專利名稱：檢測(cè)中所用的顆粒中的信號(hào)生成的穩(wěn)定化的制作方法
檢測(cè)中所用的顆粒中的信號(hào)生成的穩(wěn)定化背景
本發(fā)明涉及用在測(cè)定樣品中的被分析物的方法、組合物和試劑盒中的能夠生成信號(hào)的顆粒。本發(fā)明還涉及此類顆粒生成的信號(hào)的穩(wěn)定化。臨床診斷領(lǐng)域近年來(lái)在容易和精確測(cè)定的相關(guān)材料的種類以及測(cè)定方法方面都獲得廣泛發(fā)展。大多數(shù)方法涉及與樣品中一種或多種被分析物的存在和/或量相關(guān)的信號(hào)的生成。發(fā)光化合物，如熒光化合物和化學(xué)發(fā)光化合物，由于它們的發(fā)光能力而廣泛用于檢測(cè)領(lǐng)域。顆粒，如膠乳顆粒、脂質(zhì)體等已用于檢測(cè)。染色的膠乳顆粒之前不僅用于免疫測(cè)定，還用于其它多種多樣的用途，如光動(dòng)力學(xué)療法和作為顏料。吸收性染料和產(chǎn)生熒光或化學(xué)發(fā)光性質(zhì)的染料都已被加入顆粒中。在一種特定方法中，包含一種或多種金屬螯合物，例如，鑭系元素螯合物的顆粒用于生成信號(hào)。在美國(guó)專利Nos. 5，340，716和6，251，581中描述了誘導(dǎo)發(fā)光免疫測(cè)定，它們的公開內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。在一種方法中，該檢測(cè)使用包含光敏劑的顆粒和包含化學(xué)發(fā)光化合物的標(biāo)記顆粒。與被分析物的存在相關(guān)地，標(biāo)記顆粒共軛到能結(jié)合到被分析物上的特異性結(jié)合對(duì)(Sbp)成員上以形成絡(luò)合物，或共軛到第二 Sbp成員上以形成絡(luò)合物。如果存在被分析物，光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物靠近。光敏劑生成單態(tài)氧并在這兩種標(biāo)記靠近時(shí)活化化學(xué)發(fā)光化合物?；罨幕瘜W(xué)發(fā)光化合物隨后產(chǎn)生光。產(chǎn)生的光的量與形成的絡(luò)合物的量相關(guān)，后者又與存在的被分析物的量相關(guān)。在一種特定方法中，該化學(xué)發(fā)光顆粒包含一種或多種金屬螯合物，例如，鑭系元素螯合物。在該誘導(dǎo)發(fā)光法的一種變體中，使用包含(a)在照射時(shí)能生成單態(tài)氧的光敏劑和(b)能被單態(tài)氧活化的化學(xué)發(fā)光化合物的微粒載體。該方法能夠生成延遲發(fā)光，其可在照射載體時(shí)實(shí)現(xiàn)。該方法可用于測(cè)定被疑含有被分析物的介質(zhì)中的被分析物。一種方法包括對(duì)被疑含有被分析物的介質(zhì)施以與被分析物的存在相關(guān)地形成Sbp成員的絡(luò)合物的條件并測(cè)定通過(guò)使用具有化學(xué)發(fā)光和光敏劑性質(zhì)的微粒組合物作為標(biāo)記是否已形成Sbp成員絡(luò)合物。在光敏劑性質(zhì)活化時(shí)，生成單態(tài)氧并活化化學(xué)發(fā)光性質(zhì)。在美國(guó)專利No. 5，709，994中描述了這樣的組合物和方法，其相關(guān)公開內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。仍然需要使用于檢測(cè)的標(biāo)記試劑中的信號(hào)生成最大化。對(duì)被分析物濃度變化的信號(hào)響應(yīng)是檢測(cè)發(fā)展中的重要考慮因素。這種標(biāo)記試劑應(yīng)提供最大化性能，包括靈敏性。概沭
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑的穩(wěn)定性的方法，該試劑包含具有與其締合的(having associated therewith)包含金屬和一種或多種螯合劑的絡(luò)合物的化學(xué)發(fā)光組合物的固體載體。該化學(xué)發(fā)光試劑存在于介質(zhì)中。該方法包括以足以增強(qiáng)該固體載體的化學(xué)發(fā)光試劑的穩(wěn)定性的量在該介質(zhì)中加入一種或多種穩(wěn)定劑，其可以是螯合劑和/或金屬螯合物，例如該絡(luò)合物本身。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是用于測(cè)定被疑含有被分析物的樣品中被分析物的存在和/或量的化學(xué)發(fā)光試劑。該化學(xué)發(fā)光試劑存在于介質(zhì)中。該化學(xué)發(fā)光試劑包含具有與其締合的特異性結(jié)合對(duì)(specific binding pair)的成員并具有并入其中的金屬和一種或多種螯合劑的絡(luò)合物的固體載體。該介質(zhì)進(jìn)一步包含一種或多種穩(wěn)定劑，其可以是螯合劑和/或金屬螯合物，例如，該絡(luò)合物本身，其中該介質(zhì)中所述一種或多種穩(wěn)定劑的量足以增強(qiáng)該固體載體的化學(xué)發(fā)光試劑的穩(wěn)定性。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是測(cè)定被疑含有被分析物的樣品中被分析物的存在和/或量的方法。在介質(zhì)中提供組合。該組合包含(i)該樣品，(ii)上述化學(xué)發(fā)光試劑，和(iii)與顆粒締合并能生成單態(tài)氧的光敏劑。被分析物的特異性結(jié)合對(duì)成員與至少一種固體載體或顆粒締合。對(duì)該組合施加使被分析物結(jié)合到被分析物的特異性結(jié)合對(duì)成員上的條件。用光照射光敏劑并測(cè)定該化學(xué)發(fā)光組合物產(chǎn)生的發(fā)光量。發(fā)光量與該樣品中被分析物的量相關(guān)。具體實(shí)施方案詳述一般論沭
本方法和試劑的實(shí)施方案涉及固體載體，例如顆粒。該載體包含含金屬螯合物的化學(xué)發(fā)光組合物。本發(fā)明人觀察到，在用于測(cè)定被分析物的檢測(cè)中使用這樣的載體，例如顆粒時(shí)，與該顆粒締合的化學(xué)發(fā)光組合物的信號(hào)輸出的穩(wěn)定性與包含其它化學(xué)發(fā)光組合物的顆粒相比不可接受地降低。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，通過(guò)在包含該顆粒的介質(zhì)中包括足量的一種或多種穩(wěn)定劑，增強(qiáng)來(lái)自這些顆粒的信號(hào)輸出的穩(wěn)定性，所述穩(wěn)定劑可以是螯合劑和/或金屬螯合物，例如與該顆粒締合的金屬螯合物?？梢酝ㄟ^(guò)監(jiān)測(cè)對(duì)跨越被分析物的被疑相關(guān)濃度范圍的校準(zhǔn)物獲得的信號(hào)量的差異監(jiān)測(cè)在醫(yī)療決策范圍的下端的特定檢測(cè)格式的性能。需要校準(zhǔn)物，例如，校準(zhǔn)物L(fēng)l和校準(zhǔn)物L(fēng)2或校準(zhǔn)物L(fēng)2和校準(zhǔn)物L(fēng)3的信號(hào)之間的大差異或間距。例如，可以使用六個(gè)校準(zhǔn)物，任意命名為L(zhǎng)1-L6?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)定使用不含被分析物的校準(zhǔn)物(任意標(biāo)作校準(zhǔn)物L(fēng)i)的信號(hào)量(背景)和對(duì)含有高于0的第一已知量的被分析物的校準(zhǔn)物(任意標(biāo)作校準(zhǔn)物L(fēng)2)獲得的信號(hào)量來(lái)評(píng)測(cè)信噪比。