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      細胞色素氧化酶cyp1a的比率型熒光探針底物及其應用

      文檔序號:9466473閱讀:1614來源:國知局
      細胞色素氧化酶cyp1a的比率型熒光探針底物及其應用
      【技術領域】
      [0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域,具體設及一種細胞色素氧化酶CYPlA的比率型巧 光探針反應及其應用。
      【背景技術】
      [0002] 細胞色素P450酶系(巧toe虹omeP450,P450酶)超家族是機體內(nèi)最重要的藥物 代謝酶,大約60%的藥物(包括絕大部分臨床藥物和殺蟲劑)的主要清除是由CYP介導的。 細胞色素P450酶系是一個蛋白質(zhì)超家族,是一大類含血紅素的蛋白質(zhì),在還原態(tài)時與CO形 成的復合物于450nm處有最大吸收峰。因其催化的I相反應是化合物在體內(nèi)代謝的關鍵步 驟,因為運一步反應通常是藥物從體內(nèi)清除的限速步驟,可影響化合物的半衰期、清除率等 動力學特征,且P450酶活性常隨遺傳因素、年齡、疾病狀態(tài)或其它藥物相互作用的影響而 發(fā)生改變。藥物對機體P450酶的影響,能造成臨床上顯著的藥物相互作用。
      [0003] CYPlA是重要的I相代謝酶,主要包括兩種亞型:CYP1A1和CYP1A2,其中CYPlAl主 要在人肺中表達,而CYP1A2則主要在人肝中表達,且占人肝中CYP總量的13%。CYPlA也 參與多種藥物例如茶堿、咖啡因、安替比林等,W及環(huán)境毒素和內(nèi)源性底物的代謝,并在多 種前致癌物被激活成具有遺傳毒性中間體或最終致癌物的過程中起到了重要作用,例如 在一定程度上激活咖啡因誘使肝硬化的發(fā)生(M0LASPECTSME化1999. 20 :1-137)。除此之 夕bCYPlA的活性在不同人種中也有很大的個體差異,人口研究發(fā)現(xiàn)CYPlA在不同人種中可 能會呈現(xiàn)單峰、雙峰甚至S峰的分布巧urJClin化armacol. 1995. 47:423-430)。因此,開 展CYPlA酶活的個體差異研究對于臨床個性化安全用藥有著重要意義。目前國內(nèi)外制藥巨 頭在藥物開發(fā)過程中,需要在體外評估各候選新藥抑制CYPlA的能力。因此,開發(fā)高效、靈 敏的特異性CYPlA探針底物對于高效篩選CYPlA抑制劑,及定量測定生物體系內(nèi)CYPlA的 活性至關重要。
      [0004] 由于CYPlA亞家族中的各亞型具有相似的氨基酸序列,其底物通常相互交疊,因 此各亞型酶鮮有特異性的底物。目前,已報道的CYPlA的巧光探針底物有3個,分別是3-氯 基-7-乙氧基香豆素,乙氧基試面靈和巧光素-ME-EGE。運些已知的巧光底物均屬于Off-on 型探針,單酶選擇性并不高且易受生物基質(zhì)的干擾,定量誤差較大。而比率型探針發(fā)射光譜 的藍移/紅移則可用于比率檢測,且此時探針分子原型可作為內(nèi)部校準來減小光照強度、 探針濃度、樣品不均勻、儀器參數(shù)等對定量分析的影響。因此,開發(fā)高選擇性的CYPlA比率 型巧光探針反應及其配套的高通量檢測方法具有重要的實用價值。

      【發(fā)明內(nèi)容】
      陽0化]
      [0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種細胞色素氧化酶CYPlA的比率型巧光探針底物及其 應用,該比率型巧光探針底物和去甲基化產(chǎn)物的巧光發(fā)射波長具有明顯差異,且產(chǎn)物的巧 光量子產(chǎn)率更高更易檢測。利用該探針反應可對多種生物體系中CYPlA的分布和功能進行 定量評價。
      [0007] 本發(fā)明提供了一種細胞色素氧化酶CYPlA的比率型巧光探針底物,該探針底物可 被CYPlA特異性催化生成相應的0-去甲基化產(chǎn)物,該底物具有1,8-糞酷亞胺類結構,其結 構式如下:
      [0008]
