一種用于檢測pH值的熒光探針及其制備方法與專用檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測pH值的熒光探針及其制備方法與專用檢測試劑盒。本發(fā)明提供的用于檢測pH值的熒光探針的結構如式Ⅰ所示。本發(fā)明同時提供了式Ⅰ所示化合物的制備方法，包括如下步驟：(1)式Ⅳ所示二羥基苯甲醛和嗎啉經(jīng)還原反應，得到式Ⅴ所示取代嗎啉甲基苯基二醇；(2)惰性氣氛下，在堿存在的條件下，式Ⅴ所示取代嗎啉甲基苯基二醇與式Ⅵ所示三碳菁類染料經(jīng)取代分解重排反應，即得式Ⅰ所示化合物。本發(fā)明提供的用于檢測pH值的試劑盒，包括式Ⅰ所示化合物和溶劑。本發(fā)明提供的熒光探針及其專用檢測試劑盒對溶液pH具有良好響應，能夠實現(xiàn)對溶酶體的標記和細胞溶酶體pH值的測定，具有操作簡便，成本低，快速，靈敏，易于推廣和應用等優(yōu)點。
【專利說明】一種用于檢測pH值的熒光探針及其制備方法與專用檢測 試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測pH值的熒光探針及其制備方法與專用檢測試劑盒，屬 于化學分析、生物分析領域。

【背景技術】
[0002] 溶酶體（lysosomes)是真核細胞中的一種細胞器，pH值約為3. 8?5. 0,為單層 膜包被的囊狀結構，直徑約為〇. 025?0. 8微米，內(nèi)含多種水解酶。溶酶體的基本功能是對 生物大分子等物質(zhì)的消化與清除，并在維持細胞的正常代謝活動及防御微生物的侵染方面 扮演著重要的角色。因此，檢測溶酶體pH值及其隨環(huán)境因素的改變均具有重要的意義。目 前市場上具備標記溶酶體功能的探針有：美國探針公司的LysoTracker Red DND-99(Abs: 577nm ;Em :590nm), LysoTracker Deep Red(Abs :577nm ;Em :590nm)等；同時具備標記 溶酶體和比率測定溶酶體pH值功能的探針有：美國探針公司的LysoSensor? Yellow/ Blue DND-160 (PDMP0) (Abs ：329nm>384nm ；Em ：440nm>540nm), LysoSensor?Yellow/Blue dextran(Abs :335nm、381nm ;Em :452nm、521nm)等。這些探針存在諸如分析波長短，或不能 進行比率測定等弊端。而同時具備標記溶酶體和比率測定溶酶體pH值功能的近紅外探針 尚未見報道。
[0003] 半菁類染料具有良好的穩(wěn)定性，被廣泛應用于生物分析中；而基于半菁類染料衍 生的可選擇性標記與檢測溶酶體pH值的比率型近紅外熒光探針尚未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測pH值的熒光探針及其制備方法與專用檢測試 劑盒，該熒光探針為半菁類染料，可對水溶液的pH值進行檢測，同時可標記溶酶體和比率 測定溶酶體的pH值。
[0005] 本發(fā)明提供了一種式I所示化合物，
[0006]

【權利要求】
1. 式I所示化合物，
式I中，X為碳原子數(shù)為1?6的烷基、磺酸基取代的碳原子數(shù)為1?6的烷基、磺酸 鈉基取代的碳原子數(shù)為1?6的烷基和磺酸鉀基取代的碳原子數(shù)為1?6的烷基中的任一 種； Y的結構式如式II所示：
2. 根據(jù)權利要求1所述的化合物，其特征在于：其結構式如式III，
3. 權利要求1或2所述化合物的制備方法，包括如下步驟： (1) 式IV所示二羥基苯甲醛和嗎啉經(jīng)還原反應，得到式V所示取代嗎啉甲基苯基二 醇；
1 惰性氣氛下，在堿存在的條件下，式V所示取代嗎啉甲基苯基二醇與式VI所示三碳 菁類染料經(jīng)取代分解重排反應，即得式I所示化合物；
