一種檢測甲醛的熒光探針及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物與環(huán)境檢測技術領域，具體涉及一種作為甲醛熒光探針材料使用 的萘酰亞胺-肼衍生物及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 甲醛(HCHO)是一種重要的化工原料和有機溶劑，被廣泛的用于防腐和消毒，并常 用于樹脂、塑料、橡膠、染料等制造業(yè)。甲醛(HCHO)具有刺激性臭味，能強烈刺激呼吸道和消 化道，毒性較大。此外，長期吸入甲醛將引發(fā)鼻癌、消化道癌、肺癌、腦癌、白血病和老年癡呆 癥等疾病（參見R. G · Liteplo，R. Beauchamp，M. E .Meek, R. Chenier ,Formaldehyde (Concise International Chemical Assessment Documents),World Health Organization: GeneVa，2002)。因此，有效地檢測或監(jiān)控生物樣品或環(huán)境樣品中的甲醛一直是相關領域的 研究熱點。
[0003] 熒光檢測法由于其優(yōu)秀的檢測靈敏度和選擇性，并能實現(xiàn)對生物樣品的實時、在 線檢測而受到研究者的廣泛關注。萘酰亞胺類熒光分子因其具有良好的光穩(wěn)定性、高摩爾 消光系數(shù)和量子產率等獨特優(yōu)點而成為該方法最重要的熒光母體之一，在多種待測分子的 熒光檢測中得到了廣泛的應用。
[0004] 目前僅有2篇文獻報道了可用于甲醛檢測的小分子熒光探針，他們均是基于氮雜 Cope重排反應而設計的（參見A· Roth，H. Li，C.Anorma，and J· Chan，A Reaction-Based Fluorescent Probe for Imaging of Formaldehyde in Living Cells,J.Am.Chem.Soc., 2015,137,10890-10893以及T.F.Brewer and C.J.Chang，An Aza-Cope Reactivity-Based Fluorescent Probe for Imaging Formaldehyde in Living Cells,J.Am.Chem.Soc., 2015,137,10886-10889)。當存在甲醛的條件下，探針分子中的活性基團與甲醛發(fā)生氮雜 Cope重排反應，導致探針分子的熒光性質發(fā)生變化，從而實現(xiàn)對甲醛的特異性設別。
[0005] 然而，這兩種報道的甲醛探針存在分子結構復雜，合成步驟冗長，所用試劑昂貴， 反應速度緩慢等缺點，不利于其在復雜的生物體內或是環(huán)境中進行檢測。因此亟須一種新 穎的、具有良好生物穩(wěn)定性的、結構復雜、合成簡單的且能實現(xiàn)快速響應檢測的甲醛熒光探 針。

【發(fā)明內容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術中的上述缺陷，本發(fā)明旨在提供一種來自萘酰亞胺和肼的用于 檢測甲醛的熒光探針及其制備方法和應用。
[0007] 本發(fā)明的核心在于利用4-肼基-1，8-萘酰亞胺構筑經典的ICT體系。當存在甲醛的 條件下，肼基與甲醛發(fā)生縮合反應生成腙，進而使得原有PET效應消失而產生熒光，通過上 述方案，獲得熒光"關-開"型的熒光響應，大大提高了檢測的靈敏度。
[0008] 首先，為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種如式（I)所示的萘酰亞胺-對疊氮芐
[0009] 式（I)中，η為0~5的整數(shù)，R為甲基，或乙基，或丙基，或正丁基。
[0010] 式(I)所示化合物具體可為式(II)所示化合物(Nap-AD)。
[0012] 如圖1所示，上述探針的制備方法包括下列步驟：
[0013] (1)式(III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐與氨基化合物在醇中反應得到式(IV)所示 取代的4-溴-1，8-萘酰亞胺。
[0015] 式（IV)中，η為0~5的整數(shù)，R為甲基，或乙基，或丙基，或正丁基。
[0016] (2)在惰性氣氛下，在水合肼的存在下，式(IV)所示化合物在有機溶劑中反應即得 式(I)所示化合物。
[0017] 上述制備方法，步驟(1)中所述氨基化合物具體可為3，6，9-三氧雜-1-氨基癸烷。
[0018] 式（I II)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨基化合物的摩爾比可為1~5:1，具體 可為1.5:1。
[0019] 所述醇可為甲醇，乙醇，正丙醇，異丙醇，正丁醇，乙二醇單甲醚，具體可為乙醇。
[0020] 所述反應溫度可為50~120度，具體可為80度;反應時間可為1~20小時，具體可為 5小時。
[0021] 上述制備方法，步驟(2)中所述式(IV)所示4-溴-1，8-萘酰亞胺與水合肼的摩爾比 可為1~0.1:1，具體可為0.5:1。
[0022] 所述反應溫度可為0~100度，具體可為80度;反應時間可為1~20小時，具體可為 10小時。
[0023] 所述反應溶劑在有機溶劑中進行;有機溶劑可為乙腈、N，N_二甲基甲酰胺、二甲基 亞砜、丙酮中至少一種，具體可為乙腈。
[0024] 本發(fā)明進一步提供了一種檢測甲醛的試劑盒，包括式(I)所示化合物和溶劑。
[0025] 式（I)所示化合物的濃度為0.0 OlmM~IOOmM，具體可為ImM。
[0026] 所述溶劑為水、乙醇、二甲基亞砜中任一種。
[0027] 式（I)所示化合物或上述試劑盒可應用于水溶液中甲醛的檢測。
[0028] 所述水溶液中甲醛的含量具體可通過以下步驟進行檢測：
[0029] (1)向不同濃度甲醛的緩沖鹽中加入相同濃度的式（I)所示化合物，配置至少3種 不同甲醛含量的含有式(I)所示化合物的標準溶液。