這種評(píng)測(cè)還可包括測(cè)定使用校準(zhǔn)物L(fēng)l的信號(hào)量和任意標(biāo)作L3的含有高于0的第二已知量的被分析物的校準(zhǔn)物的信號(hào)量。這種評(píng)測(cè)還可包括使用校準(zhǔn)物L(fēng)4、L5、L6等的這樣的測(cè)定。本文論述的實(shí)施方案與不符合本發(fā)明的實(shí)施方案的試劑相比在被分析物的檢測(cè)中提供更好性能。需要校準(zhǔn)物，例如，校準(zhǔn)物L(fēng)l和校準(zhǔn)物L(fēng)2或校準(zhǔn)物L(fēng)l和校準(zhǔn)物L(fēng)6的信號(hào)之間的大差異。為了在醫(yī)療決策范圍內(nèi)的良好靈敏性，在校準(zhǔn)物L(fēng)l和校準(zhǔn)物L(fēng)2之間檢出的信號(hào)差為至少大約50%，至少大約75%，至少大約90%，至少大約100%，至少大約125%，至少大約150%，至少大約175%，至少大約200%，至少大約225%，至少大約250%，至少大約275%，至少大約300%，至少大約325%，至少大約350%，至少大約375%，至少大約400%，至少大約425%等。在一些實(shí)施方案中，對(duì)校準(zhǔn)物L(fēng)6檢出的信號(hào)比對(duì)校準(zhǔn)物L(fēng)l檢出的信號(hào)大至少大約10倍，至少大約20倍，至少大約30倍，至少大約40倍，至少大約50倍，至少大約60倍，至少大約70倍，至少大約80倍，至少大約90倍，至少大約100倍。根據(jù)檢測(cè)格式，信號(hào)差可以為信號(hào)提高或信號(hào)降低。通常，使用校準(zhǔn)物的檢測(cè)的結(jié)果以圖表格式呈現(xiàn)，其中對(duì)照校準(zhǔn)物的濃度繪制信號(hào)量。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，校準(zhǔn)物L(fēng)l和校準(zhǔn)物L(fēng)2之間的線的斜率通常比用不符合本發(fā)明的實(shí)施方案的檢測(cè)試劑獲得的結(jié)果陡。此外，從校準(zhǔn)物L(fēng)l到校準(zhǔn)物L(fēng)6的線的斜率通常比用不符合本發(fā)明的實(shí)施方案的檢測(cè)試劑獲得的結(jié)果陡。如上提到，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑的穩(wěn)定性，該試劑包含具有與其締合的包含金屬和一種或多種螯合劑的絡(luò)合物的化學(xué)發(fā)光組合物的固體載體。該固體載體可以由透明或部分透明的有機(jī)或無(wú)機(jī)、固體或流體形式的水不溶性材料構(gòu)成。該固體載體可具有許多形狀，如微粒，包括珠粒和顆粒、膜(film)、薄膜(membrane)、管、孔(well)、條、桿、平面表面例如板，等等。根據(jù)檢測(cè)類型，該固體載體可懸浮或不可懸浮與其一起使用的介質(zhì)中?？蓱腋」腆w載體的實(shí)例包括聚合材料，如膠乳顆粒、脂雙層或脂質(zhì)體、油滴、細(xì)胞和水凝膠、磁性顆粒等。其它固體載體組合物包括聚合物，如硝化纖維素、乙酸纖維素、聚(氯乙烯)、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚G-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(對(duì)苯二甲酸乙二酯)、尼龍、聚(丁酸乙烯酯)等；單獨(dú)或與其它材料聯(lián)合使用。在一些實(shí)施方案中，該固體載體是顆粒。該顆粒通常具有至少大約0.02微米和不大于大約100微米的平均直徑。在一些實(shí)施方案中，該顆粒具有大約0.05微米至大約20微米或大約0. 3微米至大約10微米的平均直徑。該顆?？梢允怯袡C(jī)或無(wú)機(jī)、可溶脹或不可溶脹、多孔或無(wú)孔的，優(yōu)選具有接近水的密度，通常大約0. 7克/毫升至大約1. 5克/毫升，并包含可以透明、部分透明或不透明的材料。該顆?？梢允巧锊牧?，如細(xì)胞和微生物，例如紅血球、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、雜交瘤、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、病毒等。該顆粒還可以是由有機(jī)和無(wú)機(jī)聚合物、脂質(zhì)體、膠乳顆粒、磁性或非磁性顆粒、磷脂囊泡、乳糜微粒、脂蛋白等構(gòu)成的顆粒。在一些實(shí)施方案中，該顆粒是鉻顆?；蚰z乳顆粒。膠乳顆粒是微粒狀水懸浮性水不溶性聚合材料。該膠乳顆?？删哂兄睆酱蠹s20納米至大約20毫米，或大約100至大約1000納米的顆粒尺寸。在一些實(shí)施方案中，該膠乳是取代的聚乙烯，如聚苯乙烯-丁二烯、聚丙烯酰胺聚苯乙烯、含氨基的聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、丙烯腈-丁二烯、苯乙烯共聚物、聚乙酸乙烯酯-丙烯酸酯、聚乙烯吡啶、氯乙烯丙烯酸酯共聚物等。在一些實(shí)施方案中使用苯乙烯和羧化苯乙烯或用其它活性基團(tuán)，如氨基、羥基、鹵素等官能化的苯乙烯的非交聯(lián)聚合物。也可以使用取代苯乙烯與二烯，如丁二烯的共聚物。聚合物顆?？梢杂杉映苫蚩s合聚合物形成。該顆粒易分散在水性介質(zhì)中并可以是吸收性或可官能化的以允許直接或間接通過(guò)連接基共軛到信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)(sps)的成員、特異性結(jié)合對(duì)(Sbp)的成員等上。該顆粒也可衍生自天然存在的材料、合成改性的天然存在的材料和合成材料。特別有用的有機(jī)聚合物包括多糖，特別是交聯(lián)多糖，如可作為kpharose獲得的瓊脂糖、可作獲得的葡聚糖、纖維素、淀粉等；加聚物，如聚苯乙烯、聚乙烯醇、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的衍生物，特別是具有游離羥基官能的酯和酰胺的均聚物和共聚物等。該化學(xué)發(fā)光組合物包含金屬和一種或多種螯合劑的絡(luò)合物。構(gòu)成該絡(luò)合物的一部分的金屬的實(shí)例包括例如，稀土金屬、第VIII族中的金屬等。該稀土金屬包含鑭系元素(鑭系金屬)(從鑭到镥的15種元素，原子序數(shù)57-71)。特別可用的稀土金屬包括銪、鋱、鏑和釤。特別可用的第VIII族的金屬包括鋨和釕。稀土金屬通常具有+3的氧化態(tài)，釕具有+2的氧化態(tài)，鋨具有+2的氧化態(tài)。在某些實(shí)施方案中，該金屬選自銪、鋱、鏑、釤、鋨和釕。在一些實(shí)施方案中，該金屬是至少六配位的；但是，根據(jù)金屬螯合劑，該金屬可以八配位或更高配位。金屬螯合劑是化合物，其中相同分子的兩個(gè)或更多個(gè)原子與金屬配位形成金屬螯合物。所述兩個(gè)或更多個(gè)原子可以是例如氧、氮、硫、磷等。該原子可以是一種或多種官能團(tuán)的形式，例如酮、醛、羥基、胺、硫酮、硫醛、硫醇等。這些官能團(tuán)可以是芐基或衍生自例如萘、蒽、菲、吖啶、茈等的稠芳環(huán)體系的一部分。上述金屬之一與一種或多種螯合劑配位，其實(shí)例包括例如，