      [0009] 其中,R為-C00H、苯甲酸、-SO3H中的任意一種,n為2~10。
      [0010] 本發(fā)明還提供一種細胞色素氧化酶CYPlA的比率型巧光探針底物的應用,采用該 CYPlA亞酶的特異性底物,與含CYPlA的生物樣品混合后進行酶促反應,通過定量檢測單位 時間內(nèi)的底物消除率或其去甲基化產(chǎn)物的生成率來定量測定不同生物體系中CYPlA的活 性,具體測定方法及條件如下:
      [0011] A.體系中W1,8-糞酷亞胺類化合物作為比率型探針底物;底物濃度選擇1/10~ IOKm;單點測定時底物濃度優(yōu)選Km;
      [0012] B.在PBS緩沖液中,反應溫度為20°C至60°C之間,優(yōu)選37°C為最優(yōu)反應時間;解 育體系抑介于5. 5~10. 5之間,優(yōu)選抑7. 4為最優(yōu)反應抑值; 陽01引 C.反應時間為5~120分鐘,確保W上底物相應的0-去甲基化產(chǎn)物達到定量限且 底物轉(zhuǎn)化率不超過20%時終止反應;
      [0014] 化測定單位時間內(nèi)底物減少量或0-去甲基化產(chǎn)物生成量作為CYPlA活性的評價 指標。
      [0015] 所述的細胞色素氧化酶CYPlA的比率型巧光探針底物應用,其特征還在于所述的 生物體系為重組表達CYPlA單酶、人或動物組織制備液、各類哺乳動物組織細胞及其制備 物中的任意一種。
      [0016] 該探針底物及其去甲基化產(chǎn)物的巧光信號需采用不同檢測波長去檢測,去甲基 化產(chǎn)物及底物的巧光檢測條件分別為:激發(fā)波長450, 372nm,最大發(fā)射波長分別為564, 452nm〇
      [0017] 該探針底物還可用于CYPlA抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價。
      [0018] 該探針底物也可作為實驗動物在體及整體CYPlA的探針底物,評估代謝酶CYPlA 的個體及種屬差異。
      [0019] 本發(fā)明提供的細胞色素氧化酶CYPlA的比率型巧光探針反應的應用,該探針底物 及其0-去甲基化產(chǎn)物均具有巧光屬性,且兩者具有不同的光學屬性,可采用巧光檢測器同 時實現(xiàn)底物及產(chǎn)物的快速、靈敏檢測;0-去甲基化產(chǎn)物及底物巧光檢測條件分別為:激發(fā) 波長372,450nm,最大發(fā)射波長為450, 564nm如圖3所示。
      [0020] 該特異性探針底物為比率型巧光探針,其在CYPlA活性檢測過程不易受生物體系 基質(zhì)及雜質(zhì)的干擾,可用于各種重組CYP1A、人及動物組織制備液及各類組織細胞中CYPlA 酶活的定量測定;同時也可作為在體及動物整體CYPlA的探針底物,評估代謝酶CYPlA的個 體及種屬差異。該探針底物及0-去甲基化代謝產(chǎn)物的巧光檢測方法還可用于CYPlA抑制 劑的快速篩選及抑制能力的定量評價。
      [0021] 采用重組細胞色素氧化酶CYPlA單酶,肝微粒體解育體系進行考察,通過相關性 分析(如圖5所示),重組單酶代謝反應(如圖6所示),特異性抑制實驗(如圖7所示), W及酶反應動力學幾方面的證據(jù),證明1,8-糞酷亞胺類化合物可特異性的經(jīng)細胞色素氧 化酶CYPlA代謝(如圖8所示),生成0-去甲基化氧化產(chǎn)物。進一步采用各種哺乳動物的 新鮮提取的肝細胞、原代培養(yǎng)肝細胞、肝切片、肝灌流等代謝評價體系進行考察,發(fā)現(xiàn)該 代謝反應具有非常良好的特異性。
      [0022] 作為高特異性的細胞色素氧化酶CYPlA單酶的巧光探針底物,該化合物可W用來 檢測CYPlA的活性,尤其適合用于對細菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞W及酵母菌克隆表達體 系生產(chǎn)的CYPlA的酶活測定,W及多種哺乳動物組織器官來源的微粒體、S-9等制備物中 CYPlA的活性標定。
      [0023] 選用本發(fā)明所述細胞色素氧化酶CYPlA單酶的比率型巧光探針反應檢細胞色素 氧化酶CYPlA單酶體外活性具有W下突出優(yōu)勢:
