專利名稱：：一種海洋微生物防污涂料的制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種新型的海洋微生物發(fā)酵產(chǎn)物應用于海洋防污領域，制備海洋微生物防污涂料的方法。該方法可實現(xiàn)利用生物原料制備防止海洋生物附著的防污涂料，屬于生物污損防護
技術領域：
。
背景技術：
：海水中存在大量污損生物如貽貝、藤壺、海藻等，這些海生物會附著在船舶的船體、海水冷卻管系、甚至聲納等部位，這種現(xiàn)象統(tǒng)稱為海生物污損。海生物污損會使船舶航行阻力增大，海水冷卻系統(tǒng)換熱效率降低，聲納性能失靈等，嚴重影響著船舶的機動性、安全性。因此采取措施防除海生物的污損對降低船舶的維護費用，保障船舶的安全性有重要意義。目前采用的防止海生物污損的手段主要有電化學方法、電解海水法、涂裝海洋防污涂料和水下機械清洗等。涂裝海洋防污涂料是目前最有效、最方便、最經(jīng)濟的方法，也是目前采用的主要防污損方法。有機錫自拋光防污涂料(SPC)以其優(yōu)良的拋光降阻作用及防污效果，一度得到了廣泛的應用。但由于有機錫對海洋環(huán)境會產(chǎn)生嚴重的污染，使海生物發(fā)生遺傳變異，因此國際海事組織通過決議要求到2008年全面禁用有機錫。拋光型氧化亞銅類防污涂料成為現(xiàn)有技術的主流，雖然符合現(xiàn)在的環(huán)保要求，但由于銅元素會在海洋中，特別是海港中大量積聚，導致海藻等生物的大量死亡，從而破壞生態(tài)平衡，因此最終也將被禁用。由于上述原因，發(fā)達國家的研究機構，包括美國、德國、日本等的研究機構都己經(jīng)開始致力于研究不含重金屬防污劑的防污涂層材料，其中從海生物(海洋細菌、大葉藻、珊瑚等)中提取活性物質，添加到防污涂料中對海洋生物進行驅避，從而達到防污效果是目前的主要研究方法和研究對象。污損生物的膠粘劑在剛分泌出來時，一般是無色、透明液體，不具備粘性，具備被微生物分解的條件。丹麥科學家lbSchneider和KnudAllermann研制篩選出一種蛋白酶能夠水解藤壺從幼蟲到成蟲演變過程中分泌的蛋白膠。美國Mary等人從紋藤壺的細菌生物膜中分離出16種微生物，其中12種具有抑制網(wǎng)紋藤壺幼蟲附著的作用,且大部分防污微生物屬于W6nb種。Holmstrom從被囊動物成體中分離到一中染色后為深綠色的G—菌，稱為D2菌株，D2菌株能夠產(chǎn)生兩種組分，其中低分子量(<500Da)的化合物對幼蟲附著具有強烈抑制作用,高分子量物質對藤壺幼蟲和一些海洋細菌也有一定抑制作用；Kon-ya等人從海綿//a//c/zo"^7'ao&tte'上分離得到一種細菌J/teramo"wsp.并從這種細菌的培養(yǎng)基中提取到了具有抑制網(wǎng)紋藤壺活性的泛酶-8;英國學者也已成功應用捕食性細菌制成涂料取得了防污效果；Grant等2003年由海洋生物表面分離出的細菌，即假單孢菌NUDMB50—11，對紋藤壺幼蟲的附著有顯著的抑制作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有海洋環(huán)境防污損技術存在的缺點，根據(jù)微生物種類的豐富多樣性、微生物對其他生物的拮抗性及微生物易實現(xiàn)低成本大規(guī)模培養(yǎng)的特點，從海洋中分離純化有防污功能的微生物成份再加工制備成防污損涂料，通過其分泌生成的蛋白酶降解污損生物附著時分泌的膠粘蛋白及附著在基材表面的蛋白質消耗營養(yǎng)物，達到抑制污損生物的附著而又不殺死生物體本身的目的；由于蛋白酶可被自然降解生成肽段和氨基酸，沒有任何污染，其制備的防污損涂料是無毒、無害的新型環(huán)保生物防污劑。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明方法包括防污微生物制備、防污蛋白酶制備和微生物防污涂料的制備三個工藝步驟。本發(fā)明涉及的防污微生物制備是先將從海洋環(huán)境中取得的藤壺、貽貝樣品用勻漿器進行勻槳處理，取勻漿10ml放入100ml2216E液體培養(yǎng)基在25'C富集培養(yǎng)24小時，將富集培養(yǎng)的菌液在瓊脂板(磷酸二氫鉀1.8g，磷酸氫二鈉6.5g，氯化鈉0.5g，硫酸鋅O.lg，氯化鈣0.01g，酪素20g，酪素水解氨基酸0.25g，瓊脂100g)上進行劃線分離培養(yǎng)，24小時后觀察培養(yǎng)皿，挑取有水解圈生成的菌落進行進一步分離純化，直到細胞菌落形態(tài)穩(wěn)定一致、細胞顯微觀察形態(tài)一致即得到防污微生物(純菌落)。