核苷酸的合成，可以使用任何已知的寡核苷酸標(biāo)記技術(shù)，使用已知的聯(lián)系，連接基團(tuán)，和相關(guān)的互補(bǔ)官能大量的完成。例如，標(biāo)記的寡核苷酸可被合成酶，例如，使用DNA聚合酶或連接酶。一般地,如果使用酶促合成標(biāo)記的寡核苷酸，可以使用下面的過(guò)程可能。的模板DNA變性的寡核苷酸引物退火到模板DNA。甲脫氧核苷三磷酸的混合物中加入包括三磷酸的dATP，dCTP標(biāo)記，和dTTP，其中至少有一個(gè)脫氧核苷酸的一小部分被標(biāo)記為與上述的本發(fā)明的染料化合物的反應(yīng)。接著，添加聚合酶聚合酶活性的條件下。標(biāo)記的多核苷酸摻入標(biāo)記的脫氧核苷酸聚合酶鏈合成過(guò)程中所形成的。在另一種酶的合成方法中，使用兩個(gè)引物，而不是一個(gè)，一個(gè)的+鏈和其他互補(bǔ)的目標(biāo)-鏈互補(bǔ)的引物，聚合酶是一種熱穩(wěn)定聚合酶，和反應(yīng)溫度之間循環(huán)的變性溫度和延伸溫度，從而成倍合成通過(guò)PCR,如Innis等，PCR方案,祀序列的標(biāo)記的補(bǔ)充。
[0022]一般地，如果是使用化學(xué)合成的標(biāo)記的寡核苷酸，它是優(yōu)選的，可以使用亞磷酰胺法。的多核苷酸合成的亞磷酰胺化合物和亞磷酰胺法合成寡核苷酸的，因?yàn)楦咝Ш涂焖俚鸟詈虾头€(wěn)定性的起始原料是優(yōu)選的。附著到固體支持物與不斷增長(zhǎng)的寡核苷酸鏈的合成，從而使過(guò)量的試劑，這是在液相中，可以很容易地通過(guò)過(guò)濾除去，從而消除了需要純化步驟之間的循環(huán)。
[0023]鑒于亞磷試劑標(biāo)記的核苷和寡核苷酸的效用，本發(fā)明還涉及亞磷酰胺化合物，其中包括本發(fā)明的能量轉(zhuǎn)移染料。
[0024]下面簡(jiǎn)要描述了一個(gè)典型的寡核苷酸的合成循環(huán)使用的亞磷酰胺法的步驟。首先，固體支持物，包括一個(gè)受保護(hù)的核苷酸單體與酸，例如，三氯乙酸，進(jìn)行處理，以除去5’_羥基的保護(hù)基團(tuán)，釋放的羥基為隨后的偶聯(lián)反應(yīng)。一種活化的中間體，然后由一個(gè)受保護(hù)的亞磷酰胺核苷單體和一種弱酸，如四唑，同時(shí)加入到反應(yīng)形成。弱的酸質(zhì)子化的氮原子形成的反應(yīng)性中間體的亞磷酰胺。核苷除了在30秒內(nèi)完成。接著，封蓋工序進(jìn)行終止核苷此外，并沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何多核苷酸鏈。旋蓋，最好是用乙酸酐和1-甲基咪唑。然后轉(zhuǎn)換到更穩(wěn)定的磷酸三酯的亞磷酸酯氧化，使用碘作為優(yōu)選的氧化劑和水作為氧供體。氧化后，除去羥基的保護(hù)基團(tuán)與質(zhì)子酸，例如，三氯乙酸或二氯乙酸，并重復(fù)該循環(huán)，直到鏈延長(zhǎng)完成。的多聚核苷酸鏈合成后，使用堿，例如，氫氧化銨或叔丁基胺從支承切割。裂解反應(yīng)也消除了任何保護(hù)基團(tuán)，例如，氰乙基磷酸。最后，染料的堿和羥基保護(hù)基的環(huán)外胺上的保護(hù)基的除去處理的多核苷酸的堿溶液中，在升高的溫度，例如，55°C。
[0025]不限亞磷核苷單體可以是染料標(biāo)記的亞磷酰胺。如果被標(biāo)記的核苷酸的5’ -末端的位置，本發(fā)明的標(biāo)記的非核苷酸亞磷酰胺，也可以使用在最后的縮合步驟。如果是被標(biāo)記的寡核苷酸的內(nèi)部位置，本發(fā)明的標(biāo)記的核苷酸亞磷酰胺的過(guò)程中可以使用任何縮合步驟。
[0026]4、染料和試劑的方法
能量轉(zhuǎn)移染料和本發(fā)明的試劑，可以使用各種各樣的方法，用于檢測(cè)樣品中的一個(gè)組成部分的存在下用試劑含有染料標(biāo)記樣品中的成分。特別是，本發(fā)明的能量轉(zhuǎn)移染料和試劑非常適合使用的方法相結(jié)合的分離和熒光檢測(cè)技術(shù)，特別是需要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)在空間上重疊的分析物的方法。例如，染料和試劑特別適合于吞吐量的寡核苷酸類(lèi)已經(jīng)經(jīng)受生化分離過(guò)程，如電泳，其中一系列的帶或點(diǎn)的目標(biāo)物質(zhì)具有相似的理化性質(zhì)，如大小，構(gòu)象，電荷，疏水性，或類(lèi)似物，是存在于直鏈或平面布置。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“帶”包括相似或相同的物理化學(xué)性質(zhì)的基礎(chǔ)上，任何空間分組或聚集的分析物。一般條帶中產(chǎn)生的染料的寡核苷酸的結(jié)合物，通過(guò)電泳分離。
