xiàn)多種微生物間的互生、共生、共代謝，產(chǎn)品中的微生物與原土著微生物間的群落關(guān)系不穩(wěn)定，適應(yīng)性差，微生物間的協(xié)同作用能力弱，無法產(chǎn)生新的、功能強(qiáng)大的復(fù)合酶系，產(chǎn)品功能性目標(biāo)無法實(shí)現(xiàn)。特別是應(yīng)用于環(huán)境污染處理時(shí)，這些產(chǎn)品對(duì)多變的環(huán)境污染物進(jìn)行生物無害化處理不徹底，資源化利用難度加大。
[0005]因此，探索發(fā)明微生物混菌培養(yǎng)的新方法與技術(shù)路線，開發(fā)低成本、用途廣、新型多功能復(fù)合微生物菌劑成為當(dāng)前的必然需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種利用小型微生物生態(tài)系統(tǒng)法制備多功能復(fù)合微生物菌劑的方法，同時(shí)提供由上述方法制備得到的多功能復(fù)合微生物菌劑及其應(yīng)用;可以解決現(xiàn)有應(yīng)用于農(nóng)業(yè)與環(huán)境的微生物菌劑功能單一，適應(yīng)性差，微生物菌種間協(xié)同作用能力弱，無法產(chǎn)生新的、功能強(qiáng)大的復(fù)合酶系、生產(chǎn)成本高的難題，實(shí)現(xiàn)微生物菌劑低成本、高效清潔化處理農(nóng)業(yè)與環(huán)境污染廢棄物，并資源化利用。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:多功能復(fù)合微生物菌劑的制備方法，通過小型微生物生態(tài)系統(tǒng)法實(shí)現(xiàn)，包括如下步驟:
步驟一:建立小型微生物生態(tài)系統(tǒng)，將三種以上互不拮抗的微生物種子接種到小型微生物生態(tài)系統(tǒng)混合培養(yǎng)，培育能互生、共生、共代謝良好的微生物群，共同在同一環(huán)境中增殖，獲得多種微生物群落的復(fù)合菌體，將復(fù)合菌體搖瓶培養(yǎng)，獲得復(fù)合菌群種子;所述微生物可以是細(xì)菌、真菌、放線菌等;所述微生物種子可以是自然分離與選育菌株，也可以在國家微生物保藏中心購買獲得； 步驟二:同步采用常規(guī)方法生產(chǎn)分解不同植物材料酶類的真菌搖瓶種子；
步驟三:將復(fù)合菌群種子與真菌搖瓶種子接種到固體營養(yǎng)基，經(jīng)接種好的固體營養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后制備成多功能復(fù)合微生物菌劑。
[0008]本發(fā)明多功能生物菌劑的制備方法是采用微生物生態(tài)系統(tǒng)法制備來實(shí)現(xiàn)，具體包括如下步驟:
步驟一:建立小型微生物生態(tài)系統(tǒng):包括自然培養(yǎng)物制備、初始培養(yǎng)液制備、初始培養(yǎng)液滅菌、無菌試驗(yàn)、小型微生態(tài)系統(tǒng)形成；
(1)自然培養(yǎng)物制備:
①按照重量百分比計(jì)，100g自然培養(yǎng)物含有的物質(zhì)及比例為:動(dòng)物新鮮糞便30%-50%、活性污泥5%_10%、過篩40-60目自然土壤5%-10%、細(xì)度80目的秸桿粉10%_15%、過篩40-60目有機(jī)垃圾5%-10%、糖渣15%-20%、普通啤酒5L ；
②將動(dòng)物新鮮糞便、活性污泥、過篩40-60目自然土壤、細(xì)度80目秸桿粉、過篩40-60目有機(jī)垃圾、糖渣混合成均勻的初始原基，然后將初始原基與5L啤酒初步混合均勻，將混合過含啤酒的初始原基置于攪拌器中攪拌混合5-10分鐘，均勻后制備成自然培養(yǎng)物，置于容器中備用；
(2)初始培養(yǎng)液制備:將上述備用自然培養(yǎng)物加熱煮沸30-40分鐘，靜置冷卻2-5小時(shí)，待比重大于水的物質(zhì)沉淀，器皿中上液處于微透明、小顆粒物半懸浮狀時(shí)，過濾后取液體轉(zhuǎn)入體積為I L三角瓶中，每個(gè)三角瓶裝液量為500ml，作為初始培養(yǎng)液備用；
(3)初始培養(yǎng)液滅菌:將裝有初始培養(yǎng)液的三角瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋，在蒸汽壓力1.051^/0112、溫度121<€，滅菌40?50111；[11，滅菌結(jié)束后備用；
(4)無菌試驗(yàn):在無菌條件下，取備用滅菌后的初始培養(yǎng)液2-5ml，接入無菌平皿中，放入恒溫培養(yǎng)箱35 0C -37 0C度恒溫培養(yǎng)18-24小時(shí)，無微生物長出，則將步驟(3)滅菌后的初始培養(yǎng)液作為無菌的初始培養(yǎng)液使用;如有微生物生長，則按步驟(I )-(4)重新制備；
(5)小型微生態(tài)系統(tǒng)形成
①將無菌的初始培養(yǎng)液在潔凈條件下分裝于滅菌后的5個(gè)三角瓶中，三角瓶的體積為500ml，每個(gè)三角瓶的裝液量為250ml，在自然pH條件下，在每個(gè)三角瓶內(nèi)形成獨(dú)立的小型生態(tài)體系;所述三角瓶的數(shù)量也可以根據(jù)待接種微生物種類確定；
②在潔凈條件下，每個(gè)三角瓶中接種1-5種互不拮抗的微生物，放入無菌箱常溫下自然生長18-24小時(shí);所述微生物為芽孢桿菌或者真菌中的一種；
③18-24小時(shí)后，取出無菌箱中經(jīng)步驟②處理的三角瓶，在潔凈條件下按照等體積、等比例混合，然后將三角瓶內(nèi)物質(zhì)全部轉(zhuǎn)入無菌容器;將無菌容器密閉，放置于潔凈環(huán)境中常溫自然培育10-16小時(shí)，得多菌種混菌液，備用;或?qū)o菌容器中的芽孢桿菌或者真菌經(jīng)脫水干燥，獲得復(fù)合微生物的休眠菌體；
步驟二:同步采用常規(guī)方法生產(chǎn)分解不同植物材料酶類的真菌搖瓶種子，具體制備方法是，
(I)分別制作PDA斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基，將真菌菌種接種至I3DA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得真菌斜面活菌種，然后將真菌斜面活菌種轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，獲得液態(tài)真菌種子，再將液態(tài)真菌種子轉(zhuǎn)接于產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得生產(chǎn)分解不同植物材料特定酶類的真菌液態(tài)種子，保存，備用； (2)種子活化培養(yǎng):將真菌液態(tài)種子接種到活化培養(yǎng)搖瓶中，活化培養(yǎng)獲得液體發(fā)酵種子，即制得真菌搖瓶種子；
步驟三:多菌種混菌培育
(1)復(fù)合菌種子制備:將步驟一常溫自然培育的多菌種混菌液，在潔凈條件下分裝在滅菌后的三角瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)24-72小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速100-200r/min，培養(yǎng)初始溫度為常溫，每隔3小時(shí)升溫1-2 0C，培育24-72小時(shí)后，當(dāng)搖瓶中微生物數(shù)量彡2x107cfu/ml時(shí)，得到活化的搖瓶復(fù)合微生物種子;所述搖床振蕩培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)接種微生物為芽孢桿菌時(shí)，培養(yǎng)溫度38± 1°C時(shí)，停止升溫，當(dāng)接種微生物為真菌時(shí)，培養(yǎng)溫度控制在23-35°C ;
(2)復(fù)合微生物菌劑制備:將步驟二得到的真菌搖瓶種子與步驟三(I)中得到的復(fù)合微生物種子分別按照8-10%(v/w，ml/g)的接種量接種到固體培養(yǎng)基中，固體培養(yǎng)基可以是由麩皮50%-70%、豆餅10%-15%、糖渣5%-10%、秸桿粉5%-10%、食品加工下腳料5%-10%按照重量百分比制備而成;所述食品加工下腳料可以是黑茶粉、甘蔗粉、馬鈴薯粉、木薯粉中的一種或幾種;復(fù)合微生物種子接種到固體培養(yǎng)基后，在發(fā)酵室固態(tài)發(fā)酵48-96小時(shí)，獲得固體復(fù)合微生物種子;用獲得的固體復(fù)合微生物種子繼續(xù)接種到固體培養(yǎng)基中擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為重量百分比5%-6%，送入發(fā)酵室固態(tài)發(fā)酵48_96小時(shí)，發(fā)酵過程溫度控制在32-37 °C，水分控制在65%左右，pH自然，擴(kuò)大發(fā)酵結(jié)束后，微生物數(shù)量彡2xl08cfu/g時(shí)，55-60 °C干燥，水分控制在15%-20%;經(jīng)粉碎、過篩至60-80目，獲得多功能復(fù)合微生物菌劑，常溫保存。