2-(1，，1，，1，，2，，2，，3，，3，_七氟-4，，6，-己二 酮 _6’ -基)-萘(NHA)、4，4’ -雙(2"，3〃，3〃-七氟-4〃，6"_己二酮-6〃-基)-鄰-三聯(lián)苯(BHHT)、菲咯啉(phen)和菲咯啉相關(guān)化合物(菲咯啉的衍生物)，例如菲咯啉羧酸、4，7-二苯基-1，10-菲咯啉(DPP)等、
3- -噻吩甲?；?，1，1，1-三氟丙酮(3-Q-thienoyl,1，1，1-trifluoroacetone, TTA),3-(2-萘?；?-1，1，1-三氟丙酮(NPPTA)、三辛基氧化膦(Τ0Ρ0)、三苯基氧化膦(ΤΡΡ0)、3-苯甲?；?1，1，1-三氟丙酮(BFTA)、2，2-二甲基-4-全氟丁?；?3-丁酮(fod)、2，2’ - 二吡啶基(bpy)、水楊酸、聯(lián)吡啶羧酸、氮雜冠醚三辛基氧化膦、氮雜穴狀配體等以及上述的組合。如上所述，在一些實(shí)施方案中，該金屬螯合物中的金屬至少六配位。該金屬螯合物不帶電；因此，該螯合劑提供的酸性基團(tuán)的數(shù)量等于該金屬的氧化態(tài)。通常，該金屬螯合劑相對(duì)疏水以提供金屬螯合物在非極性溶劑中的可溶性。例如和非限制性地，特定金屬螯合物的實(shí)例包括 Eu (TTA) 3DPP、Eu (NTA) 3DPP、Eu (NHA) 3DPP、Eu (BHHT) 2DPP、如美國(guó)專利 No.6，916，667 (例如第5-9欄)和美國(guó)專利申請(qǐng)No. 20060270063 (第3_4欄)(它們的相關(guān)公開內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文)中論述的金屬螯合物等。許多螯合劑和金屬螯合物是本領(lǐng)域中已知的且許多可購(gòu)得。通常，可以由金屬螯合劑通過(guò)在有機(jī)溶劑，例如，乙腈和充足的堿，例如吡啶(用于吸收在反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的鹽酸)中合并金屬氯化物與所需比率的金屬螯合劑分子來(lái)制備金屬螯合物。例如，可通過(guò)如 Shinha, A. P. , "Fluorescences and laser action in rare earth chelates, 〃Spectroscopy Inorganic Chemistry,第 2 卷，(1971)，255-288 描述的程序制備金屬螯合物。金屬螯合物與固體載體的締合方式取決于載體的性質(zhì)、金屬螯合物的性質(zhì)、溶劑的性質(zhì)等。該締合可以例如通過(guò)金屬螯合物被載體吸附、金屬螯合物共價(jià)鍵合到載體上、金屬螯合物溶解或分散在固體載體中、金屬螯合物借助結(jié)合對(duì)成員(例如抗生物素蛋白-生物素、地高辛-地高辛抗體等)非共價(jià)鍵合到載體上。由此該金屬螯合物可以與固體載體
締合 o金屬螯合物與膠乳顆粒的締合可包括在通過(guò)聚合形成顆粒的過(guò)程中并入預(yù)成型顆粒中，通常通過(guò)非共價(jià)溶解到顆粒中，諸如此類。在一些方法中，使用金屬螯合物的溶液。可用的溶劑包括醇，包括乙醇、乙氧基乙醇、乙二醇和芐醇；酰胺，如二甲基甲酰胺、甲酰胺、乙酰胺和四甲基脲等；亞砜，如二甲亞砜和環(huán)丁砜；和醚，如卡必醇、乙基卡必醇、二甲氧基乙烷等，和水。顆粒不溶于其中的具有高沸點(diǎn)的溶劑的使用允許使用升高的溫度促進(jìn)該化合物溶解到顆粒中并且特別合適。這些溶劑可單獨(dú)或聯(lián)合使用。應(yīng)選擇由于它們的固有性質(zhì)或從顆粒中除去的能力不干擾金屬螯合物的發(fā)光的反應(yīng)用溶劑。在一些實(shí)施方案中，可以使用芳族溶劑，例如鄰苯二甲酸二丁酯、芐腈、萘甲腈、對(duì)苯二甲酸二辛酯、二氯苯、二苯醚、二甲氧基苯等。通常，選擇該程序中所用的溫度以使金屬螯合物顆粒的量子產(chǎn)額最大化，條件是該顆粒在所選溫度下不應(yīng)熔融或聚集。通常使用升高的溫度。用于該程序的溫度通常為大約20°C至大約200°C，或大約50°C至大約170°C。已經(jīng)觀察到，在室溫下幾乎不可溶的一些化合物在升高的溫度下可溶于例如低分子量醇，如乙醇和乙二醇等。羧酸化改性膠乳顆粒已顯示在這樣的溫度下耐受低分子量醇。在一些實(shí)施方案中，該化學(xué)發(fā)光試劑用在測(cè)定被疑含有被分析物的樣品中被分析物的存在和/或量的檢測(cè)中。在這樣的實(shí)施方案中，被分析物的結(jié)合配偶體與該固體載體締合。金屬螯合物與固體載體的締合方式取決于載體性質(zhì)、被分析物的結(jié)合配偶體的性質(zhì)等。該締合可以例如通過(guò)結(jié)合配偶體被載體吸附、結(jié)合配偶體共價(jià)鍵合到載體上、結(jié)合配偶體借助結(jié)合對(duì)成員(例如抗生物素蛋白-生物素、地高辛-地高辛抗體等)非共價(jià)鍵合到載體上。由此該被分析物的結(jié)合配偶體可以與固體載體“締合”。使被分析物的結(jié)合配偶體與固體載體締合的方法是本領(lǐng)域中公知的并且不在此重述。在一些實(shí)施方案中，固體載體的表面包含一個(gè)或多個(gè)涂層，其中該涂層可以是例如氨基衍生的多糖、羧甲基多糖、葡聚糖醛(dexal)。該官能化涂層可用于與蛋白質(zhì)，例如抗體反應(yīng)以形成產(chǎn)物，由此使該蛋白質(zhì)共價(jià)鍵合到固體載體上。例如，氨基葡聚糖或羧甲基葡聚糖可用于形成與特異性結(jié)合對(duì)成員的共軛物?？呻S后通過(guò)形成酰胺來(lái)進(jìn)行例如葡聚糖與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，固體載體的表面不包含涂層(即該表面不含涂料，如上文提到的那些)。在這些實(shí)施方案中，利用例如固體載體的表面上的官能團(tuán)，例如，羧基、胺、羥基等使被分析物的結(jié)合配偶體與固體載體締合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可以使用羧酸化膠乳珠粒。本發(fā)明的一些實(shí)施方案特別適用于具有與其締合的化學(xué)發(fā)光組合物的載體，如顆粒，其中載體表面基本不含涂層。在制備化學(xué)發(fā)光試劑，即具有與其締合的金屬螯合物的固體載體后，將該化學(xué)發(fā)光試劑置于適合儲(chǔ)存的介質(zhì)中直至在檢測(cè)中使用。在許多實(shí)施方案中，該介質(zhì)是水性介質(zhì)，通常水性緩沖介質(zhì)。該水性介質(zhì)可以僅是水，或可包括0. 1至大約40體積％助溶劑，例如有機(jī)溶劑，其可以是醇、醚、酯、胺、酰胺等。該介質(zhì)的PH通常為大約4至大約11，或大約5至大約10，或大約6. 5至大約9. 5。該pH通?；诠腆w載體的性質(zhì)、金屬螯合物的性質(zhì)、金屬螯合劑的性質(zhì)等。可以使用各種緩沖劑實(shí)現(xiàn)所需PH并保持pH。示例性緩沖劑包括硼酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(tris)、巴比妥、PIPES、HEPES, MES、ACES、MOPS、BICINE等。所用的特定緩沖劑不重要，但對(duì)特定化學(xué)發(fā)光試劑而言，一種或另一緩沖劑可能優(yōu)選。在一些實(shí)施方案中，該化學(xué)發(fā)光試劑的儲(chǔ)存介質(zhì)與用于被分析物檢測(cè)法的介質(zhì)類似或相同，其中該化學(xué)發(fā)光試劑是所用檢測(cè)試劑之一。