本發(fā)明涉及的防污蛋白酶制備工藝是將微生物純菌落由斜面培養(yǎng)基接入到液體種子培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)基配方為牛肉膏2-4g,蛋白胨8-15g，氯化鈉3-8g，海水1升，pH7.0-7.2;培養(yǎng)24小時后，將5-10ml種子培養(yǎng)基接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，轉速為100-180轉/min，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米粉20-30g，豆粉30-40g，磷酸氫二鈉l-4g，磷酸二氫鉀0.3g，海水l升；發(fā)酵48小時以后，3000rpm/min離心15-30分鐘；上清液用60%硫酸銨飽和溶液鹽析，靜置24小時，8000rpm/min離心30分鐘；離心后的沉淀用sephadex-G75層析，流動相為水,流速為0.6ml/min，每300秒收集一管；層析后將相同組分合并，減壓冷凍干燥即制得目標活性物防污蛋白酶。本發(fā)明涉及的微生物防污涂料的制備是按重量百分比依次稱取氯化橡膠70-80%，松香12-17%，膨潤土1-4%，活性物防污蛋白酶4-10%，向氯化橡膠溶液中加入松香，攪拌均勻后加入膨潤土，然后用電動攪拌器高速攪拌均勻，最后加入活性物防污蛋白酶，混合均勻即制得微生物防污涂料產(chǎn)品。本發(fā)明制得微生物防污涂料，其工藝過程簡便，生產(chǎn)成本低，防污損效果好，且沒有環(huán)境污染，其產(chǎn)品對藤壺幼蟲附著的抑制率達到76%，對貽貝幼蟲的抑制率可達100%，在南海海域實海掛板40天未見海生物附著。具體實施例方式實施例l:防污微生物的制備將保存的防污微生物菌種用接種針挑取一環(huán)，接種到種子培養(yǎng)基中(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g,海水lL,pH7.0-7.2)，培養(yǎng)24小時后，按5%的接種比例接種到盛有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基250ml三角瓶中，150轉/min，2(TC培養(yǎng)48小時；用紗布粗濾發(fā)酵液；過濾母液8000rpm/min離心30分鐘，沉淀物為防污微生物。實施例2:防污蛋白酶的制備將實施例1制得的防污微生物發(fā)酵液，在6000rpm的轉速下離心15分鐘，取上清液用飽和度為60%的硫酸銨進行鹽析，隔夜靜置后，8000rpm/min，30分鐘離心處理，取沉淀，然后用sephadexG-75層析柱層析，收集相同組分后，進行冷凍干燥。對樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，防污蛋白酶的分子量大約為65Kd。實施例3:微生物防污涂料的制備稱量實施例1中的防污微生物3.5g，向80g氯化橡膠的二甲苯(40/100，W/W)溶液中添加15g松香并加入1.2g膨潤土，用電動攪拌器攪拌10分鐘后，加入經(jīng)過濾、離心的沉淀物(目標活性微生物)3.5g并攪拌均勻，即得微生物防污涂料；將上述制備涂料涂布于A3鋼上，待涂層完全干燥后在海域中掛板40天，掛板表面上未見有海生物生成。實施例4:防污蛋白酶涂料的制備稱取實施例2中的防污蛋白酶16g,氧化鋅2g,丙烯酸樹脂100g。將防污蛋白酶16g添加到100g丙烯酸樹脂中，電動攪拌機混勻，然后加入氧化鋅，混勻。實施例5:目標活性微生物對藤壺的抑制將有成體藤壺的石塊從桶中取出，用自來水沖洗干凈，陰干2個小時，放入盛有新鮮海水的海生物培養(yǎng)箱中，并適當加以光照，過大約半個小時后就有大量藤壺幼蟲釋放出來；當幼蟲大量釋放時，將容器遮起來使其不透光，用LC-1506光導纖維冷光源照亮容器的一側，利用幼蟲的趨光性，用吸管將其吸出，經(jīng)鏡檢為n期無節(jié)幼蟲，轉移到盛有新鮮海水的大燒杯中，在黑暗的環(huán)境下培養(yǎng)，每個大燒杯中盛有大約200只幼蟲，幼蟲密度為1-2個/ml。