[0009]其中，在按照上述步驟二進(jìn)行真菌搖瓶種子的制備時(shí)，可采用常規(guī)方法針對(duì)不同的真菌選擇不同的培養(yǎng)基配方和活化培養(yǎng)基配方。在PDA培養(yǎng)基上大多數(shù)真菌都可良好生長，PDA培養(yǎng)基主要用于用于轉(zhuǎn)接真菌斜面活菌種;種子培養(yǎng)基，用于真菌斜面活菌種再次轉(zhuǎn)接液態(tài)培養(yǎng)，使培養(yǎng)基營養(yǎng)更為豐富和全面，真菌菌絲可以生長的更好，成為液態(tài)真菌種子;產(chǎn)酶培養(yǎng)基用于將液態(tài)真菌種子再次轉(zhuǎn)接于產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選的培養(yǎng)基配方可以是如下:
①斜面培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，其做法是稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水100ml煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過濾，再加15g葡萄糖和18g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每試管約10ml，121°C滅菌20分鐘左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆茫?br> ②種子培養(yǎng)基:可溶性淀粉2-3%，葡萄糖1-1.5%，KH2P040.1-0.25%,MgSO40.Ι-Ο.3% ,酵母膏0.5-0.75% ,NaNO30.2-0.35%, g然pH,121 °C高壓滅菌20min；
③產(chǎn)酶培養(yǎng)基:麥皮4-6 %，(NH4)2SO4 0.1-0.2%, KH2PO40.2-0.35% ,醋酸鈉 0.1-0.2%，抗壞血酸0.1-0.2%，]\%5040.15-0.25%，尿素0.25-0.5%，自然?!1，121°(:高壓滅菌20min；
④真菌種子活化培養(yǎng)配方及方法:蛋白胨5.0-5.5g/L，葡萄糖10.0-15 g/L，硫酸鎂0.5-0.8 g/L，酵母浸出粉2.0 _3.0g/L，磷酸氫二鉀l-3g/L，pH7.0-7.2營養(yǎng)液，搖瓶轉(zhuǎn)速為 100-160rpm，在 23-35°C 溫度下培養(yǎng) 25h-28h。
[0010]本發(fā)明方法所形成的小型微生物生態(tài)系統(tǒng)主要用于各種芽孢桿菌的混菌培養(yǎng)，也可用于真菌的混菌培養(yǎng)。本發(fā)明所述小型微生物生態(tài)系統(tǒng)原理如下:該系統(tǒng)按照各種芽孢桿菌在自然狀態(tài)下的群落間的互生、共生、共代謝原理，完全不采用化學(xué)試劑與生化制劑作為營養(yǎng)源;系統(tǒng)內(nèi)的營養(yǎng)來源為廢棄物及污染物的剩余養(yǎng)分，系統(tǒng)中自然pH及溫度不斷變化，營養(yǎng)條件接近污染環(huán)境中野生菌株生活狀態(tài)，使多種微生物在仿自然的狀態(tài)下，共同生存在同一環(huán)境中；該系統(tǒng)可培養(yǎng)所需要的多種目標(biāo)菌群，替代現(xiàn)有的高成本液態(tài)混菌發(fā)酵方法及設(shè)備。
[0011]較優(yōu)的技術(shù)方案可以是通過如下步驟實(shí)現(xiàn):
步驟一:建立小型微生物生態(tài)系統(tǒng)，包括自然培養(yǎng)物制備、初始培養(yǎng)液制備、初始培養(yǎng)液滅菌、無菌試驗(yàn)、小型微生態(tài)系統(tǒng)形成；
(1)自然培養(yǎng)物制備
①按以下重量百分比制備自然培養(yǎng)物，100g自然培養(yǎng)物含有的物質(zhì)及比例為:動(dòng)物新鮮糞便30%-50%、活性污泥5%-10%、過篩40-60目自然土壤5%_10%、細(xì)度80目秸桿粉10%_15%、過篩40-60目有機(jī)垃圾5%-10%、糖渣15%-20%、普通啤酒5L;
②自然培養(yǎng)物的制備方法:將動(dòng)物新鮮糞便、活性污泥、過篩40-60目自然土壤、細(xì)度80目秸桿粉、過篩40-60目有機(jī)垃圾、糖渣混合成均勻的初始原基，然后將初始與5L啤酒初步混合均勻，將混合過含啤酒的初始原基置于攪拌器中攪拌混合5-10分鐘，均勻后制備成自然培養(yǎng)物，置于容器中備用；
(2)始培養(yǎng)液制備:將上述備用自然培養(yǎng)物加熱煮沸30-40分鐘，靜置冷卻2-5小時(shí)，待比重大于水的物質(zhì)沉淀，器皿中上液處于微透明、小顆粒物半懸浮狀時(shí)，過濾后取上部分液體，轉(zhuǎn)入3-5個(gè)I L三角瓶中作為初始培養(yǎng)液備用；
(3)初始培養(yǎng)液滅菌:將初始培養(yǎng)液放入高壓蒸汽滅菌鍋，在蒸汽壓力1.05kg/cm2、溫度121°C條件下，滅菌40?50min，滅菌結(jié)束后，備用；
(4 )無菌試驗(yàn):取步驟(3 )的滅菌后的初始培養(yǎng)液0.5-lml,直接在準(zhǔn)備好的無菌LB培養(yǎng)基平皿中，35°C-37°(:恒溫培養(yǎng)18-24小時(shí)，無微生物長出，獲得無菌的初始培養(yǎng)液;如有微生物生長，重新按步驟(I )-(4)制備；
(5)小型微生態(tài)系統(tǒng)形成
①將步驟(1)-(4)制得無菌的初始培養(yǎng)液在潔凈條件下分裝于8個(gè)滅菌后的三角瓶中，菌種pH自然，每個(gè)三角瓶內(nèi)形成獨(dú)立的小型生態(tài)體系；
②在潔凈條件下，分別將枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌接種到三角瓶中，每2個(gè)三角瓶接種同一種菌種，接種完畢放入無菌箱常溫下自然生長18-24小時(shí)；
③18-24小時(shí)后，取出無菌箱中的三角瓶，在潔凈條件下按照等體積比1:1: 1:1依次混合，然后轉(zhuǎn)入無菌容器，在無菌容器中形成具有多種微生物種及多種微生物群落的小型微生物生態(tài)系統(tǒng);將無菌容器放置于潔凈環(huán)境中常溫自然培育10-16小時(shí)后成為多菌種混菌液，取出，置于冰箱4°C保存?zhèn)溆?；或者將混菌種子脫水干燥后保存，得復(fù)合微生物休眠菌體；
步驟二:同步采用常規(guī)方法生產(chǎn)黑曲霉搖瓶種子、冠突散囊菌搖瓶種子:
(I)分別制作PDA斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基，將黑曲霉、冠突散囊菌菌種分別接種至TOA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得斜面活菌種，然后將斜面活菌種轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，獲得液態(tài)真菌種子，再將液態(tài)真菌種子轉(zhuǎn)接于產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別獲得黑曲霉液態(tài)種子和冠突散囊菌液態(tài)種子，保存，備用；
①PDA斜面培養(yǎng)基制備:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，其做法是稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水100ml煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過濾，再加15g葡萄糖和18g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每試管約10ml，121°C滅菌20分鐘后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆?