      [0024] (1)高特異性:1,8-糞酷亞胺類化合物可被細胞色素氧化酶CYPlA單酶高特異性 地代謝成一個代謝產(chǎn)物,即0-去甲基化產(chǎn)物。
      [00巧](2)廉價易得:1,8-糞酷亞胺類化合物可經(jīng)化學合成獲得,合成工藝簡單易行,巧 光方法檢測成本低。
      [00%] (3)高靈敏度:具有1,8-糞酷亞胺母核結構的化合物均具有良好的巧光發(fā)射光譜 特性(450~700nm),且該底物及其0-去甲基化代謝產(chǎn)物具有不同的巧光發(fā)射光譜特征,能 較好的進行區(qū)分檢測,同時可通過比率型標準曲線的建立進行定量測定CYPlA單酶的檢測 下限為0. 2nM/ml。
      【附圖說明】
      [0027] 圖1. 1,8-糞酷亞胺類化合物的結構通式; 陽02引 圖2.N-(3-簇丙基)-4-甲氧基-1,8-糞酷亞胺的IH-NMR譜圖;
      [0029] 圖3.N-(3-簇丙基)-4-甲氧基-1,8-糞酷亞胺及其0-去甲基化代謝產(chǎn)物的紫外 吸收光譜圖(分別在372nm和450nm有最大吸收); W30] 圖4. 14例HLM對N- (3-簇丙基)-4-甲氧基-1,8-糞酷亞胺的代謝圖;
      [0031] 圖5.N-(3-簇丙基)-4-甲氧基-1,8-糞酷亞胺及其0-去甲基化代謝速率與非那 西汀的0-脫乙基代謝速率的相關性分析實驗;
      [0032] 圖6.N- (3-簇丙基)-4-甲氧基-1,8-糞酷亞胺的人CYP重組單酶篩選試驗結果;
      [003引圖7.N-(3-簇丙基)-4-甲氧基-1,8-糞酷亞胺在人肝中的化學抑制實驗結果;
      [0034] 圖8.CYPlA介導N- (3-簇丙基)-4-甲氧基-1,8-糞酷亞胺的代謝通路;
      [0035] 圖9.N-(3-簇丙基)-4-甲氧基-1,8-糞酷亞胺的合成路線。
      【具體實施方式】
      [0036] 下面的實施例將對本發(fā)明予W進一步的說明,但并不因此而限制本發(fā)明。
      [0037] 本發(fā)明所采用的設備及其型號為:巧光發(fā)射/激發(fā)光譜是由Synergy化全功能微 孔板檢測儀檢測完成;Ih-NMR譜圖是由核磁共振波譜儀(AvanceII400MHz)檢測完成。 陽0測實施例1
      [0039]N-(3-簇丙基)-4-甲氧基-1,8-糞酷亞胺的合成路線 柳4〇] (1)化合物1的合成
      [0041] 將4. 2mmol4-氨基下酸加入到含有l(wèi)g(3.61mmol)4-漠-1,8糞酢的50ml乙醇溶 液中,70-80°C反應過夜后,加入200ml水,析出大量固體,過濾,真空干燥得到米黃色固體 N- (3-簇丙基)-4-漠-1,8-糞酷亞胺,產(chǎn)率80-90 %。
      [0042] 似化合物2的合成 陽0創(chuàng)將SOOmg化合物1與2. 54g碳酸鐘置于100mL單口瓶中,加入30ml甲醇,60-70°C反應過夜后,冷卻,用IM的鹽酸將抑調(diào)至酸性,析出大量黃色固體,過濾,大量水洗,真空干 燥得到黃色固體N-(3-簇丙基)-4-甲氧基-1,8-糞酷亞胺,產(chǎn)率80-90%。 W44] 化合物1、2的結構如圖9所示,N-(3-簇丙基)-4-甲氧基-1,8-糞酷亞胺及其 0-去甲基化代謝產(chǎn)物的紫外吸收光譜圖如圖3所示,分別在372nm和450nm有最大吸收; 制備的化合物2的核磁共振波譜分析圖2所示,具體如下: 陽045]IhNMR(400MHz,DMSO) 5 = 1 2 . 0 5 (s, 1H) , 8 . 4 9 (ddd,J= 8. 4, 7. 8, 1. 1,2H),8. 43 (d,J= 8. 3, 1H),7. 80 (dd,J= 8. 3, 7. 4, 1H),7. 31 (d,J= 8. 4, 1H),4. 13 (S, 3H),4. 06 (t,J= 7. 0, 2H),2. 30 (t,J= 7. 4, 2H),1. 88 (P,J= 7
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