實驗容器為玻璃培養(yǎng)皿(9cm)，每個培養(yǎng)皿加配制好的目標活性微生物防污劑溶液10ml，選取10只活潑的II期幼蟲，先將幼蟲轉移至一個盛有相應濃度的目標活性微生物防污劑溶液的培養(yǎng)皿中，再轉移到實驗用的培養(yǎng)皿中，以最大限度的減少從大燒杯中帶入的海水量，保持實驗培養(yǎng)皿中的實驗溶液濃度盡可能不變，加入幼蟲時不能使其離水，可用管徑略大于幼蟲體長的玻璃吸管帶水移放，并防止損傷幼蟲，每組設3個平行；實驗期間不投餌、不充氣，實驗中目標活性微生物防污劑的重量百分比濃度為20%,在黑暗處培養(yǎng)24小時后，用顯微鏡觀察并記錄結果，其中對照組10只藤壺中有8只在游動，有兩只沉底；實驗組只有兩只在游動，目標活性微生物對藤壺幼蟲的抑制率為75%。實施例6:目標活性微生物對貽貝的抑制作用在六孔板中各加入10ml海水和10ml含目標活性微生物防污劑的海水(防污微生物的重量含量為20%);在室溫下培養(yǎng)24小時后，分別計數(shù)貽貝的足絲數(shù)目，并列于下表中；表l:防污微生物的貽貝防污結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>從表1中可以看出，在海水中，貽貝幼體的足絲數(shù)目分別達到37和42根，而添加了防污微生物的樣本中則沒有足絲產(chǎn)生，這說明目標活性微生物防污劑對貽貝釋放的形成附著作用的蛋白質足絲起到了非常好的分解作用，抑制了貽貝足絲的形成，對足絲的抑制率達到了100%。權利要求1.一種海洋微生物防污涂料的制備方法，包括防污微生物制備、防污蛋白酶制備和微生物防污涂料制備三個工藝步驟，其特征在于防污微生物制備是先將從海洋環(huán)境中取得的藤壺、貽貝用勻漿器進行勻漿處理，取勻漿放入液體培養(yǎng)基在25℃富集培養(yǎng)24小時，將富集培養(yǎng)的菌液在瓊脂板上進行劃線分離培養(yǎng)24小時后觀察培養(yǎng)皿，挑取有水解圈生成的菌落進行進一步分離純化，直到細胞菌落形態(tài)穩(wěn)定一致、細胞顯微觀察形態(tài)一致即得到防污微生物；防污蛋白酶制備是將微生物純菌落由斜面培養(yǎng)基接入到液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，將種子培養(yǎng)基接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，轉速為100-180轉/min，發(fā)酵48小時以后，3000rpm/min離心15-30分鐘；上清液用60％硫酸銨飽和溶液鹽析，靜置24小時，8000rpm/min離心30分鐘；離心后的沉淀層析，流動相為水，流速為0.6ml/min，每300秒收集一管；層析后將相同組分合并，減壓冷凍干燥即制得目標活性物防污蛋白酶；微生物防污涂料制備是按重量百分比依次稱取氯化橡膠70-80％，松香12-17％，膨潤土1-4％，活性物防污蛋白酶4-10％，向氯化橡膠溶液中加入松香，攪拌均勻后加入膨潤土，然后用電動攪拌器攪拌均勻，最后加入活性物防污蛋白酶，混合均勻即制得微生物防污涂料。2.根據(jù)權利要求1所述的海洋微生物防污涂料的制備方法，其特征在于培養(yǎng)基配方為牛肉膏2-4g，蛋白胨8-15g，氯化鈉3-8g，海水1升，pH7.0-7.2。3.根據(jù)權利要求1所述的海洋微生物防污涂料的制備方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米粉20-30g,豆粉30-40g，磷酸氫二鈉l-4g，磷酸二氫鉀0.3g，海水1升。全文摘要本發(fā)明涉及一種海洋微生物發(fā)酵產(chǎn)物用于制備海洋微生物防污涂料的方法，實現(xiàn)利用生物原料制備防止海洋生物附著的防污涂料，屬于生物污損防護
技術領域：
，包括防污微生物制備、防污蛋白酶制備和微生物防污涂料的制備三個工藝步驟，先將藤壺、貽貝勻漿處理，取勻漿放入液體培養(yǎng)基瓊脂板上劃線分離培養(yǎng)得防污微生物；再將微生物由斜面培養(yǎng)基接入到液體種子培養(yǎng)基中和發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)處理后減壓冷凍干燥得目標活性物防污蛋白酶；最后依次向氯化橡膠溶液中加入松香攪拌均勻后加入膨潤土，然后用電動攪拌均勻后加入活性物防污蛋白酶，混合均勻得微生物防污涂料，其工藝過程簡便，生產(chǎn)成本低，防污損效果好，且沒有環(huán)境污染。文檔編號C09D5/16GK101284956SQ20081001665公開日2008年10月15日申請日期2008年5月30日優(yōu)先權日2008年5月30日發(fā)明者段東霞,藺存國,鄭紀勇申請人:中國船舶重工集團公司第七二五研究所