②種子培養(yǎng)基制備:可溶性淀粉2-3%，葡萄糖1-1.5%,KH2PO4 0.1-0.25% ,MgSO4
0.1-0.3%，酵母膏0.5-0.75%，NaN030.2-0.35%，自然pH，121°C高壓滅菌20min;
③產(chǎn)酶培養(yǎng)基制備:麥皮4-6%，(NH4)2SO40.1-0.2% ,KH2PO40.2-0.35%，醋酸鈉0.1-
0.2%，抗壞血酸0.1-0.2%，]\%5040.15-0.25%，尿素0.25-0.5%，自然?!1，121°(:高壓滅菌20min；
(2)種子活化培養(yǎng):將黑曲霉液態(tài)種子接種到活化培養(yǎng)搖瓶中，活化配方為:蛋白胨
5.0-5.5 g/L，葡萄糖 10.0-15 g/L，硫酸鎂 0.5-0.8 g/L，酵母浸出粉 2.0 _3.0g/L，磷酸氫二鉀l-3g/L，pH7.0-7.2營養(yǎng)液中，搖瓶轉(zhuǎn)速為100-160rpm，在23-35°C溫度下培養(yǎng)25h-28h，獲得液體發(fā)酵種子，即得黑曲霉的真菌搖瓶種子;將冠突散囊菌液態(tài)種子接種到活化培養(yǎng)搖瓶中活化培養(yǎng)，搖瓶中營養(yǎng)液配方為:蔗糖60-80g/L、100目細(xì)度黑茶粉10-20g/L或者黑茶浸提液0.8-1%、磷酸氫二鉀3-5g/L，pH5.5-6.5，搖瓶轉(zhuǎn)速為100_130印111，在26-321€下培養(yǎng)90-100小時(shí)，獲得液體發(fā)酵種子，即冠突散囊菌的真菌搖瓶種子；
步驟三:多菌種混菌培育
(1)復(fù)合菌群芽孢桿菌種子培育:將步驟一第(5)項(xiàng)第③步獲得的多菌種混菌液分裝在含有初始培養(yǎng)液的5-10個(gè)三角瓶中，三角瓶體積為1L，裝液量為500ml，在活化搖床上振蕩變溫培養(yǎng)40-72h，振蕩變溫培養(yǎng)條件如下:搖床轉(zhuǎn)速160-200r/min，初始溫度為20°C，每隔3小時(shí)上調(diào)1-2°C，當(dāng)溫度上調(diào)至38土 TC時(shí)，停止上調(diào)；振蕩變溫培養(yǎng)結(jié)束，獲得液體發(fā)酵復(fù)合種子液;然后將液體發(fā)酵種子液按照10%的接種比例(v/w，ml/g)接種到1kg由麩皮、米糠、豆餅、玉米粉按照質(zhì)量比10: 1:3:2混合制備的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在37 °C下培養(yǎng)3天，得到主要復(fù)合菌群芽孢桿菌固體種子；
(2)真菌菌群黑曲霉及冠突散囊菌種子培育:
①將黑曲霉的真菌搖瓶種子按照10%的接種比例(v/w，ml/g)接種到5kg由麩皮、米糠、豆餅、馬鈴薯粉按照質(zhì)量比7:1:1:1混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在37°C下培養(yǎng)培養(yǎng)3天，得到黑曲霉固體種子；
②將冠突散囊菌的真菌搖瓶種子按照5%的接種比例(v/w，ml/g)接種到5kg由黑茶粉、甘蔗粉按照質(zhì)量比1:1混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，初期溫度25°C，48小時(shí)后，將溫度調(diào)節(jié)到28°(:-32°(:，濕度為70%，？!1值調(diào)節(jié)至5-5.5，連續(xù)培養(yǎng)5天，得到冠突散囊菌固體種子；
③固體擴(kuò)大培養(yǎng):將上述制備得到的主要復(fù)合菌群芽孢桿菌固體種子、輔助菌群黑曲霉固體種子、冠突散囊菌固體種子按照重量比7:2:1均勻混合，按照6-8%的接種比例添加到10kg由麩皮、豆餅、玉米粉、黑茶粉按照質(zhì)量比8:1:0.5:0.5混合制得的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在初期溫度32 0C，24小時(shí)后候?qū)囟日{(diào)節(jié)到35 °C-37 °C，pH自然的條件下連續(xù)培養(yǎng)5-7天;培養(yǎng)結(jié)束后，在55-65 °C干燥，獲得產(chǎn)物有效活性菌3 2xl09cfu/g，含水量15%_20%，經(jīng)鏈條式粉碎機(jī)粉碎，過60-100目篩，制得多功能復(fù)合微生物菌劑。
[0012]本發(fā)明所述的微生物種群可以是細(xì)菌、真菌、放線菌等，所述的微生物種子可以是自然分離與選育菌株，也可以在國家微生物保藏中心購買獲得。
[0013]采用本發(fā)明方法制備得到的多功能生物菌劑可應(yīng)用于有機(jī)物料腐熟劑處理固體有機(jī)廢棄物，也可以用作生態(tài)飼料添加劑，添加到飼料中，還可以用作生物肥料。
[0014]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下:
(1)經(jīng)混菌培育后得到的芽孢桿菌或者真菌混合液體種子，連續(xù)直接擴(kuò)大培養(yǎng)，可直接成為復(fù)合菌劑產(chǎn)品；
(2)經(jīng)混菌培育后得到的芽孢桿菌或者真菌混合液體種子經(jīng)脫水干燥保存后，可與多種微生物混合制備各種復(fù)合微生物菌劑；
(3)實(shí)現(xiàn)了多菌種的混菌培養(yǎng)，節(jié)約投資，工藝簡單，操作方便，可降低微生物菌劑生產(chǎn)成本40%-60%，經(jīng)濟(jì)效益十分明顯；
(4)因微生物在共同的生態(tài)系統(tǒng)中繁殖，形成了良好的互生、共生、共代謝關(guān)系，新的復(fù)合酶系自然形成，對(duì)開發(fā)新型多功能微生物菌劑提供了新的方法與技術(shù)路線。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。
[0016]實(shí)施例1具體制備復(fù)合微生物菌劑產(chǎn)品:本實(shí)施例所用菌種來源于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，菌種及編號(hào)為:枯草芽孢桿菌CGMCCl.1086、多粘芽孢桿菌CGMCCl.0548、巨大芽孢桿菌CGMCCl.0217、嗜熱脂肪芽孢桿菌CGMCCl.3380、黑曲霉CGMCC3.0316、冠突散囊菌 CGMCC3.0448。
[0017]采用以下步驟實(shí)現(xiàn):
步驟一:建立小型微生物生態(tài)系統(tǒng)，包括自然培養(yǎng)物制備、初始培養(yǎng)液制備、初始培養(yǎng)液滅菌、無菌試驗(yàn)、小型微生態(tài)系統(tǒng)形成與混菌種子生產(chǎn)；
(1)自然培養(yǎng)物制備:
①按照重量百分比計(jì)，100g自然培養(yǎng)物含有的物質(zhì)及比例為:動(dòng)物新鮮糞便40%、活性污泥10%、過篩40-60目自然土壤10%、細(xì)度80目的秸桿粉10%、過篩40-60目有機(jī)垃圾5%、糖渣20%、普通啤酒5L;
②將動(dòng)物新鮮糞便、活性污泥、過篩40-60目自然土壤、細(xì)度80目秸桿粉、過篩40-60目有機(jī)垃圾、糖渣混合成均勻的初始原基，然后將初始原基與5L啤酒初步混合均勻，將混合過含啤酒的初始原基置于攪拌器中攪拌混合10分鐘，均勻后制備成自然培養(yǎng)物，置于容器中備用;
