一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子可逆型熒光探針FO-PSe及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于合成領(lǐng)域，特別涉及一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子可逆型熒光探針 FO-PSe及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 次氯酸在人體內(nèi)是重要的活性氧之一，它在生物體的生理和病理等方面都起著至 關(guān)重要的作用。在生物體中過氧化氫和氯離子在髓過氧化物酶的催化作用下能夠發(fā)生化學(xué) 反應(yīng)，產(chǎn)物次氯酸根及其質(zhì)子化的形式即次氯酸在生理?xiàng)l件下存在于生物體內(nèi)。次氯酸是 一種具有強(qiáng)親核能力的的氧化性物質(zhì)，它可以與生物體內(nèi)的多種分子如RNA，DNA，脂肪酸， 膽固醇及多種蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。次氯酸最顯著的作用是其強(qiáng)抗菌性，它是通過把某種病毒 接觸反應(yīng)中所需的酶氧化掉，從而達(dá)到殺菌抗菌的目的。如果次氯酸的濃度出現(xiàn)異常，就會(huì) 對(duì)生命體系造成極大的破壞，同時(shí)引發(fā)一些嚴(yán)重的疾病，如關(guān)節(jié)炎，動(dòng)脈硬化及一些癌癥 等，因此發(fā)展用于次氯酸檢測(cè)的工具是很有意義的。
[0003] 近幾年來，已報(bào)道了 HC10的熒光探針數(shù)種，如DCFH、DHR(參見文獻(xiàn):A.Bizyukin，et al，Bull.Exp .Biol .Med. 1995,119，347 · )、APF(文獻(xiàn)：T.Nagano，J.Biol.Chem. 2003，278， 3170.)、]\^切厶1?(文獻(xiàn)：1'.似8311〇.1.厶111.〇16111.5〇(3.2007，129，10324.)等，但以上探針除了能 夠檢測(cè)HC10,對(duì)其他的活性氧物種亦有不同程度的熒光響應(yīng)。由于每種活性氧都有其各自 獨(dú)特的生理或病理作用，因此對(duì)專一性強(qiáng)的HC10熒光探針的需求顯得尤為迫切。已報(bào)道的 另外一些HC10探針中，有的需在pH12的苛刻的操作條件（文獻(xiàn):H.M.Ma，Chem.Eur.J.2008， 14，4719·)，或水溶性差(文獻(xiàn):W·Tan，et al，Chem.Eur · J· 2009，15，2305 ·)，無法真正應(yīng)用 于生物體系中。目前，能夠真正應(yīng)用于細(xì)胞中HC10檢測(cè)的熒光探針極少，需在繁瑣苛刻的條 件下多步驟高成本制備而得（文獻(xiàn)：T. Nagano，J. Am. Chem. Soc . 2007，129，7313 .;文獻(xiàn)： J · Tae，0rg · Lett · 2009，11，（4)，859 ·;文獻(xiàn)：R. Weissleder，P · Libby，Chem.Biol · 2007，14， 1221.)〇
[0004] 熒光法具有高靈敏度、高選擇性、簡(jiǎn)單方便、實(shí)時(shí)原位檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，使其在生命和 環(huán)境科學(xué)、分析化學(xué)等領(lǐng)域有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用前景。因此設(shè)計(jì)高靈敏度、高選擇性、快速識(shí) 別的新型次氯酸熒光探針得到人們?cè)絹矶嗟闹匾?，同時(shí)也成為一項(xiàng)非常重要的課題。雙光 子熒光探針被廣泛用于生物成像領(lǐng)域，由于其對(duì)生物組織樣品較低的光損傷、較深的組織 穿透能力、較低的生物背景熒光干擾等優(yōu)點(diǎn)。因此，新型的雙光子熒光探針的合成和發(fā)展是 非常必要的，尤其可逆型的雙光子的設(shè)計(jì)、合成還是非常具有挑戰(zhàn)性的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于彌補(bǔ)目前次氯酸檢測(cè)中，雙光子可逆型熒光探針較少的狀況，簡(jiǎn) 易、高效地合成了一種雙光子可逆型熒光探針(FO-PSe)，可逆是指熒光探針(FO-PSe)可與 次氯酸發(fā)生氧化反應(yīng)，熒光增強(qiáng);之后又可與GSH發(fā)生還原反應(yīng)，熒光減弱，如此循環(huán)多次。 將其成功應(yīng)用于活細(xì)胞及活體中次氯酸的成像分析，而且可以實(shí)現(xiàn)活體中腹腔部位不同深 度次氯酸的成像分析，基本無背景熒光，效果良好。