[0027]寡核苷酸可以在多種情況下出現(xiàn)。在一類(lèi)優(yōu)選的方法在本文中稱(chēng)為“片段分析”或“遺傳分析”的方法中，標(biāo)記的寡核苷酸片段生成通過(guò)模板的酶促合成使用標(biāo)記的引物或核苷酸的，例如，通過(guò)連接或聚合酶的引物延伸；片段的大小依賴(lài)的分離過(guò)程中進(jìn)行，例如，電泳或色譜法，分離的片段被檢測(cè)分離后，例如，通過(guò)激光誘導(dǎo)熒光。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的寡核苷酸的多個(gè)類(lèi)的同時(shí)，光譜解析標(biāo)簽的區(qū)別在于不同的類(lèi)。
[0028]一個(gè)這樣的片段的分析方法，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分布檢測(cè)是根據(jù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，即，通過(guò)PCR擴(kuò)增的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。這些擴(kuò)增片段大小不等作為連鎖突變基因通過(guò)家庭。擴(kuò)增片段的突變基因在染色體上的，聯(lián)動(dòng)的相關(guān)性越高越接近。由于許多遺傳性疾病的基因還沒(méi)有被確定，這些連鎖服務(wù)，以幫助評(píng)估疾病風(fēng)險(xiǎn)或侍。在AmpFLPs技術(shù)的多核苷酸可以被標(biāo)記使用的標(biāo)記的寡核苷酸PCR引物，或者通過(guò)利用在PCR標(biāo)記的三磷酸核苷。
[0029]另一個(gè)片段的分析方法是缺口翻譯。切口平移涉及與標(biāo)記的未標(biāo)記的雙鏈DNA分子中的核苷酸三磷酸酯的反應(yīng)，以取代。未標(biāo)記的DNA游離的3’-羥基內(nèi)創(chuàng)建的“刻痕”所造成的脫氧核糖核酸酶I (DNA酶I)的治療DNA聚合酶I催化另外的標(biāo)記的核苷酸的3’ -羥基末端的缺口。在同一時(shí)間，3’-核酸外切酶活性的這種酶的5’消除的核苷酸單元的缺口從5’ -磷?；┒?。一種新的核苷酸與游離的3’ -OH基團(tuán)結(jié)合的位置處的原始切除核苷酸，和家族的3’方向上由一個(gè)核苷酸單元一起被轉(zhuǎn)移。此3’轉(zhuǎn)變將導(dǎo)致新的標(biāo)記的核苷酸的DNA，與現(xiàn)有的未標(biāo)記的核苷酸的去除順序加入。然后分析了利用分離過(guò)程，例如，電泳缺口轉(zhuǎn)譯的多核苷酸。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供了一種方法用于使用一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的能量轉(zhuǎn)移染料標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸進(jìn)行染料終止子測(cè)序。根據(jù)該方法，在脫氧核苷三磷酸的存在下，至少一種熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸三磷酸，DNA聚合酶的核酸序列雜交的寡核苷酸引物延伸的引物的混合物所形成的。的熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸三磷酸包括一個(gè)能量傳遞的本發(fā)明的熒光染料標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸。
[0031]根據(jù)該方法，DNA聚合酶延伸的引物與脫氧核苷三磷酸，直到延伸的引物結(jié)合到熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸。終止后，延伸的引物的混合物是分開(kāi)的。的核酸序列的序列，然后確定通過(guò)檢測(cè)連接到延伸的引物的熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷。
[0032]在此方法的另一個(gè)實(shí)施例，延伸引物形成的混合物的步驟包括與四種不同的熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸，即，一個(gè)熒光標(biāo)記，三磷酸，熒光標(biāo)記的二脫氧腺苷三磷酸，熒光標(biāo)記的三磷酸雜交的核酸序列，熒光標(biāo)記的雙脫氧胸苷三磷酸。
[0033]5、結(jié)合能量轉(zhuǎn)移染料的套件
本發(fā)明還涉及具有能量轉(zhuǎn)移的熒光染料和/或試劑的組合的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施例中，該套件包括根據(jù)本發(fā)明的至少兩個(gè)頻譜解析的能量轉(zhuǎn)移染料。在此試劑盒中，能量轉(zhuǎn)移染料優(yōu)選包括使一個(gè)單一的光源是需要激發(fā)的染料相同的供體染料。