式VI 式VI中，X為碳原子數(shù)為1?6的烷基、磺酸基取代的碳原子數(shù)為1?6的烷基、磺酸 鈉基取代的碳原子數(shù)為1?6的烷基和磺酸鉀基取代的碳原子數(shù)為1?6的烷基中的任一 種；
式I中，X為碳原子數(shù)為1?6的烷基、磺酸基取代的碳原子數(shù)為1?6的烷基、磺酸 鈉基取代的碳原子數(shù)為1?6的烷基和磺酸鉀基取代的碳原子數(shù)為1?6的烷基中的任一 種； Y的結構式如式II所示：
4. 根據(jù)權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟（1)中，式IV所示二羥基苯甲醛 和所述嗎啉的摩爾比為1?5 :1 ; 所述還原反應在還原劑作用下進行；所述還原劑與式IV所示二羥基苯甲醛的摩爾比為 1 ?5 :1 ; 所述還原劑為H2、LiAlH4和NaBH4中任一種； 所述還原反應的反應溫度可為0?50°C ;反應時間可為10?200min ; 所述還原反應在有機溶劑中進行；所述有機溶劑為甲醇。
5. 根據(jù)權利要求3或4所述的制備方法，其特征在于：步驟⑵中，所述堿與式V所示 取代嗎啉甲基苯基二醇的摩爾比為0. 01?1 :1 ; 所述堿為有機堿和無機堿中的至少一種； 所述有機堿為三乙胺和吡啶中至少一種；所述無機堿為碳酸鉀、氫氧化鈉、碳酸鈉和碳 酸氫鈉中至少一種； 式VI所示三碳菁類染料與式V所示取代嗎啉甲基苯基二醇的摩爾比為1 :0. 1?1 ; 所述取代分解重排反應的反應溫度為40?100°C，；反應時間為1?10h ; 所述取代分解重排反應在有機溶劑中進行；所述有機溶劑為四氫呋喃、乙腈、N，N-二 甲基甲酰胺和二甲基亞砜中至少一種。
6. -種檢測pH值的試劑盒，包括式I所示化合物和溶劑； 式I所示化合物的濃度為0. OlmM?100mM ; 所述溶劑為水、乙醇和二甲基亞砜中任一種。
7. 式I所示化合物或權利要求6所述試劑盒在檢測水溶液pH值、檢測溶酶體pH值或 標記溶酶體中的應用。
8. -種溶酶體pH值的檢測方法，包括如下步驟： (1) 向載有式I所示化合物的樣品中分別加入至少3種不同pH值且均含有尼日利亞菌 素鈉的磷酸鹽緩沖溶液； 所述pH值為4?6 ; 所述式I所示化合物的濃度為InM?1 μ Μ ; 所述樣品為離體細胞； (2) 使用激光共聚焦顯微鏡或酶標儀進行熒光測試； 使用激光共聚焦顯微鏡進行熒光測試時，激發(fā)波長為635nm，選擇收集通道為大于 650nm小于750nm的任意兩個波段，分別測定不同pH值的所述樣品的熒光強度； 使用酶標儀測試時，激發(fā)波長為635nm，分別測定不同pH值的所述樣品在波長為670nm 和708nm處的熒光強度； (3) 使用激光共聚焦顯微鏡進行熒光測試時，計算兩個收集波段的熒光發(fā)射強度的比 值，以收集波段的熒光發(fā)射強度的比值為縱坐標，以pH值為橫坐標，建立標準曲線； 使用酶標儀進行測試時，計算波長為670nm和708nm的熒光強度的比值167(|/17(18或I 67Q/ Ιπ?，以I67Q/I7c?或I67Q/I7Q8為縱坐標，以pH值為橫坐標，建立標準曲線； (4) 在與步驟（2)中相同的條件下，測量載有式I所示化合物的溶酶體樣品與步驟（2) 所述波段相同的熒光發(fā)射強度比值，根據(jù)所述標準曲線即得出所述溶酶體樣品的pH值。
【文檔編號】C09B23/10GK104086536SQ201410301495
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月27日 優(yōu)先權日:2014年6月27日
【發(fā)明者】馬會民, 萬瓊瓊 申請人:中國科學院化學研究所