(2)初始培養(yǎng)液制備:將上述備用自然培養(yǎng)物加熱煮沸30分鐘，靜置冷卻4小時(shí)，待比重大于水的物質(zhì)沉淀，器皿中上液處于微透明、小顆粒物半懸浮狀時(shí)，過濾后取液體轉(zhuǎn)入體積為I L三角瓶中，每個(gè)三角瓶裝液量為500ml，作為初始培養(yǎng)液備用；
(3)初始培養(yǎng)液滅菌:將裝有初始培養(yǎng)液的三角瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋，在蒸汽壓力1.05kg/cm2、溫度121°C，滅菌50min，滅菌結(jié)束后備用；
(4)無菌試驗(yàn):在無菌條件下，取備用滅菌后的初始培養(yǎng)液2-5ml，接入無菌平皿中，放入恒溫培養(yǎng)箱35 0C -37 0C度恒溫培養(yǎng)18-24小時(shí)，無微生物長出，則將步驟(3)滅菌后的初始培養(yǎng)液作為無菌的初始培養(yǎng)液使用;如有微生物生長，則按步驟(I )-(4)重新制備；
(5)小型微生態(tài)系統(tǒng)形成與混菌種子生產(chǎn)
①將步驟(1)-(4)制得無菌的初始培養(yǎng)液在潔凈條件下分裝于8個(gè)滅菌后的三角瓶中，菌種pH自然，每個(gè)三角瓶內(nèi)形成獨(dú)立的小型生態(tài)體系；
②在潔凈條件下，分別將枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌接種到三角瓶中，每2個(gè)三角瓶接種同一種菌種，接種完畢放入無菌箱常溫下自然生長18-24小時(shí)；
③18-24小時(shí)后，取出無菌箱中的三角瓶，在潔凈條件下按照等體積比1:1: 1:1依次混合，然后轉(zhuǎn)入無菌容器，在無菌容器中形成具有多種微生物種及多種微生物群落的小型微生物生態(tài)系統(tǒng);將無菌容器放置于潔凈環(huán)境中常溫自然培育10-16小時(shí)后成為混菌種子取出，置于冰箱4°C保存?zhèn)溆?或者脫水干燥后保存復(fù)合微生物休眠菌體)；
步驟二:同步采用常規(guī)方法生產(chǎn)分解不同植物材料酶類的真菌搖瓶種子，選擇真菌菌種為黑曲霉菌、冠突散囊菌，分別制作PM斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基，將黑曲霉、冠突散囊菌菌種分別接種至PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得斜面活菌種，然后將斜面活菌種轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，獲得液態(tài)真菌種子，再將液態(tài)真菌種子轉(zhuǎn)接于產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別獲得黑曲霉液態(tài)種子和冠突散囊菌液態(tài)種子，保存，備用，具體制備方法如下:
(1)按以下培養(yǎng)基配方采用常規(guī)方法分別制備PDA斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基:
①PDA斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，其做法是稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水100ml煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過濾，再加15g葡萄糖和18g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每試管約10ml，121°C滅菌20分鐘后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆茫?br> ②種子培養(yǎng)基:可溶性淀粉2%，葡萄糖I % ,KH2PO4 0.2% ,MgSO4 0.2%,酵母膏0.5-
0.75% ,NaNO30.3%，自然pH,121 °C高壓滅菌20min；
③產(chǎn)酶培養(yǎng)基:麥皮4-6%，(NH4)2S040.2%，ΚΗ2Ρθ4θ.3%，醋酸鈉0.1%，抗壞血酸
0.1% ,MgSO40.2%,尿素 0.3 %，自然 pH ,121 °C 高壓滅菌 20min ；
(2)種子活化培養(yǎng):將黑曲霉液態(tài)種子接種到活化培養(yǎng)搖瓶中，活化配方為:蛋白胨5.2 g/L，葡萄糖12g/L，硫酸鎂0.5 g/L，酵母浸出粉2.0g/L，磷酸氫二鉀2g/L，pH7.0-7.2營養(yǎng)液，搖瓶轉(zhuǎn)速為100-160rpm，在23-35 °C溫度下培養(yǎng)25h_28h，獲得液體發(fā)酵種子，即得黑曲霉真菌搖瓶種子;將冠突散囊菌液態(tài)種子接種到活化培養(yǎng)搖瓶中活化培養(yǎng)，搖瓶中營養(yǎng)液配方為:蔗糖70g/L、黑茶浸提液0.9%、磷酸氫二鉀4g/L，pH5.5-6.5，搖瓶轉(zhuǎn)速為120rpm，在26-32°C下培養(yǎng)90-100小時(shí)，獲得液體發(fā)酵種子，即冠突散囊菌的真菌搖瓶種子；
步驟三:多菌種混菌培育
(1)復(fù)合菌群芽孢桿菌種子培育:將步驟一第(5)項(xiàng)第③步中置于冰箱4°C保存?zhèn)溆玫目莶菅挎邨U菌、多粘芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌混菌種子分裝在含有初始培養(yǎng)液的5-10個(gè)三角瓶中，三角瓶體積為1L，裝液量為500ml。在活化搖床上振蕩變溫培養(yǎng)40-72h，振蕩變溫培養(yǎng)條件如下:搖床轉(zhuǎn)速160-200r/min，初始溫度為20°C，每隔3小時(shí)上調(diào)1-2°C，當(dāng)溫度上調(diào)至38 土 1°C時(shí)，停止上調(diào);振蕩變溫培養(yǎng)結(jié)束，獲得液體發(fā)酵復(fù)合種子液；然后將液體發(fā)酵種子液按照10%的接種比例(v/w，ml /g )接種到I Okg由麩皮、米糠、豆餅、玉米粉按照質(zhì)量比10:1: 3: 2混合制備固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在37°C下培養(yǎng)3天，得到主要復(fù)合菌群芽孢桿菌固體種子；
(2)真菌菌群黑曲霉固體種子及冠突散囊菌固體種子培育: ①將黑曲霉的真菌搖瓶種子按照10%的接種比例(v/w，ml/g)接種到5kg由麩皮、米糠、豆餅、馬鈴薯粉按照質(zhì)量比7:1:1:1混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在37°C下培養(yǎng)培養(yǎng)3天，得到黑曲霉固體種子；
②將冠突散囊菌的真菌搖瓶種子按照5%的接種比例(v/w，ml/g)接種到5kg由黑茶粉、甘蔗粉按照質(zhì)量比1:1混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，初期溫度25°C，48小時(shí)后，將溫度調(diào)節(jié)到28°(:-32°(:，濕度為70%，？!1值調(diào)節(jié)至5-5.5，連續(xù)培養(yǎng)5天，得到冠突散囊菌固體種子；