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的方法包括以足以增強(qiáng)固體載體中的化學(xué)發(fā)光試劑的穩(wěn)定性的量在該化學(xué)發(fā)光試劑的儲(chǔ)存介質(zhì)中摻入一種或多種穩(wěn)定劑，其可以是螯合劑和/或金屬螯合物。在許多實(shí)施方案中，該穩(wěn)定劑選自構(gòu)成與該化學(xué)發(fā)光試劑的固體載體締合的金屬螯合物的一部分的相同螯合劑，或選自在結(jié)構(gòu)上與該金屬螯合物中的螯合劑類似的螯合劑。結(jié)構(gòu)類似性可源自該螯合劑的原子的空間排列、源自該金屬螯合物的螯合劑的衍生化，例如以提供螯合劑在化學(xué)發(fā)光試劑的儲(chǔ)存介質(zhì)中的更大溶解性等。提供親水性或水溶性的基團(tuán)或官能團(tuán)是提高固體的水可濕性和與其鍵合的化合物的水溶性的親水官能團(tuán)。此類官能團(tuán)可以是具有1至50個(gè)或更多原子的取代基，并可包括磺酸酯、硫酸酯、磷酸酯、脒、膦酸酯、羧酸酯、羥基，特別是多元醇、胺、醚、酰胺等。示例性官能團(tuán)是羧基烷基、磺氧基烷基、C0NH0CH2C00H、C0_(葡糖胺)、糖、葡聚糖、環(huán)糊精、S02NHCH2C00H, SO3H, CONHCH2CH2SO3H, PO3H2、OPO3H2、羥基、羧基、酮及其組合?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域公知的將此類基團(tuán)或官能團(tuán)引入化合物中的方法將此類基團(tuán)或官能團(tuán)引入螯合劑中。在使用與化學(xué)發(fā)光試劑的螯合劑不同的穩(wěn)定螯合劑的情況下，這種穩(wěn)定劑可選自上述金屬螯合劑。一般而言，與該金屬螯合物不同的穩(wěn)定劑的螯合能力應(yīng)該與該金屬螯合物的螯合劑的螯合能力至少一樣強(qiáng)或更強(qiáng)。在穩(wěn)定劑包含金屬螯合物的許多實(shí)施方案中，該金屬螯合物和與化學(xué)發(fā)光試劑的固體載體締合的金屬螯合物相同。但是，在一些情況下，可以使用與化學(xué)發(fā)光試劑的金屬螯合物不同的金屬螯合物穩(wěn)定劑。用作穩(wěn)定劑的這種金屬螯合物可選自上述金屬螯合物。在上述具體實(shí)施方案中，例如和非限制性地，該化學(xué)發(fā)光試劑是具有作為金屬螯合物并入其中的Eu (NHA)3DPP的膠乳顆粒。該穩(wěn)定劑可以是螯合劑NHA或DPP或NHA和DPP的組合，或該穩(wěn)定劑可以是Eu (NHA) 3DPP本身。將該穩(wěn)定劑摻入化學(xué)發(fā)光試劑儲(chǔ)存介質(zhì)中?？烧J(rèn)識(shí)到，在上述實(shí)例中，用作穩(wěn)定劑的螯合劑可以是任何上述金屬螯合劑。在化學(xué)發(fā)光試劑儲(chǔ)存介質(zhì)中以足以增強(qiáng)該固體載體的化學(xué)發(fā)光試劑的穩(wěn)定性的量使用該穩(wěn)定劑。該穩(wěn)定劑的量取決于載體的性質(zhì)、金屬螯合物的性質(zhì)、穩(wěn)定劑的性質(zhì)和性能等。該穩(wěn)定劑應(yīng)在化學(xué)發(fā)光試劑儲(chǔ)存介質(zhì)中表現(xiàn)出合理的可溶性。在許多情況下，這種介質(zhì)是水性介質(zhì)，因此該穩(wěn)定劑應(yīng)在水或水-助溶劑組合中可溶解至例如至少大約50%，或至少大約55%，或至少大約60%，或至少大約65%，或至少大約70%，或至少大約75%，或至少大約80%，或至少大約85%，或至少大約90%，或至少大約95%，或至少大約99%的程度?？梢酝ㄟ^(guò)用以不同穩(wěn)定濃度儲(chǔ)存的化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行檢測(cè)并選擇提供所需信號(hào)輸出水平和所需穩(wěn)定性水平結(jié)果的濃度來(lái)憑經(jīng)驗(yàn)獲得足以穩(wěn)定化學(xué)發(fā)光試劑和增強(qiáng)其信號(hào)輸出的介質(zhì)中穩(wěn)定劑的量。在許多實(shí)施方案中，介質(zhì)中穩(wěn)定劑的量為大約0. 001%至大約10%，或大約0. 01%至大約5%，或大約0. 02%至大約2%，或大約0. 001%至大約5%，或大約0. 01%至大約2%，或大約0. 02%至大約1%，或大約0. 005%至大約10%，或大約0. 01%至大約3%，或大約0. 02%至大約3%，例如其中百分比為重量/體積。所用穩(wěn)定劑可以是金屬螯合物的金屬螯合劑的衍生物，其中將提高螯合劑的水溶性的官能團(tuán)引入該螯合劑中以提供在水性介質(zhì)中的更大可溶性而不在任何顯著程度上干擾該螯合劑的螯合性質(zhì)。另外或或者，可以調(diào)節(jié)該介質(zhì)中任何助溶劑，如有機(jī)溶劑的量以實(shí)現(xiàn)該穩(wěn)定劑的所需可溶性水平。有意思的是要指出，在化學(xué)發(fā)光試劑儲(chǔ)存介質(zhì)中使用穩(wěn)定劑增強(qiáng)該試劑的穩(wěn)定性是意料外的。將穩(wěn)定劑摻入化學(xué)發(fā)光試劑的載體中不提供增強(qiáng)的穩(wěn)定性或增強(qiáng)的信號(hào)輸
出ο利用本試劑的被分析物檢測(cè)的一般描述
本發(fā)明可用于利用具有與載體締合的金屬螯合物的載體的任何檢測(cè)法。本發(fā)明的實(shí)施方案的試劑可用在測(cè)定作為sbp成員的被分析物的大多數(shù)檢測(cè)中。通常，在這樣的檢測(cè)中，該試劑尤其包含被分析物的受體。將被疑含有被分析物的樣品在檢測(cè)介質(zhì)中與被分析物的受體合并。檢測(cè)該受體與被分析物(如果存在)的結(jié)合。根據(jù)上述實(shí)施方案的化學(xué)發(fā)光試劑用作這種結(jié)合事件的檢測(cè)中的標(biāo)記試劑，其中受體是相關(guān)被分析物的結(jié)合配偶體?？梢栽谌魏螜z測(cè)組分或產(chǎn)品不分離(均相)或分離(非均相)的情況下進(jìn)行該檢測(cè)。非均相檢測(cè)通常涉及一個(gè)或多個(gè)分離步驟并可以是競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性的。在經(jīng)此引用并入本文的Davalian等人，美國(guó)專利No. 5，089，390，第14欄第25行至第15欄第9行中公開了各種競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性非均相檢測(cè)格式。在典型的競(jìng)爭(zhēng)性非均相檢測(cè)中，使具有結(jié)合到其上的被分析物抗體的載體與含有共軛到可檢測(cè)標(biāo)記，如酶上的樣品和被分析物類似物的介質(zhì)接觸。樣品中的被分析物與被分析物類似物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到抗體上。在分離載體和介質(zhì)后，載體或介質(zhì)的標(biāo)記活性通過(guò)常規(guī)技術(shù)測(cè)定并與樣品中被分析物的量相關(guān)。“被分析物類似物”是可與類似的被分析物競(jìng)爭(zhēng)受體的改性藥物，該改性提供將被分析物類似物連接到另一分子上的方式。被分析物類似物與被分析物的不同通常不止是氫被將藥物類似物連接到中心(hub)或標(biāo)記上的鍵替代，但不需要如此。被分析物類似物以與被分析物結(jié)合到受體上的方式類似的方式結(jié)合到受體上。被分析物類似物可以是例如通過(guò)連接基共軛到另一分子上的被分析物、針對(duì)被分析物的個(gè)體基因型抗體的抗體等。