[0006] 一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子可逆型熒光探針FO-PSe，其結(jié)構(gòu)式為：
[0008]上述的探針FO-PSe的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 取原料1和2溶于N，N_二甲基甲酰胺溶液，加入適量的二硫蘇糖醇和1，8_二氮雜雙 環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯，于75-100°0反應(yīng)25-401!，萃取、干燥、二次溶解、過柱分離，即得； [0010]所述原料1的結(jié)構(gòu)式為：
[0012] 所述原料2為二苯基二硒。
[0014] 優(yōu)選的，上述原料1和2、二硫蘇糖醇、1，8_二氮雜雙環(huán)[5.4.0]^碳-7-烯、N，N-二甲基甲酰胺物質(zhì)的量之比為1-2:3-6:5-10:10-15。
[0015] 優(yōu)選的，上述過柱分離所用洗脫劑體積比為石油醚:二氯甲烷5-9:1_2(V/V)。
[0016] 上述的探針FO-PSe可用于檢測(cè)生物體內(nèi)或外的次氯酸含量。
[0017]上述的探針FO-PSe可用于定量檢測(cè)次氯酸。
[0018] 上述的探針FO-PSe可用于活細(xì)胞和斑馬魚及小鼠的活體成像。
[0019]上述的探針FO-PSe可用于激光共聚焦成像。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子激光檢測(cè)系統(tǒng)，包括雙光子激光共 聚焦顯微鏡和上述的探針FO-PSe。
[0021 ]本發(fā)明還發(fā)現(xiàn):探針FO-PSe檢測(cè)生物體內(nèi)或外的次氯酸時(shí)，優(yōu)選的激發(fā)光的波長(zhǎng) 為425_450nm或800~825nm。
[0022]本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了一種用于次氯酸檢測(cè)的雙光子可逆型熒光探針，命名為F0-PSe，它具有雙光子性質(zhì)，并且是可逆型的熒光探針。我們成功地將其應(yīng)用于活細(xì)胞及活體 內(nèi)次氯酸的研究，取得了良好的效果。其簡(jiǎn)易、高效的合成步驟及優(yōu)良的光物理性質(zhì)屬于合 成與技術(shù)領(lǐng)域。
[0023]通常，可以將染料分子溶解在緩沖液或由DMS0等水溶性有機(jī)溶劑中，然后加入適 當(dāng)緩沖液及其他有機(jī)試劑進(jìn)行測(cè)試。我們分別研究了探針FO-PSe在pH = 7.4緩沖水溶液及 各種常見的有機(jī)試劑中的光物理性質(zhì)并將其用于活細(xì)胞和斑馬魚及小鼠活體成像實(shí)驗(yàn)?；?細(xì)胞和斑馬魚活體的染色方法是將探針加入培養(yǎng)好的活細(xì)胞或斑馬魚培養(yǎng)液中，孵育一定 的時(shí)間去除孵育液，并用PBS緩沖液洗滌3次，然后進(jìn)行激光共聚焦成像）。小鼠活體染色的 方法是用注射器將探針分子注射到老鼠腹腔部位，然后進(jìn)行激光共聚焦成像。
[0024]本發(fā)明利用以前已有的原料中間體1和2,由一步簡(jiǎn)易、高效合成，最后經(jīng)過薄層色 譜柱分離得到探針FO-PSe。
[0025] 本發(fā)明的有益效果是：
[0026] (1)該探針分子具有雙光子性質(zhì)，有效地降低了自吸收，提高了成像準(zhǔn)確度。
[0027] (2)該探針對(duì)次氯酸具有可逆性，可以動(dòng)態(tài)可逆的檢測(cè)生物體系中次氯酸的濃度 變化。
[0028] (3)活細(xì)胞和斑馬魚及小鼠染色效果良好。染色時(shí)間較短（lOmin)，染色效率較高。 [0029] (4)合成步驟相對(duì)簡(jiǎn)單、產(chǎn)率較高、容易純化。
【附圖說明】
[0030]圖1是本發(fā)明新型熒光探針的激發(fā)光譜及發(fā)射光譜譜圖，其中a為激發(fā)光譜，激發(fā) 波長(zhǎng)為425nm，b為發(fā)射光譜，發(fā)射波長(zhǎng)為530nm;橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(nm)，縱坐標(biāo)為焚光強(qiáng)度。 [0031]圖2是本發(fā)明新型熒光探針與次氯酸作用前后的雙光子熒光發(fā)射譜圖，其中a為熒 光探針與次氯酸作用前的雙光子發(fā)射光譜，b為熒光探針與次氯酸作用后的雙光子發(fā)射光 譜;橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(nm)，縱坐標(biāo)為熒光發(fā)射強(qiáng)度。