③固體擴(kuò)大培養(yǎng):將上述制備得到的主要復(fù)合菌群芽孢桿菌固體種子、輔助菌群黑曲霉固體種子、冠突散囊菌固體種子按照重量比7:2:1均勻混合，按照6-8%的接種比例添加到10kg由麩皮、豆餅、玉米粉、黑茶粉按照質(zhì)量比8:1:0.5:0.5混合制得的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在初期溫度32 0C，24小時(shí)后候?qū)囟日{(diào)節(jié)到35 °C-37 °C，pH自然的條件下連續(xù)培養(yǎng)5-7天;培養(yǎng)結(jié)束后，在55-65 °C干燥，獲得產(chǎn)物有效活性菌3 2xl09cfu/g，含水量15%_20%，經(jīng)鏈條式粉碎機(jī)粉碎，過60-100目篩，制得多功能復(fù)合微生物菌劑。
[0018]實(shí)施例2多功能復(fù)合微生物菌劑在農(nóng)業(yè)與環(huán)境領(lǐng)域中的應(yīng)用:本發(fā)明制備得到的多功能復(fù)合微生物菌劑具有很好的生物酶活性，經(jīng)測定，其中的纖維素酶、糖化酶、淀粉酶性、尿素酶、蛋白酶、果膠酶、木聚糖酶、超氧化物歧化酶(S0D)、脂肪酶、植酸酶等酶活性很高，各種酶活在280-3501]/^之間；生物毒素如黃曲霉毒素(81、82、61、62)、赭曲霉毒素、霉菌毒素等未檢出；其他國家規(guī)定的生物肥料及生物發(fā)酵劑相關(guān)的指標(biāo)全部合格。本發(fā)明制備得到的多功能復(fù)合微生物菌劑主要的應(yīng)用方式可以是:(I)作為有機(jī)物料腐熟劑處理固體有機(jī)廢棄物，實(shí)現(xiàn)固體有機(jī)廢棄物的資源化利用；(2)作為生態(tài)飼料添加劑使用；(3)作為生物肥料使用，對(duì)這幾種應(yīng)用方式的說明如下。
[0019]—、作為有機(jī)物料腐熟劑處理固體有機(jī)廢棄物
1、基本原理:畜禽糞便+秸桿+有機(jī)垃圾+多功能生物菌劑=清潔化+資源化
(1)畜禽糞便+秸桿+有機(jī)垃圾是由含氮的有機(jī)物(蛋白質(zhì)類——氨基酸，非蛋白質(zhì)類一一尿酸，尿素，馬尿酸)、碳水化合物(多糖類一一淀粉，纖維素，半纖維素，木質(zhì)素，果膠質(zhì)，雙糖類一一麥芽糖，蔗糖，乳糖，單糖類一一葡萄糖，半乳糖，果糖，木糖，甘露糖);脂類(脂肪一一甘油，脂肪酸)、磷類物質(zhì)(磷脂，核酸，植酸)、硫物質(zhì)(半胱氨酸，亮氨酸，維生素B，硫安素，生物素，硫辛酸素)等組成；
(2)蛋白質(zhì)的分解:蛋白質(zhì)在蛋白酶的作用下分解成多肽，二肽(氨基酸)。微生物在生長及代謝過程中產(chǎn)生特定的酶，每一種微生物產(chǎn)生不同的酶，是酶在起作用。酶就像是催化劑，如人體的膽質(zhì)分解脂肪一樣。微生物量越多分泌的酶越多，作用越強(qiáng)。氨基酸在脫氨基酶的作用下產(chǎn)生氨，羧酸，酮酸;在脫羧基酶的作用下，產(chǎn)生二氧化碳，胺類物質(zhì);在氨氧化酶的作用下變成醛;醛在有氧的條件下生成有機(jī)酸。氨基酸在厭氧條件下分解(稱為腐敗作用)產(chǎn)生強(qiáng)力惡臭，因要形成大量中間產(chǎn)物，如硫醇，酪酸，吲哚，甲醛吲哚，硫化氫和氨氮等。氨基酸在有氧條件下分解(稱為腐化作用)甲烷，CO2，氨，水和氫，這就要求不斷地翻堆充氧；
(3)非蛋白質(zhì)的分解，非蛋白物質(zhì)在有氧條件下，分解成氨和C02，然后在硝化細(xì)菌的作用下，變成硝態(tài)氨(無機(jī)氮)可供植物直接吸收(鏈霉素，諾卡氏，青霉素等)。硝化細(xì)菌都是典型的好氣型自養(yǎng)微生物，能利用化學(xué)反應(yīng)放出的能量將CO2合成有機(jī)物。同時(shí)在厭氧的條件下，還有一類細(xì)菌對(duì)硝態(tài)氮進(jìn)行反硝化作用，即把硝酸鹽還原成氮或中間產(chǎn)物亞硝酸鹽、氨等過程，其結(jié)果會(huì)造成糞尿中的氮流失；
(3)碳水化合物的分解:淀粉、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠質(zhì)在不同的微生物酶的作用下，由多糖水解成雙糖，水解成單糖，氧化成葡萄糖，葡萄糖在有氧化條件下，生成CO2、水、ATP，大量能量(發(fā)熱)，在厭氧條件下，產(chǎn)生有機(jī)酸、醇類、甲烷、⑶2、氫(芽胞桿菌、霉菌、放線菌等)；
(4)脂肪在有氧條件下，在脂肪酶的作用下產(chǎn)生甘油，通過多次分解最后生成C02、水、能量(ATP、發(fā)熱);脂肪酸在氧化條件下最后也產(chǎn)生C02、水、能量；
(5)脂類(卵磷脂、腦磷脂)通過各種酶的作用，變成甘油、脂肪酸、磷酸、膽堿、膽氨再進(jìn)入以上循環(huán)；
(6)磷類物質(zhì)分解，磷脂核酸在核酸酶的作用下，變成核苷酸，水解無機(jī)磷(核苷、磷酸)被植物吸收。植酸在植酸酶的作用下，變成磷酸、肌醇；
(7)含硫物質(zhì)，含硫物質(zhì)在好氧的條件下，最后產(chǎn)生硫酸根和某些重金屬反應(yīng)產(chǎn)生鹽類，也可被微生物同化，結(jié)合進(jìn)生物量中；在無氧條件下產(chǎn)生硫化氫(臭雞蛋味)。
2、采用本發(fā)明的多功能微生物菌劑處理固體有機(jī)廢棄物的方法:將本發(fā)明多功能復(fù)合微生物菌劑加入到固體廢棄物中，混合均勻，將固體有機(jī)廢棄物進(jìn)行腐熟制備有機(jī)肥。例如:按照重量百分比配制需要發(fā)酵處理的污染環(huán)境的固體有機(jī)廢棄物，如畜禽糞便55-70%、秸桿15-20%、有機(jī)垃圾5-20%，然后加入本發(fā)明的多功能微生物菌劑0.01-0.05%，混合均勻，C/N控制在20-25:1范圍，水分含量控制在60%以下，建堆高度1.5米-1.8米，寬度2_5米，長度依據(jù)場地條件設(shè)定，保證氧氣供應(yīng)，堆溫達(dá)到60°C左右，24-48小時(shí)內(nèi)翻堆一次。一般72小時(shí)內(nèi)脫臭，10-15天腐熟，直接作為有機(jī)肥使用。
[0020]此應(yīng)用方式既解決了環(huán)境污染問題，又實(shí)現(xiàn)了廢棄物的資源利用。
[0021]二、作為生態(tài)飼料添加劑使用:將本發(fā)明的多功能復(fù)合微生物菌劑添加到飼料中，添加量0.1%-0.5%(質(zhì)量百分比)，疫病流行期、應(yīng)激、疾病治療、換料期間添加量適當(dāng)增加到1%。
[0022]此種應(yīng)用方式可以實(shí)現(xiàn):
①抑制有害菌的繁殖，使腸內(nèi)菌群保持平衡;抑制和阻止腸內(nèi)有害菌的繁殖，使有益菌數(shù)量占據(jù)優(yōu)勢;可以抑制病原大腸菌、梭狀芽胞桿菌、沙門氏菌、β溶血性類細(xì)菌等的繁殖；
②產(chǎn)生消化酶，合成維生素，可以產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶等消化酶以及維生素B群，另外維生素A的合成也已被證實(shí)；
③增強(qiáng)免疫作用，通過刺激腸道內(nèi)免疫系細(xì)胞，增加局部抗體的形成，從而增加巨噬細(xì)胞活性;微生物飼料添加劑可使肝臟內(nèi)大量蓄集有增強(qiáng)免疫作用的維生素Α;
④產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫對(duì)幾種潛在的病原微生物均有損害作用，它是由一些特殊的物質(zhì)在一些基質(zhì)上形成的；