可用的一大類免疫測(cè)定包括使用有限濃度抗體的免疫測(cè)定。另一類免疫測(cè)定涉及使用過(guò)量的一種或多種主要試劑，例如過(guò)量的被分析物抗體。另一類免疫測(cè)定是無(wú)分離的均相測(cè)定，其中標(biāo)記試劑調(diào)節(jié)被分析物-抗體結(jié)合反應(yīng)上的標(biāo)記信號(hào)。另一類檢測(cè)包括避免使用有問(wèn)題的標(biāo)記半抗原的被分析物的標(biāo)記抗體試劑限制競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)。在這種類型的檢測(cè)中，固相固定的被分析物以恒定的有限量存在。標(biāo)記在固定的被分析物和游離被分析物之間的分配取決于樣品中被分析物的濃度。一些檢測(cè)利用信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)(sps)，其使用化學(xué)發(fā)光試劑，如與載體締合的金屬螯合物并具有至少第一和第二 SPS成員。名稱“第一”和“第二”是完全任意的并且無(wú)意表明SPS成員之間的任何次序或分級(jí)或sps成員在本方法中的任何添加次序。SPS成員的相關(guān)性在于，一個(gè)SPS成員的活化產(chǎn)生使得另一 SPS成員活化的產(chǎn)物，例如光。在已知檢測(cè)的一些實(shí)施方案中，SPS成員包含敏化劑和化學(xué)發(fā)光組合物，其中敏化劑的活化產(chǎn)生活化該化學(xué)發(fā)光組合物的產(chǎn)物。第二 sps成員通常產(chǎn)生與結(jié)合和/或未結(jié)合的sps成員的量，即檢測(cè)的結(jié)合或未結(jié)合到被分析物上的sps成員的量有關(guān)或與反映要檢測(cè)的被分析物的量的試劑有關(guān)的可檢出信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，該化學(xué)發(fā)光組合物是上述化學(xué)發(fā)光試劑，其中該化學(xué)發(fā)光試劑儲(chǔ)存在含有穩(wěn)定量的穩(wěn)定劑的介質(zhì)中。在一些實(shí)施方案中，第一 sps成員是敏化劑，例如光敏劑，第二 sps成員是由于第一 sps成員活化而活化的化學(xué)發(fā)光組合物。敏化劑可以是在活化時(shí)產(chǎn)生活化該化學(xué)發(fā)光組合物的產(chǎn)物的任何部分，這又生成可檢出信號(hào)。在許多實(shí)施方案中，該敏化劑能在活化時(shí)生成單態(tài)氧。 在一些實(shí)施方案中，敏化劑是通常通過(guò)光激發(fā)生成單態(tài)氧的光敏劑。該光敏劑可以是可光活化的(例如染料和芳族化合物)或化學(xué)活化的(例如酶和金屬鹽)。在光激發(fā)時(shí)，光敏劑通常是由通常用多個(gè)共軛雙鍵或三鍵共價(jià)鍵合的原子構(gòu)成的化合物。該化合物應(yīng)吸收在大約200至大約1100納米，或大約300至大約1000納米，或大約450至大約950納米波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光，在其最大吸光度下具有在激發(fā)波長(zhǎng)下大于大約500 M-1 cm—1，或至少大約5000 M—1 cnT1，或至少大約50，000 M—1 cnT1的消光系數(shù)。要被光激發(fā)的光敏劑相對(duì)光穩(wěn)定并且不與單態(tài)氧有效反應(yīng)。在最有用的光敏劑中存在幾種結(jié)構(gòu)特征。大多數(shù)光敏劑具有留在剛性的通常芳族結(jié)構(gòu)中的至少一個(gè)和通常三個(gè)或更多個(gè)共軛雙鍵或三鍵。它們通常含有至少一個(gè)加速系間跨越(intersystem crossing)的基團(tuán)，如羰基或亞胺基團(tuán)或選自周期表第3-6行的重原子，尤其是碘或溴，或它們可具有延伸的芳族結(jié)構(gòu)。典型的光敏劑包括丙酮、二苯甲酮、9-噻噸酮、曙紅、9，10-二溴蒽、亞甲基藍(lán)、金屬卟啉如血卟啉、酞菁、葉綠素、玫瑰紅、巴克敏斯特富勒烯等和具有使這些化合物更親脂或更親水和/或作為連接到例如sps成員或sbp成員上的連接基的含1至50個(gè)原子的取代基的這些化合物的衍生物?？捎糜谏鲜龇椒ǖ墓饷魟┌稍诒煌獠抗庠椿罨蜉^不優(yōu)選地未被外部光源活化的情況下產(chǎn)生單態(tài)氧的其它物質(zhì)和組合物。因此，例如，鉬酸鹽和氯過(guò)氧化物酶和髓過(guò)氧化物酶加上溴或氯離子(Kanofsky，J. Biol. Chem. (1983) 259 5596)已表明催化過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化成單態(tài)氧和水。在光敏劑的范圍內(nèi)還包括不是真實(shí)敏化劑而在通過(guò)熱、光或化學(xué)活化激發(fā)時(shí)釋放單態(tài)氧分子的化合物。這類化合物的最已知成員包括內(nèi)過(guò)氧化物，如1，4-雙羧基乙基-1，4-萘內(nèi)過(guò)氧化物、9，10-二苯基蒽-9，10-內(nèi)過(guò)氧化物和5，6，11，12-四苯基萘5，12-內(nèi)過(guò)氧化物。加熱或光被這些化合物直接吸收釋放單態(tài)氧?？捎玫钠渌饷魟┑膶?shí)例是美國(guó)專利Nos. 5，340，716和6，251，581中闡述的那些，其相關(guān)公開內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。^^BJbTMT^^ "Assay Method Utilizing PhotoactivatedChemiluminescent Label" ("induced luminescence assay〃)的美國(guó)專利 No. 5, 340, 716(Ullman)中提到的誘導(dǎo)發(fā)光免疫測(cè)定，其公開內(nèi)容經(jīng)此引用并入本文。在一種方法中，該檢測(cè)使用包含光敏劑的顆粒和包含化學(xué)發(fā)光化合物的標(biāo)記顆粒。與被分析物的存在相關(guān)地，標(biāo)記顆粒共軛到能結(jié)合到被分析物上的sbp成員上以形成絡(luò)合物，或共軛到第二 sbp成員上以形成絡(luò)合物。如果存在被分析物，光敏劑和化學(xué)發(fā)光化合物靠近。光敏劑生成單態(tài)氧并在這兩種標(biāo)記靠近時(shí)活化化學(xué)發(fā)光化合物。活化的化學(xué)發(fā)光化合物隨后產(chǎn)生光。產(chǎn)生的光的量與形成的絡(luò)合物的量相關(guān)，后者又與存在的被分析物的量相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，該化學(xué)發(fā)光化合物是上述化學(xué)發(fā)光試劑，其中該化學(xué)發(fā)光試劑儲(chǔ)存在含有穩(wěn)定量的穩(wěn)定劑的介質(zhì)中。在該誘導(dǎo)發(fā)光檢測(cè)的一些實(shí)施方案中，使用包含例如通過(guò)并入其中或連接到其上而與其締合的化學(xué)發(fā)光化合物的顆粒。該顆粒共軛到抗生物素蛋白上。結(jié)合到被分析物上的sbp成員，即被分析物的結(jié)合配偶體，結(jié)合到生物素上。上述試劑的培養(yǎng)產(chǎn)生單一試劑，其中Sbp成員以不可逆方式結(jié)合到顆粒上。