[0030] 所示緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液、Tr i S-HCl緩沖溶液、HEPES緩沖溶液、硼酸-硼酸 鈉緩沖溶液中的任何一種，具體可以是磷酸鹽緩沖溶液；
[0031 ]所示標準溶液的pH值為5~11，具體可以是7.2;
[0032] 所示標準溶液中式（I)所示化合物的濃度為InM~ΙμΜ;
[0033] 所示標準溶液中甲醛的含量為0.1 nM~ImM;
[0034] (2)分別測定所述標準溶液的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長為450nm，以甲醛濃度為橫 坐標，以1535為縱坐標，建立標準曲線。
[0035] 1535表不所述標準溶液在波長為535nm處的焚光發(fā)射峰強度值；
[0036] (3)向待測樣品中加入式（I)所示化合物，控制其濃度與所述標準溶液中式（I)所 示化合物的濃度相等;測定其在激發(fā)波長為450nm的激發(fā)光下的熒光發(fā)射譜，即可根據(jù)標準 曲線計算得出待測樣品的甲醛含量。
[0037] 上述步驟(2)或步驟(3)中熒光強度可在熒光儀上進行檢測。
[0038]本發(fā)明具有如下特點：
[0039] 1)本發(fā)明提供的熒光探針是黃色固體，分子結構的中聚醚鏈保證了探針的水溶性 和光學穩(wěn)定性。
[0040] 2)本發(fā)明提供的熒光探針，其溶液對甲醛的濃度敏感，隨著甲醛濃度的增加，紫外 燈下可觀察到其水溶液的熒光由無變?yōu)辄S色。
[0041] 3)本發(fā)明提供的熒光探針，其發(fā)射波長為535nm，為熒光"關-開"型響應，能大大消 除檢測時檢測條件差異對結果的影響，提高檢測的靈敏度。
[0042] 4)本發(fā)明提供的熒光探針對甲醛濃度呈線性關系，可以用于甲醛的精確測量。 [0043]本發(fā)明提供的萘酰亞胺類染料的"關-開型"甲醛探針及其試劑盒對甲醛溶液具有 良好的響應，能夠實現(xiàn)對細胞內甲醛的檢測，具有操作簡便，成本低廉，響應靈敏，易于推廣 和應用等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0044]圖1為實施例1制備的熒光探針Nap-AD的合成路線。
[0045]圖2為實施例6制備的Nap-AD試劑盒對不同甲醛水溶液的熒光響應圖。
[0046]圖3為實施例6制備的Nap-AD試劑盒在波長535nm下的熒光發(fā)射強度I535與甲醛濃 度關系曲線。
[0047] 圖4為實施例6制備的Nap-AD試劑盒對常見共存離子或生物小分子的熒光響應圖。
[0048] 圖5為實施例6制備的Nap-AD試劑盒對細胞內甲醛的熒光成像圖；其中，（a)為未加 Nap-AD之前的細胞熒光成像圖；（b)為加入Nap-AD后的細胞熒光成像圖；（c)為加入Nap-AD 和甲醛后細胞熒光成像圖。
【具體實施方式】
[0049] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0050] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0051 ] 實施例1、熒光探針Nap-AD的制備
[0052] 步驟a):在惰性氣氛下，將5.OOg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入到IOOmL無水乙醇中， 再注入2.95g 3，6，9-三氧雜-1-氨基癸烷，回流反應5小時。反應完全后，放置過夜有針狀結 晶析出，過濾，冷乙醇洗滌三次，得到中間體N-3,6,9-三氧雜癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亞胺 6.10g(產率為 80%)。
[0053] 步驟b):在惰性氣氛下，將5. OOg N-3，6，9-三氧雜癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亞胺和 3.79g水合肼，加入到IOOmL丙酮中回流反應12小時。待反應完全后，旋干反應液，經柱層析 分離純化得到最后產物Nap-AD 4. IOg(產率為93% )，黃色固體。
[0054] 1H MMR(400MHz，Chloroform-d)S8 · 07(t，J = 8 · 3Hz，2H)，7 · 74(d，J = 8 · 3Hz，1H)， 7.29- 7. ll(m,2H) ,6.93(d ,J = 8.5Hz , 1H) ,4.34( t ,J = 5.4Hz , 2H), 3.93(t ,J = 5.4Hz , 2H), 3.78(t,J = 4.5Hz,2H) ,3.66(t,J = 4.5Hz,2H),3.54(t,J = 4.7Hz,2H),3.39(t,J = 4.7Hz, 2H),3.30(q ,J = 7.0Hz,2H),1.02(t ,J = 7.0Hz,3H).
[0055] 實施例2、熒光探針Nap-AD的制備
[0056] 步驟a):在惰性氣氛下，將5. OOg 4-溴-1,8-萘二甲酸酐加入至IjIOOmL無水甲醇中， 再注入1.96g 3,6,9_三氧雜-1-氨基癸燒，回流反應10小時。反應完全后，放置過夜有針狀 結晶析出，過濾，冷乙醇洗滌三次，得到中間體N-3，6，9-三氧雜癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亞胺 4.90g(產率為 96%)。
[0057] 步驟b):在惰性氣氛下，將5. OOg N-3，6，9-三氧雜癸烷基-4-溴-1，8-萘酰亞胺和 1.52g水合肼，加入到IOOmL乙腈中回流反應20小時。待反應完全后，旋干反應液，經柱層析 分離純化得到最后產物Nap-AD 4. IOg(產率為93% )，黃色固體。
[0058] 1H MMR(400MHz，Chloroform-d)S8 · 07(t，J = 8 · 3Hz，2H)，7 · 74(d，J = 8 · 3Hz，1H)， 7.29- 7. ll(m,2H) ,6.93(d ,J = 8.5Hz , 1H) ,4.34(