⑤優(yōu)化生態(tài)環(huán)境:益生素、酶制劑在動(dòng)物腸道代謝過程中，分解了不易被動(dòng)物吸收利用的粗蛋白質(zhì)、植酸酶及抗?fàn)I養(yǎng)因子，明顯防治了蠅蛆的滋生，有效切斷了氨氣、臭氣的來源，使動(dòng)物糞便中有害氣體的濃度得到了有效降低，改善了飼養(yǎng)環(huán)境，降低了氨氣對(duì)人體的侵害，預(yù)防了畜禽呼吸道及腸道疾病的發(fā)生。
[0023]三、作為生物肥料使用:本發(fā)明的多功能復(fù)合微生物菌劑可用作生物肥料，適用于各種農(nóng)作物與經(jīng)濟(jì)作物，每畝使用2-3公斤，可做基肥與追肥;配合有機(jī)肥料使用效果更佳，每畝作物區(qū)配合施用有機(jī)肥料200-250公斤。復(fù)合微生物菌劑作為生物肥料使用，具有以下優(yōu)勢與功效。
[0024]1.改良土壤
(1)通過有益菌的大量繁殖，大量有益菌在植物的根系周圍形成了優(yōu)勢種群，抑制了其他有害菌的生命活動(dòng)；
(2)快速分解土壤有機(jī)物質(zhì)，促進(jìn)土壤團(tuán)粒的形成，且通過有益菌的活動(dòng)能夠疏松土壤，土壤的保肥、供肥、保水、供水及透氣性都得到很好的調(diào)節(jié)；
(3)分解土壤中的農(nóng)藥殘留，避免殘留農(nóng)藥對(duì)下季作物產(chǎn)生藥害。還對(duì)植物生長過程通過根系排放的有害物質(zhì)進(jìn)行分解。
[0025]2.固氮、解磷、解鉀功能。能夠部分利用空氣中的氮，通過有益菌生長代謝產(chǎn)生相應(yīng)的酶和酸，可對(duì)土壤中難溶性的磷、鉀肥(土壤中難溶性磷肥占95%，難溶性鉀占98%)進(jìn)行分解，從而成為植物所能吸收的磷鉀肥。因此能夠大大提高作物對(duì)肥料的利用率，從而減少肥料的施用。
[0026]3.提高作物品質(zhì)。解磷、解鉀的同時(shí)，能夠促使土壤中微量元素的釋放，被作物所利用，同時(shí)有益菌代謝產(chǎn)生多種植物所需的物質(zhì)，如小分子氨基酸、生長刺激物質(zhì)、維生素等。
[0027]4.達(dá)到生物防治病害的效果，灌根可抑制土壤中的病菌，噴到葉面，可防止病害的入侵。
[0028]5.促進(jìn)作物早熟和延長采收期。由于土壤理化性質(zhì)得到改善，土壤養(yǎng)分豐富且平衡，土壤中肥料能夠更好的被作物很好的吸收，因此能夠促進(jìn)作物早熟和延長采收期。
[0029]6.和有機(jī)肥配合使用，能夠持續(xù)不斷的改良土壤，2-3年就可使土壤完全達(dá)到生產(chǎn)有機(jī)作物的標(biāo)準(zhǔn)，且因?yàn)橛幸婢軌蚩焖俜纸庥袡C(jī)物質(zhì)為作物吸收，所以克服了有機(jī)肥料肥效慢的特點(diǎn)，單施有機(jī)肥產(chǎn)量低的特點(diǎn)。
[0030]7.生物菌肥不像化肥那樣，一次性將過量的可溶性營養(yǎng)元素帶入土壤，生物菌肥可避免環(huán)境污染，且有益菌不斷的在植物根系周圍不斷的繁殖代謝，持續(xù)地、非過量的向作物提供營養(yǎng)。
[0031]8.經(jīng)田間使用試驗(yàn)，對(duì)作物品質(zhì)具有明顯的改善作用。施用多功能生物菌劑的蔬菜硝酸鹽含量減少38.9?67.lmg/kg，比傳統(tǒng)施肥降低約30%;維生素C含量增加了 139.5mg/kg，糖分含量平均增加了 8.3mg/kg。
[0032]9.增產(chǎn)效果，在作物區(qū)與化肥結(jié)合施用條件下，比傳統(tǒng)化肥施用方式增產(chǎn)8%?10%，占增產(chǎn)總數(shù)的27.9.%，增產(chǎn)10%?15%的占到24.8%，增產(chǎn)15%?20%的占23.2%，增產(chǎn)20%以上的占24.1%。
[0033]本發(fā)明的多功能復(fù)合微生物菌劑，除了上述幾種常見的應(yīng)用方式，也可以進(jìn)一步開發(fā)其在農(nóng)業(yè)與環(huán)境技術(shù)領(lǐng)域中的其他應(yīng)用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.小型微生物生態(tài)系統(tǒng)法制備多功能復(fù)合微生物菌劑的方法，其特征在于:采用小型微生物生態(tài)系統(tǒng)法實(shí)現(xiàn)，所述小型微生物生態(tài)系統(tǒng)法包括如下步驟: 步驟一:建立小型微生物生態(tài)系統(tǒng)，將三種以上互不拮抗的微生物種子接種到小型微生物生態(tài)系統(tǒng)混合培養(yǎng)，培育能互生、共生、共代謝良好的微生物群，共同在同一環(huán)境中增殖，獲得多種微生物群落的復(fù)合菌體，將復(fù)合菌體搖瓶培養(yǎng)，獲得復(fù)合菌群種子； 步驟二:采用常規(guī)方法生產(chǎn)分解不同植物材料酶類的真菌搖瓶種子； 步驟三:將復(fù)合菌群種子與真菌搖瓶種子接種到固體營養(yǎng)基，經(jīng)接種好的固體營養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后制備成多功能復(fù)合微生物菌劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:包括如下具體步驟: 步驟一:建立小型微生物生態(tài)系統(tǒng)，包括自然培養(yǎng)物制備、初始培養(yǎng)液制備、初始培養(yǎng)液滅菌、無菌試驗(yàn)、小型微生態(tài)系統(tǒng)形成: (1)自然培養(yǎng)物制備: ①按照重量百分比計(jì)，100g自然培養(yǎng)物含有的物質(zhì)及比例為:動(dòng)物新鮮糞便30%-50%、活性污泥5%_10%、過篩40-60目自然土壤5%-10%、細(xì)度80目的秸桿粉10%_15%、過篩40-60目有機(jī)垃圾5%-10%、糖渣15%-20%、普通啤酒5L ； ②將動(dòng)物新鮮糞便、活性污泥、過篩40-60目自然土壤、細(xì)度80目秸桿粉、過篩40-60目有機(jī)垃圾、糖渣混合成均勻的初始原基，然后將初始原基與5L啤酒初步混合均勻，將混合過含啤酒的初始原基置于攪拌器中攪拌混合5-10分鐘，均勻后制備成自然培養(yǎng)物，置于容器中備用； (2)初始培養(yǎng)液制備:將上述備用自然培養(yǎng)物加熱煮沸30-40分鐘，靜置冷卻2-5小時(shí)，待比重大于水的物質(zhì)沉淀，器皿中上液處于微透明、小顆粒物半懸浮狀時(shí)，過濾后取液體轉(zhuǎn)入體積為I L三角瓶中，每個(gè)三角瓶裝液量為500ml，作為初始培養(yǎng)液備用； (3)初始培養(yǎng)液滅菌:將裝有初始培養(yǎng)液的三角瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋，在蒸汽壓力1.051^/0112、溫度121<€，滅菌40?50111；[11，滅菌結(jié)束后備用； (4)無菌試驗(yàn):在無菌條件下，取備用滅菌后的初始培養(yǎng)液2-5ml，接入無菌平皿中，放入恒溫培養(yǎng)箱35 0C -37 0C度恒溫培養(yǎng)18-24小時(shí)，無微生物長出，則將步驟(3)滅菌后的初始培養(yǎng)液作為無菌的初始培養(yǎng)液使用;如有微生物生長，則按步驟(I )-(4)重新制備； (5)小型微生態(tài)系統(tǒng)形成 ①將無菌的初始培養(yǎng)液在潔凈條件下分裝于滅菌后的5個(gè)三角瓶中，三角瓶的體積為500ml，每個(gè)三角瓶的裝液量為250ml;在自然pH條件下，在每個(gè)三角瓶內(nèi)形成獨(dú)立的小型生態(tài)體系； ②在潔凈條件下，每個(gè)三角瓶中接種1-5種互不拮抗的微生物，放入無菌箱常溫下自然生長18-24小時(shí);所述微生物為芽孢桿菌或者真菌中的一種； ③18-24小時(shí)后，取出無菌箱中經(jīng)步驟②處理的三角瓶，在潔凈條件下按照等體積、等比例混合，然后將三角瓶內(nèi)物質(zhì)全部轉(zhuǎn)入無菌容器;將無菌容器密閉，放置于潔凈環(huán)境中常溫自然培育10-16小時(shí)，得多菌種混菌液，備用;或?qū)o菌容器中的芽孢桿菌或者真菌經(jīng)脫水干燥，獲得復(fù)合微生物的休眠菌體； 步驟二:采用常規(guī)方法生產(chǎn)分解不同植物材料酶類的真菌搖瓶種子: (I)分別制作PDA斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基，將真菌菌種接種至PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得真菌斜面活菌種，然后將真菌斜面活菌種轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，獲得液態(tài)真菌種子，再將液態(tài)真菌種子轉(zhuǎn)接于產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得生產(chǎn)分解不同植物材料特定酶類的真菌液態(tài)種子，保存，備用； (2)種子活化培養(yǎng):將真菌液態(tài)種子接種到活化培養(yǎng)搖瓶中，活化培養(yǎng)獲得液體發(fā)酵種子，即制得真菌搖瓶種子； 步驟三:多菌種混菌培育 (1)復(fù)合菌種子制備:將步驟一常溫自然培育的多菌種混菌液，在潔凈條件下分裝在滅菌后的三角瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)24-72小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速100-200r/min，培養(yǎng)初始溫度為常溫，每隔3小時(shí)升溫1-2 0C，培育24-72小時(shí)后，當(dāng)搖瓶中微生物數(shù)量彡2x107cfu/ml時(shí)，得到活化的搖瓶復(fù)合微生物種子;所述搖床振蕩培養(yǎng)時(shí)，當(dāng)接種微生物為芽孢桿菌時(shí)，培養(yǎng)溫度38± 1°C時(shí)，停止升溫，當(dāng)接種微生物為真菌時(shí)，培養(yǎng)溫度控制在23-35°C ; (2)復(fù)合微生物菌劑制備:將步驟二得到的真菌搖瓶種子與步驟三(I)中得到的復(fù)合微生物種子按照8-10%( v/w，ml/g)的接種量接種到固體培養(yǎng)基中，固體培養(yǎng)基由麩皮50%-70%、豆餅10%-15%、糖渣5%-10%、秸桿粉5%-10%、食品加工下腳料5%-10%按照重量百分比制備而成;所述食品加工下腳料為黑茶粉、甘蔗粉、馬鈴薯粉、木薯粉中的一種或幾種;復(fù)合微生物種子接種到固體培養(yǎng)基后，在發(fā)酵室固態(tài)發(fā)酵48-96小時(shí)，獲得固體復(fù)合微生物種子；用獲得的固體復(fù)合微生物種子繼續(xù)接種到固體培養(yǎng)基中擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為固體培養(yǎng)基重量的5%-6%，送入發(fā)酵室固態(tài)發(fā)酵48-96小時(shí)，發(fā)酵過程溫度控制在32-37°C，水分控制在60-65%，pH自然;擴(kuò)大發(fā)酵結(jié)束后，微生物數(shù)量彡2xl08cfu/g時(shí)，55-60°C干燥，水分控制在15%-20%;經(jīng)粉碎、過篩至60-80目，獲得多功能復(fù)合微生物菌劑，常溫保存。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:采用該方法制備多功能復(fù)合微生物菌的具體步驟如下: 步驟一:建立小型微生物生態(tài)系統(tǒng)，包括自然培養(yǎng)物制備、初始培養(yǎng)液制備、初始培養(yǎng)液滅菌、無菌試驗(yàn)、小型微生態(tài)系統(tǒng)形成； (1)自然培養(yǎng)物制備 ①按以下重量百分比制備自然培養(yǎng)物，100g自然培養(yǎng)物含有的物質(zhì)及比例為:動(dòng)物新鮮糞便30%_50%、活性污泥5%-10%、過篩40-60目自然土壤5%_10%、細(xì)度80目秸桿粉10%_15%、過篩40-60目有機(jī)垃圾5%-10%、糖渣15%-20%、普通啤酒5L; ②自然培養(yǎng)物的制備方法:將動(dòng)物新鮮糞便、活性污泥、過篩40-60目自然土壤、細(xì)度80目秸桿粉、過篩40-60目有機(jī)垃圾、糖渣混合成均勻的初始原基，然后將初始與5L啤酒初步混合均勻，將混合過含啤酒的初始原基置于攪拌器中攪拌混合5-10分鐘，均勻后制備成自然培養(yǎng)物，置于容器中備用； (2)始培養(yǎng)液制備:將上述備用自然培養(yǎng)物加熱煮沸30-40分鐘，靜置冷卻2-5小時(shí)，待比重大于水的物質(zhì)沉淀，器皿中上液處于微透明、小顆粒物半懸浮狀時(shí)，過濾后取上部分液體，轉(zhuǎn)入3-5個(gè)I L三角瓶中作為初始培養(yǎng)液備用； (3)初始培養(yǎng)液滅菌:將初始培養(yǎng)液放入高壓蒸汽滅菌鍋，在蒸汽壓力1.05kg/cm2、溫度121°C條件下，滅菌40?50min，滅菌結(jié)束后，備用； (4)無菌試驗(yàn):取步驟(3)的滅菌后的初始培養(yǎng)液0.5-lml，直接在準(zhǔn)備好的無菌LB培養(yǎng)基平皿中，35°C-37°(:恒溫培養(yǎng)18-24小時(shí)，無微生物長出，獲得無菌的初始培養(yǎng)液;如有微生物生長，重新按步驟(I )-(4)制備； (5)小型微生態(tài)系統(tǒng)形成 ①將步驟(1)-(4)制得無菌的初始培養(yǎng)液在潔凈條件下分裝于8個(gè)滅菌后的三角瓶中，菌種pH自然，每個(gè)三角瓶內(nèi)形成獨(dú)立的小型生態(tài)體系； ②在潔凈條件下，分別將枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌接種到三角瓶中，每2個(gè)三角瓶接種同一種菌種，接種完畢放入無菌箱常溫下自然生長18-24小時(shí)； ③18-24小時(shí)后，取出無菌箱中的三角瓶，在潔凈條件下按照等體積比1:1:1: I依次混合，然后轉(zhuǎn)入無菌容器，在無菌容器中形成具有多種微生物種及多種微生物群落的小型微生物生態(tài)系統(tǒng);將無菌容器放置于潔凈環(huán)境中常溫自然培育10-16小時(shí)后成為多菌種混菌液，取出，置于冰箱4°C保存?zhèn)溆?