生物素可隨后以足以與任何剩余的未占抗生物素蛋白結(jié)合位點(diǎn)反應(yīng)的量添加。結(jié)合到被分析物上的第二 Sbp成員，即被分析物的第二結(jié)合配偶體，是生物素-受體共軛物的一部分?？股锼氐鞍坠曹椀骄哂信c其締合的光敏劑的第二組顆粒上。這些試劑的培養(yǎng)產(chǎn)生具有以不可逆方式結(jié)合到光敏劑顆粒上的第二 Sbp成員的單一試劑。培養(yǎng)該反應(yīng)介質(zhì)以通過(guò)Sbp成員結(jié)合到被分析物來(lái)使顆粒結(jié)合到被分析物上。隨后，用光照射該介質(zhì)以激發(fā)光敏劑，其在其激發(fā)態(tài)下能將氧活化成單重態(tài)。由于顆粒組之一的化學(xué)發(fā)光化合物現(xiàn)在由于存在被分析物而靠近光敏劑，其被單態(tài)氧活化并發(fā)光。隨后就發(fā)光的存在和/或量檢查該介質(zhì)，其存在與被分析物的存在相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，使用本發(fā)明的實(shí)施方案的化學(xué)發(fā)光試劑一其中該化學(xué)發(fā)光試劑儲(chǔ)存在含有穩(wěn)定量的穩(wěn)定劑的介質(zhì)中一作為具有與其締合的化學(xué)發(fā)光化合物的顆粒試劑。本文所用的術(shù)語(yǔ)“至少”是指規(guī)定的項(xiàng)目數(shù)等于或大于列舉數(shù)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“大約”是指列舉數(shù)值可相差+或-10% ；例如“大約5”是指4. 5至5. 5的范圍。
要分析的樣品是被疑含有被分析物的樣品。該樣品優(yōu)選來(lái)自人或動(dòng)物并包括生物流體，如全血、血清、血漿、痰、淋巴液、精液、陰道粘液、糞、尿、脊髓液、唾液、糞便、腦脊髓液、眼淚、粘液等；生物組織，如頭發(fā)、皮膚、切片或來(lái)自器官或其它身體部分的離體組織；等。在許多情況下，該樣品是全血、血漿或血清，在一個(gè)具體實(shí)施方案中該樣品是全血?？梢栽谌魏畏奖愕慕橘|(zhì)中制備樣品。方便地，可以在下面更充分論述的檢測(cè)介質(zhì)中制備樣品。在一些情況下，可以對(duì)該樣品，例如對(duì)溶解血細(xì)胞等施加預(yù)處理。通常在不隨后干擾檢測(cè)的介質(zhì)中進(jìn)行這種預(yù)處理。水性介質(zhì)優(yōu)選用于該預(yù)處理。如上文簡(jiǎn)要論述，通常在水性緩沖介質(zhì)中在通常提供最佳檢測(cè)靈敏度的適度pH下進(jìn)行檢測(cè)。該水性介質(zhì)可以僅是水，或可包括0.1至大約40體積％助溶劑。該介質(zhì)的PH通常為大約4至大約11，更通常大約5至大約10，優(yōu)選大約6. 5至大約9. 5。該pH通常是任何特異性結(jié)合對(duì)的結(jié)合成員的最佳結(jié)合、對(duì)該檢測(cè)的其它試劑如信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)的成員等而言最佳的PH之間的折衷?？梢允褂酶鞣N緩沖劑實(shí)現(xiàn)所需pH并在測(cè)定過(guò)程中保持pH。示例性緩沖劑包括硼酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、tris、巴比妥、PIPES、HEPES, MES、ACES、MOPS、BICINE等。所用的特定緩沖劑不重要，但在各檢測(cè)中，一種或另一緩沖劑可能優(yōu)選。在上述方法中可以使用各種輔助材料。例如，除緩沖劑外，該介質(zhì)可包含對(duì)該介質(zhì)和對(duì)所用試劑的穩(wěn)定劑。通常，除這些添加劑外，可包括蛋白質(zhì)，如白蛋白；有機(jī)溶劑，如甲酰胺；季銨鹽；聚陰離子，如葡聚糖硫酸酯；結(jié)合增強(qiáng)劑，例如聚亞烷基二醇；等。該介質(zhì)還可包含防止形成血塊的試劑。此類試劑是本領(lǐng)域中公知的并包括例如EDTA、EGTA、檸檬酸鹽、肝素等。該介質(zhì)還可包含一種或多種如本領(lǐng)域中已知的防腐劑，例如，疊氮化鈉、硫酸新霉素、PR0CLIN 300、鏈霉素等。所有上述材料都以足以實(shí)現(xiàn)所需作用或功能的濃度或量存在?？梢砸砸粋€(gè)或多個(gè)間期，包括上述各種試劑的添加之間的間期對(duì)該介質(zhì)施加一個(gè)或多個(gè)培養(yǎng)期。通常以足以發(fā)生該試劑的各種組分的結(jié)合的溫度和時(shí)間培養(yǎng)該介質(zhì)。在測(cè)量過(guò)程中，中等溫度常用于實(shí)施該方法，通常恒溫，優(yōu)選室溫。培養(yǎng)溫度通常為大約5°C至大約99°C，通常大約15°C至大約70°C，更通常20°C至大約45°C。培養(yǎng)期為大約0. 2秒至大約24小時(shí)，或大約1秒至大約6小時(shí)，或大約2秒至大約1小時(shí)，或大約1至大約15分鐘。該時(shí)期取決于介質(zhì)的溫度和各種試劑的結(jié)合速率，其取決于締合速率常數(shù)、濃度、結(jié)合常數(shù)和離解速率常數(shù)。測(cè)量過(guò)程中的溫度通常為大約10°C至大約50°C，或大約15°C至大約40°C?？蓹z測(cè)的被分析物的濃度通常為10_5至大約10_17 M，更通常大約10_6至大約10_14M不等。如該檢測(cè)是定性、半定量還是定量(關(guān)于該樣品中存在的被分析物的量)、特定檢測(cè)技術(shù)和被分析物的濃度之類的考慮因素通常決定各種試劑的濃度。檢測(cè)介質(zhì)中各種試劑的濃度通常取決于被分析物的相關(guān)濃度范圍、檢測(cè)性質(zhì)等。但是，通常憑經(jīng)驗(yàn)確定各試劑的最終濃度以優(yōu)化該檢測(cè)在該范圍內(nèi)的靈敏性。也就是說(shuō)，有顯著性的被分析物的濃度變化應(yīng)提供可精確測(cè)量的信號(hào)差。如信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)的性質(zhì)和被分析物的性質(zhì)之類的考慮因素通常決定各種試劑的濃度。如上所述，樣品和試劑在該介質(zhì)中聯(lián)合提供。盡管可以改變添加到介質(zhì)中的次序，但對(duì)本文所述的檢測(cè)格式的一些實(shí)施方案而言有某些優(yōu)選。當(dāng)然，最簡(jiǎn)單的添加次序是同時(shí)添加所有材料并如均相檢測(cè)中那樣決定該檢測(cè)介質(zhì)對(duì)信號(hào)的影響?；蛘?，各試劑或試劑組可依次合并。任選地，在如上論述的各添加后可包括培養(yǎng)步驟。
檢杳步驟