[0032]圖3是本發(fā)明新型熒光探針（ΙΟμΜ)與加入不同濃度的次氯酸(0-100μΜ)，單光子熒 光光譜。Inset:探針的熒光強(qiáng)度與次氯酸濃度的線性相關(guān)性。
[0033] 圖4是本發(fā)明新型熒光探針細(xì)胞成像圖，即與巨噬細(xì)胞單光子熒光成像和雙光子 熒光成像圖。
[0034] 圖5是本發(fā)明新型熒光探針在斑馬魚的熒光成像圖。
[0035] 圖6是本發(fā)明新型熒光探針在小鼠腹腔部位的熒光成像圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0037] 實(shí)施例1:熒光探針的合成
[0038] 在氬氣保護(hù)下，將化合物1 (0.374g，1.2mmol)和二硫蘇糖醇(0.308g，2. Ommol)溶 于N，N-二甲基甲酰胺10-15mL中，75-100°C反應(yīng)30min后加入化合物2(0.135g，0.4mmol)，繼 續(xù)攪拌20min，加入 1，8_二氮雜雙環(huán)[5.4.0]^碳-7-烯(0· 75ml，5 ·Ommol)，75_100°C反應(yīng) 25-40h。反應(yīng)完畢后，將混合液分別用二氯甲烷和飽和碳酸氫鈉萃取，將有機(jī)相用無水硫酸 鎂干燥。然后重新溶解過柱分離，得橙紅色固體(40 % -80 % )。
[0039]核磁及質(zhì)譜表征：
[0040] 4 NMR(400MHz，CDCl3):S7.594(s，2H;Ar H)，7.528(d，2H;Ar H)，7.456(d，2H;Ar H)，7.180-7.248(m，10H;Ar H).13C NMR(100MHz，CDC13)S191.54，141.72，137.18，132.77， 132.53,130.59,128.60,127.17,127.06,126.69,119.94.77Se 匪R(150MHz，CDC13): δ 431.4.MS data,m/z:492.9619(M+H)
[0041 ]效果實(shí)驗(yàn)：
[0042]探針的單光子激發(fā)發(fā)射實(shí)驗(yàn)和雙光子熒光發(fā)射實(shí)驗(yàn)：
[0043] FO-PSe探針測(cè)量其單光子激發(fā)發(fā)射實(shí)驗(yàn)，單光子激發(fā)和發(fā)射譜圖顯示于圖1。圖1 橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(nm)，縱坐標(biāo)表不焚光強(qiáng)度。焚光探針與次氯酸作用前后的雙光子焚光發(fā)射 譜圖顯示于圖2;橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(nm)，縱坐標(biāo)為熒光發(fā)射強(qiáng)度。其中雙光子實(shí)驗(yàn)的激發(fā)為 800nm，可以有效的避免自體熒光，從而提高檢測(cè)的靈敏度。探針FO-PSe與不同濃度的次氯 酸反應(yīng)導(dǎo)致的熒光性質(zhì)變化如圖3所示。隨著次氯酸濃度的增加，探針的熒光強(qiáng)度逐漸增 強(qiáng)。次氯酸濃度在5.0 X 10_6~1.0 X 10、的范圍內(nèi)，F(xiàn)O-PSe探針的熒光強(qiáng)度與次氯酸濃度 存在良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為〇. 992，檢測(cè)限為0.35μΜ(η = 1 land S/N=3)。
[0044]探針對(duì)活細(xì)胞和斑馬魚及小鼠活體染色成像實(shí)驗(yàn)：
[0045]巨噬細(xì)胞由高糖的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別加入ΙΟμΜ的探針HEPES水溶液，37°C中孵 育10分鐘，然后將細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦熒光成像，可以看出其對(duì)活細(xì)胞染色效果較好，由于 其在水中基本無熒光，因此細(xì)胞背景較低（圖3)。
[0046] 將斑馬魚加入20μΜ探針HEPES溶液，孵育0.5小時(shí)，然后將斑馬魚進(jìn)行激光共聚焦 熒光成像，可以看出其對(duì)斑馬魚染色效果較好，基本無背景熒光(圖4)。
[0047]在小鼠腹腔部位加入20μΜ探針HEPES溶液，然后將小鼠腹腔部位進(jìn)行激光共聚焦 熒光成像，可以看出其對(duì)小鼠腹腔部位成像效果較好，基本無背景熒光(圖5)。
[0048]實(shí)施例2:熒光探針的合成
[0049] 在氬氣保護(hù)下，將化合物1 (0.374g，1.2mmol)和二硫蘇糖醇(0.308g，2. Ommol)溶 于N，N-二甲基甲酰胺lmL中，75°C反應(yīng)30min后加入化合物2(0.135g，0.4mmo 1)，繼續(xù)攪拌 20min，加入 1，8-二氮雜雙環(huán)[5 · 4 · 0]^^一碳_7_烯(0 · 75ml，5 · Ommo