[0034]在另一個(gè)實(shí)施例中，該套件包括的三磷酸，二脫氧腺苷三磷酸，三磷酸，雙脫氧胸苷三磷酸，每個(gè)根據(jù)本發(fā)明的能量轉(zhuǎn)移染料標(biāo)記的雙脫氧核苷酸三磷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，各能量轉(zhuǎn)移染料從連接到其他的三磷酸雙脫氧核苷酸的其他能量轉(zhuǎn)移染料光譜解析。在這個(gè)套件中，能量轉(zhuǎn)移染料最好包括相同的第一咕噸染料。
[0035]在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括至少兩個(gè)寡核苷酸，每個(gè)寡核苷酸，包括根據(jù)本發(fā)明的能量轉(zhuǎn)移染料。在一個(gè)實(shí)施例中，每個(gè)寡核苷酸包含的能量轉(zhuǎn)移染料，該染料的光譜解析連接到其他的寡核苷酸的染料的能量傳遞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包括至少四個(gè)均含有一組光譜解析的能量轉(zhuǎn)移染料的寡核苷酸。
[0036]通過(guò)下列實(shí)施例示出的能量轉(zhuǎn)移的熒光染料，它們?cè)贒NA測(cè)序。實(shí)施例，上述規(guī)定以外的進(jìn)一步的目的和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。
[0037]前述說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的說(shuō)明和描述的目的已經(jīng)呈現(xiàn)。它的目的不是窮舉或?qū)⒈景l(fā)明限制為所公開(kāi)的精確形式。很顯然，許多修改和變化將是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的從業(yè)者，都將落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.能量轉(zhuǎn)移增強(qiáng)熒光染料，其特征在于，包括:能夠在響應(yīng)于所述第一波長(zhǎng)發(fā)光的激發(fā)能量，受體染料能夠吸收激發(fā)能量由供體染料和熒光的第二光吸收咕噸供體染料波長(zhǎng)響應(yīng)于此，和一個(gè)非的核苷連接器連接的5 -或6元環(huán)的位置供體染料的5 -或6元環(huán)的位置的受體染料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中供體染料的熒光素染料的染料的能量傳遞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中鏈接器具有長(zhǎng)度小于9個(gè)原子的主鏈?zhǔn)悄芰哭D(zhuǎn)移染料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能量轉(zhuǎn)移染料，其中的官能團(tuán)選自烯烴，二烯，炔烴，具有至少一個(gè)不飽和鍵的五元環(huán)，六元環(huán)上具有至少一個(gè)不飽和鍵和稠合的環(huán)結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1還包括一個(gè)連接基團(tuán)，合適的用于將能量轉(zhuǎn)移到另一種物質(zhì)的染料的染料的能量傳遞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其中連接基團(tuán)連接的4’-位的的4，7- dichlororhodamine受體染料的染料的能量傳遞。
【專(zhuān)利摘要】能量轉(zhuǎn)移增強(qiáng)熒光染料，提供鏈接供體染料受體染料中的能量轉(zhuǎn)移熒光染料的新型連接器。這些連接器便成了一個(gè)供體和受體染料中的能量轉(zhuǎn)移染料之間的能量傳輸效率。這些連接子連接的供體到受體染料的染料中的能量轉(zhuǎn)移熒光染料的一般結(jié)構(gòu)R.sub.21Z.sub.1C（O）R.sub.22R.sub.28R.是一個(gè)sub.21C.sub.1-5烷基連接的供體染料，C（O）為羰基，Z.sub.1是一個(gè)取代基，該取代基可以是NH，硫或氧，R.sub.22包括鏈烯烴，二烯烴，炔烴，五和六元環(huán)上具有至少一個(gè)不飽和鍵或稠環(huán)結(jié)構(gòu)，它是連接到羰基碳和R.sub.28包括附加連接器的接受器的官能團(tuán)的染色。
【IPC分類(lèi)】G01N21-64, C09B57-00, C09K11-06, C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104592783
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310533714
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】新昌縣冠陽(yáng)技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司
【公開(kāi)日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2013年11月4日