在根據(jù)本公開的方法的下一步驟中，就包含被分析物和被分析物抗體的絡(luò)合物的存在檢查該介質(zhì)。該絡(luò)合物的存在和/或量指示樣品中被分析物的存在和/或量。短語(yǔ)“測(cè)量被分析物的量”是指被分析物的定量、半定量和定性測(cè)定。定量、半定量和定性方法以及測(cè)定被分析物的所有其它方法被認(rèn)為是測(cè)量被分析物的量的方法。例如，僅檢查被疑含有被分析物的樣品中被分析物的存在與否的方法被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)考慮了術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)”和“測(cè)定”以及測(cè)量的其它常用同義詞。在許多實(shí)施方案中，介質(zhì)的檢查涉及檢測(cè)來(lái)自該介質(zhì)的信號(hào)，其中生成的信號(hào)是由于包含根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的化學(xué)發(fā)光試劑。信號(hào)的存在和/或量與樣品中被分析物的存在和/或量有關(guān)。特定檢測(cè)模式取決于SPS的性質(zhì)。如上論述，SPS標(biāo)記可通過(guò)許多方法產(chǎn)生可通過(guò)外部手段檢出的信號(hào)。信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)的活化取決于信號(hào)發(fā)生系統(tǒng)成員的性質(zhì)。對(duì)作為光活化的敏化劑形SPS成員而言，用光照射該SPS成員。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的公開內(nèi)容會(huì)想到其它活化方法。在使用光敏劑時(shí)，在照射含有上述反應(yīng)物的介質(zhì)時(shí)，該光敏劑用于活化化學(xué)發(fā)光試劑，特別是金屬螯合物。用具有足以將該光敏劑轉(zhuǎn)化成激發(fā)態(tài)并使其能將分子氧活化成單態(tài)氧的能量的波長(zhǎng)的光照射該介質(zhì)。在結(jié)合到sbp成員上時(shí)，光敏劑濃度可以非常低，通常大約10_6至大約10_12 M或更低。通常，對(duì)涉及光敏劑的上述實(shí)施方案而言，用具有大約300至大約1200納米，或大約450至大約950，或大約550至大約800納米波長(zhǎng)的光照射該介質(zhì)。照射期取決于活化的化學(xué)發(fā)光試劑的壽命、光強(qiáng)度和所需發(fā)射強(qiáng)度。對(duì)短壽命的活化化學(xué)發(fā)光試劑而言，該時(shí)期可以少于1秒(a second)，通常大約1毫秒(amillisecond)，但在使用強(qiáng)閃光燈或激光的情況下可以短至1微秒(a microsecond)。對(duì)長(zhǎng)壽命的活化化學(xué)發(fā)光試劑而言，照射期可以更長(zhǎng)并可以使用不那么強(qiáng)的穩(wěn)定光源。通常，在照射期間的積分光強(qiáng)度應(yīng)足以激發(fā)至少0. 1%的光敏劑分子，優(yōu)選至少30%，最優(yōu)選每一光敏劑分子被激發(fā)至少一次。氦氖激光器是在632. 6納米下激發(fā)的便宜光源。吸收此波長(zhǎng)的光的光敏劑與氦氖激光器的發(fā)射譜線相容并因此特別可用在使用光敏劑的本方法中。其它光源包括，例如，其它激光器，如氬氣、YAG、He/Cd和紅寶石；發(fā)光二極管；汞、鈉和氙蒸氣燈；白熾燈，如鎢和鎢/鹵素；和閃光燈等。測(cè)量過(guò)程中的溫度通常為大約10°C至大約70°C，或大約20°C至大約45°C，或大約20°C至大約25°C。在一種方法中，使用已知濃度的要篩選的被分析物形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。如上論述，也可以使用校準(zhǔn)物和其它對(duì)照物?？梢灾庇^地、經(jīng)照相術(shù)、光能測(cè)定術(shù)、分光光度法或通過(guò)任何其它方便的方式測(cè)量任何上述方法中的發(fā)光以測(cè)定其量，這與介質(zhì)中被分析物的量有關(guān)。信號(hào)的存在和/或量的檢查還包括通常僅是信號(hào)讀取步驟的信號(hào)檢測(cè)。通常使用儀器讀取信號(hào)，儀器性質(zhì)取決于信號(hào)的性質(zhì)。該儀器可以是分光光度計(jì)、熒光計(jì)、吸收光譜儀、光度計(jì)、化學(xué)光度計(jì)等。檢測(cè)信號(hào)的存在和量與樣品中存在的被分析物的存在和量有關(guān)。包含用于講行檢測(cè)的試劑的試劑念
儲(chǔ)存在包含根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的穩(wěn)定劑的介質(zhì)中的本化學(xué)發(fā)光組合物和用于進(jìn)行特定檢測(cè)的其它試劑可存在于可用于方便地進(jìn)行測(cè)定被分析物的檢測(cè)法的試劑盒中。在一些實(shí)施方案中，試劑盒在包裝組合中包含生物素-被分析物抗體共軛物、抗生物素蛋白鏈菌素-敏化劑顆粒和被分析物類似物-化學(xué)發(fā)光顆粒以及用于進(jìn)行該檢測(cè)的任何其它試劑，其性質(zhì)取決于特定檢測(cè)格式。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含結(jié)合到化學(xué)發(fā)光顆粒上的被分析物抗體、抗生物素蛋白鏈菌素-敏化劑顆粒和生物素-被分析物抗體共軛物以及用于進(jìn)行該檢測(cè)的任何其它試劑，其性質(zhì)取決于特定檢測(cè)格式。該化學(xué)發(fā)光顆粒可包含金屬螯合物作為化學(xué)發(fā)光化合物。根據(jù)試劑的交叉反應(yīng)性和穩(wěn)定性，這些試劑可各自在分開的容器中或各種試劑可合并在一個(gè)或多個(gè)容器中。該試劑盒可進(jìn)一步包括用于進(jìn)行檢測(cè)的其它分開包裝的試劑，如附加的sbp成員、輔助試劑等?？梢詫挿旱馗淖?cè)噭┖兄懈鞣N試劑的相對(duì)量以提供基本優(yōu)化本方法的過(guò)程中需要發(fā)生的反應(yīng)并進(jìn)一步基本優(yōu)化該檢測(cè)的靈敏性的試劑濃度。在適當(dāng)情況下，試劑盒中的一種或多種試劑可以以包括賦形劑的通常凍干的干粉形式提供，其在溶解后提供具有適合進(jìn)行本發(fā)明的方法或檢測(cè)的濃度的試劑溶液。該試劑盒可進(jìn)一步包括如上所述的本發(fā)明的方法的書面說(shuō)明。下列實(shí)施例舉例而非限制地進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案并且意在描述而非限制本發(fā)明的范圍。除非另行指明，本文中公開的份數(shù)和百分比按重量/體積計(jì)。
實(shí)施例除非另行指明，試劑來(lái)自Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI)。使用可獲自SiemensHealthcare Diagnostics Inc. , Newark DE 的 DIMENSION ExL 分析器的原型進(jìn)行測(cè)試。該儀器使用誘導(dǎo)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)并配有適當(dāng)?shù)淖x數(shù)器。使用心肌肌鈣蛋白I (cTnl)檢測(cè)(Siemens Healthcare Diagnostics Inc. , Part No. RF 623)在如下所述的改變下進(jìn)行穩(wěn)定性研究。實(shí)施例1