；或者將混菌種子脫水干燥后保存，得復(fù)合微生物休眠菌體； 步驟二:同步采用常規(guī)方法生產(chǎn)黑曲霉搖瓶種子、冠突散囊菌搖瓶種子: (1)分別制作PDA斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基，將黑曲霉、冠突散囊菌菌種分別接種至TOA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得斜面活菌種，然后將斜面活菌種轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基進(jìn)行液態(tài)培養(yǎng)，獲得液態(tài)真菌種子，再將液態(tài)真菌種子轉(zhuǎn)接于產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別獲得黑曲霉液態(tài)種子和冠突散囊菌液態(tài)種子，保存，備用； ①PDA斜面培養(yǎng)基制備:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，其做法是稱取200g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水100ml煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過濾，再加15g葡萄糖和18g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過濾，分裝試管，每試管約10ml，121°C滅菌20分鐘后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆茫? ②種子培養(yǎng)基制備:可溶性淀粉2-3%，葡萄糖1-1.5%,KH2PO4 0.1-0.25% ,MgSO4 0.Ι-Ο.3% ，酵母膏0.5-0.75% ,NaNO3 0.2-0.35%，自然pH，121°C高壓滅菌20min; ③產(chǎn)酶培養(yǎng)基制備:麥皮4-6 %, (NH4)2SO4 0.1-0.2% ,KH2PO40.2-0.35 %，醋酸鈉 0.1-0.2%，抗壞血酸0.1-0.2%，]\%504 0.15-0.25%，尿素0.25-0.5%，自然口!1，121°(:高壓滅菌20min； (2)種子活化培養(yǎng):將黑曲霉液態(tài)種子接種到活化培養(yǎng)搖瓶中，活化配方為:蛋白胨5.0-5.5 g/L，葡萄糖 10.0-15 g/L，硫酸鎂 0.5-0.8 g/L，酵母浸出粉 2.0 _3.0g/L，磷酸氫二鉀l-3g/L，pH7.0-7.2營養(yǎng)液中，搖瓶轉(zhuǎn)速為100-160rpm，在23-35°C溫度下培養(yǎng)25h-28h，獲得液體發(fā)酵種子，即得黑曲霉搖瓶種子;將冠突散囊菌液態(tài)種子接種到活化培養(yǎng)搖瓶中活化培養(yǎng)，搖瓶中營養(yǎng)液配方為:蔗糖60-80g/L、100目細(xì)度黑茶粉10-20g/L或者黑茶浸提液0.8-1%、磷酸氫二鉀3-5g/L，pH5.5-6.5，搖瓶轉(zhuǎn)速為100_130印111，在26-32°(:下培養(yǎng)90-100小時(shí)，獲得液體發(fā)酵種子，即冠突散囊菌的搖瓶種子； 步驟三:多菌種混菌培育 (I)復(fù)合菌群芽孢桿菌種子培育:將步驟一第(5)項(xiàng)第③步獲得的多菌種混菌液分裝在含有初始培養(yǎng)液的5-10個(gè)三角瓶中，三角瓶體積為1L，裝液量為500ml，在活化搖床上振蕩變溫培養(yǎng)40-72h，振蕩變溫培養(yǎng)條件如下:搖床轉(zhuǎn)速160-200r/min，初始溫度為20°C，每隔3小時(shí)上調(diào)1-2°C，當(dāng)溫度上調(diào)至38土 TC時(shí)，停止上調(diào)；振蕩變溫培養(yǎng)結(jié)束，獲得液體發(fā)酵復(fù)合種子液;然后將液體發(fā)酵種子液按照10%的接種比例(v/w，ml/g)接種到1kg由麩皮、米糠、豆餅、玉米粉按照質(zhì)量比10: 1:3:2混合制備的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在37 °C下培養(yǎng)3天，得到主要復(fù)合菌群芽孢桿菌固體種子； (2)真菌菌群黑曲霉及冠突散囊菌種子培育: ①將黑曲霉的搖瓶種子按照10%的接種比例(v/w，ml/g )接種到5kg由麩皮、米糠、豆餅、馬鈴薯粉按照質(zhì)量比7:1:1:1混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在37°C下培養(yǎng)培養(yǎng)3天，得到黑曲霉固體種子； ②將冠突散囊菌的搖瓶種子按照5%的接種比例(v/w，ml/g )接種到5kg由黑茶粉、甘鹿粉按照質(zhì)量比1:1混合的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，初期溫度25°C，48小時(shí)后，將溫度調(diào)節(jié)到28°(:-32°(:，濕度為70%，？!1值調(diào)節(jié)至5-5.5，連續(xù)培養(yǎng)5天，得到冠突散囊菌固體種子； ③固體擴(kuò)大培養(yǎng):將上述制備得到的主要復(fù)合菌群芽孢桿菌固體種子、黑曲霉固體種子、冠突散囊菌固體種子按照重量比7:2:1均勻混合，按照6-8%的接種比例添加到10kg由麩皮、豆餅、玉米粉、黑茶粉按照質(zhì)量比8:1:0.5:0.5混合制得的固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在初期溫度32°C，24小時(shí)后候?qū)囟日{(diào)節(jié)到35°C_37°C，pH自然的條件下連續(xù)培養(yǎng)5-7天;培養(yǎng)結(jié)束后，在55-65°C干燥，獲得產(chǎn)物有效活性菌3 2xl09Cfu/g，含水量15%-20%，經(jīng)鏈條式粉碎機(jī)粉碎，過60-100目篩，制得多功能復(fù)合微生物菌劑。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:采用該方法制備得到的多功能復(fù)合微生物菌劑作為有機(jī)物料腐熟劑處理固體有機(jī)廢棄物。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:采用該方法制備得到的多功能復(fù)合微生物菌劑所述用作生態(tài)飼料添加劑。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:采用該方法制備得到的多功能復(fù)合微生物菌劑用作生物肥料。
【文檔編號(hào)】C05F11/08GK106085922SQ201610657751
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月12日 公開號(hào)201610657751.X, CN 106085922 A, CN 106085922A, CN 201610657751, CN-A-106085922, CN106085922 A, CN106085922A, CN201610657751, CN201610657751.X
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