穩(wěn)定溶液的制備將12毫克2-(1，，1，，1，，2，，2，，3，，3，-七氟-4，，6，-己二Sf -6'—基)_ 蔡(2-1', 1', 1', 2', 2', 3', 3' -heptafluoro-4', 6' -hexanedion-6' -yl) -naphthalene) (NHA)溶解到1. 2毫升99%乙醇中。在分開的1升LOCI 稀釋HEPES緩沖液pH7.2 (項(xiàng)目號(hào) No. 781000. 308，來(lái)自 Siemens Healthcare Diagnostics Inc.)中各加入上述溶液的0. 2毫升等分試樣和1. 0毫升等分試樣。這兩瓶溶液在4°C下?lián)u振3天，隨后在冷時(shí)(while cold)分別經(jīng)0.45微米過(guò)濾器過(guò)濾。各LOCI稀緩沖液中的所得NHA濃度分別為0. 0 和0. 1%。因此，三種不同的LOCI稀釋劑可供進(jìn)行下述穩(wěn)定性研究。這三種稀釋劑是分別含有0 mg/mL (對(duì)照物)、2 mg/mL (稀釋劑1)和10 mg/mL (稀釋劑2)的NHA作為穩(wěn)定劑的LOCI稀釋劑。這三種稀釋劑用于制備商業(yè)cTnl檢測(cè)的化學(xué)發(fā)光試劑。商業(yè)cTnl檢測(cè)的方法的原理=TNI方法是基于L0CI 技術(shù)的均相夾心化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定。L0CI 試劑包括兩種合成的珠粒試劑和生物素化抗-心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體片段。第一珠粒試劑(Sensibeads)涂有抗生物素蛋白鏈菌素并含有光敏劑染料。第二珠粒試劑(Chemibeads)涂有第二抗-心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體并含有化學(xué)發(fā)光染料。用Chemibeads和生物素化抗體培養(yǎng)樣品以形成珠粒_心肌肌鈣蛋白1_生物素化抗體夾心物。
權(quán)利要求
1.增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑的穩(wěn)定性的方法，該試劑包含固體載體，該固體載體具有與其締合的包含金屬和一種或多種螯合劑的絡(luò)合物的化學(xué)發(fā)光組合物，該方法包括以足以增強(qiáng)該化學(xué)發(fā)光試劑的穩(wěn)定性的量在包含該化學(xué)發(fā)光試劑的介質(zhì)中加入一種或多種選自螯合劑和金屬螯合物的穩(wěn)定劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該穩(wěn)定劑是該絡(luò)合物的金屬螯合劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該金屬是稀土金屬或第VIII族金屬。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該金屬選自銪、鋱、鏑、釤、鋨和釕。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該金屬是銪，該螯合劑是NHA和DPP，且該穩(wěn)定劑包含NHA 或 NHA 禾口 DPP。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該固體載體是顆粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該固體載體是膠乳顆粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該絡(luò)合物并入該該固體載體中。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中特異性結(jié)合對(duì)的成員與該固體載體締合。
10.用于測(cè)定被疑含有被分析物的樣品中被分析物的存在和/或量的化學(xué)發(fā)光試劑，該試劑在介質(zhì)中包含固體載體，該固體載體具有與其締合的特異性結(jié)合對(duì)的成員并具有并入其中的金屬和一種或多種螯合劑的絡(luò)合物，其中該介質(zhì)進(jìn)一步包含一種或多種選自螯合劑和金屬螯合物的穩(wěn)定劑，所述一種或多種穩(wěn)定劑的量足以增強(qiáng)該化學(xué)發(fā)光試劑的穩(wěn)定性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑，其中該穩(wěn)定劑是該絡(luò)合物的螯合劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑，其中該金屬是稀土金屬或第VIII族金屬。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑，其中該金屬選自銪、鋱、鏑、釤、鋨和釕。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑，其中該固體載體是顆粒。
15.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑，其中該固體載體是膠乳顆粒。
16.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑，其中該絡(luò)合物并入該固體載體中。
17.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑，其中該固體載體進(jìn)一步包含與其締合的光敏劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求10的試劑，其中該金屬是銪，該螯合劑是NHA和DPP，且該穩(wěn)定劑包含 NHA 或 NHA 和 DPP。
19.測(cè)定被疑含有被分析物的樣品中被分析物的存在和/或量的方法，該方法包括(a)在介質(zhì)以組合形式提供(i)該樣品，(ii)權(quán)利要求10的化學(xué)發(fā)光試劑，和(iii)與顆粒締合并能生成單態(tài)氧的光敏劑，其中被分析物的特異性結(jié)合對(duì)成員與至少一種固體載體或顆粒締合，(b)對(duì)該組合施加使被分析物結(jié)合到被分析物的特異性結(jié)合對(duì)成員上的條件，和(c)用光照射光敏劑并檢測(cè)該化學(xué)發(fā)光組合物產(chǎn)生的發(fā)光量，發(fā)光量與該樣品中被分析物的量相關(guān)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中與該光敏劑締合的顆粒是該化學(xué)發(fā)光試劑的固體載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中該金屬是銪，該螯合劑是NHA和DPP，且該穩(wěn)定劑包含 NHA 或 NHA 和 DPP。
全文摘要
公開了進(jìn)行檢測(cè)的方法和試劑。本方法和試劑的實(shí)施方案涉及固體載體，例如顆粒。該載體包含含金屬螯合物的化學(xué)發(fā)光組合物。本發(fā)明人觀察到，在用于測(cè)定被分析物的檢測(cè)中使用這樣的載體，例如顆粒時(shí)，與該顆粒締合的化學(xué)發(fā)光組合物的信號(hào)輸出的穩(wěn)定性與包含其它化學(xué)發(fā)光組合物的顆粒相比不可接受地降低。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，通過(guò)在包含該顆粒的介質(zhì)中包括足量的一種或多種穩(wěn)定劑，增強(qiáng)來(lái)自這些顆粒的信號(hào)輸出的穩(wěn)定性，所述穩(wěn)定劑可以是螯合劑和/或金屬螯合物，例如與該顆粒締合的金屬螯合物。
文檔編號(hào)C09K11/06GK102575156SQ201080047375
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日
發(fā)明者A.R.克雷格, C.莫蘭, C.謝爾普, J.斯奈德, 滕鑄 申請(qǐng)人:西門子醫(yī)療保健診斷公司