專(zhuān)利名稱(chēng)：人胰島素前體基因在大腸桿菌中的直接表達(dá)及后加工方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程領(lǐng)域，是用大腸桿菌體系進(jìn)行的基因表達(dá)，產(chǎn)物加工，得到人胰島素的方法。
現(xiàn)有技術(shù)胰島素是治療胰島素依賴型糖尿病的特效藥，患者必須長(zhǎng)期持續(xù)使用，臨床應(yīng)用已有70年的歷史了。在生物技術(shù)出現(xiàn)前，用的都是動(dòng)物胰島素，由于動(dòng)物胰島素與人胰島素雖在生物活性上無(wú)多大差別，但在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有一定的差異，因而有不少患者會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，且提取胰島素的工藝復(fù)雜，胰臟的來(lái)源也有限。人胰島素不可能從人的胰臟大量提供，化學(xué)方法合成存在費(fèi)用高的問(wèn)題。
80年代初，人們發(fā)明了將豬胰島素用胰酶轉(zhuǎn)變?yōu)槿艘葝u素的方法，彌補(bǔ)了人胰島素的來(lái)源的缺陷。由于豬胰島素與人胰島素只有B30上的這個(gè)氨基酸不同，人胰島素是Thr而豬胰島素是Ala，將豬胰島素B30Ala換成Thr即得人胰島素。此法有兩個(gè)途徑，其一是用羧肽酶A，先專(zhuān)一性地將B30Ala切下，得到去B30Ala的胰島素，再用胰酶在水、有機(jī)溶劑中將Thr酯接在B29Lys后面，分離后脫酯即得人胰島素[Moribara&Tsuzuki，(1979)Nature，280，412-413];其二是用胰酶直接完成在B29Lys后的切割及連接的兩個(gè)過(guò)程，較前一途徑更為優(yōu)越[Jonczyk&Gattner，(1981)HoppeSeyler'ZPhysiol，Chem.，362，1591-1598;Markussen，(1982)USpatent4，343，898;Roseetal.，(1983)Biochem，J.，211，671-676.]。由于豬胰島素的來(lái)源有限，酶促半合成人胰島素并不是樂(lè)觀的事。
隨著生物技術(shù)的興起，人們已可以用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)藥物。1982年，用基因工程方法生產(chǎn)的人胰島素作為生物技術(shù)的第一個(gè)商品進(jìn)入了市場(chǎng)。從國(guó)際市場(chǎng)的發(fā)展趨勢(shì)看，基因工程人胰島素已逐步取代用提取法制備的動(dòng)物胰島素。
國(guó)際上基因工程人胰島素的生產(chǎn)采用了兩套系統(tǒng)，其一是用大腸桿菌系統(tǒng)[Goeddeletal.，(1982)EPpatent0055945]，其二是酵母系統(tǒng)[Thimetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.83，6766-6770;Thimetal.，(1986)EPpatent195691]。酵母系統(tǒng)采用了分泌人胰島素原類(lèi)似物的方式，分泌出來(lái)的人胰島素前體已具有了天然的二硫鍵及正確的N-端，這種類(lèi)似物可以通過(guò)胰蛋白酶轉(zhuǎn)肽的方法(同將豬胰島素轉(zhuǎn)為人胰島素)將其轉(zhuǎn)化為人胰島素。這一系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于分泌物具有天然的二硫鍵，缺點(diǎn)是酵母菌生長(zhǎng)慢，導(dǎo)致生產(chǎn)周期長(zhǎng)，且分泌量太少(1-10毫克/升)。大腸桿菌系統(tǒng)不利于表達(dá)小蛋白，產(chǎn)物容易降解，所以采用了融合蛋白形式，將胰島素A鏈，B鏈或胰島素前體接在一個(gè)大的蛋白后面，表達(dá)出來(lái)后通過(guò)溴化氰在N-端Met處裂解，即可釋放出所需蛋白，并將其S-磺酸化，形成穩(wěn)定的單分子衍生物。分別分離得到的S-磺酸型A鏈及B鏈需進(jìn)行二硫鍵重組，才能得到人胰島素，S-磺酸型人胰島素前體需進(jìn)行二硫鍵重組及胰酶和羧肽酶B聯(lián)合作用[Kemmler，etal.，(1971)J.Biol.Chem.，246，6786.，不能將豬胰島素轉(zhuǎn)為人胰島素，]才能得到人胰島素。這一系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于表達(dá)量高(克級(jí)/升)，發(fā)酵周期短，缺點(diǎn)在于后加工復(fù)雜，需進(jìn)行溴化氰裂解及過(guò)多根層析柱，最終產(chǎn)率也較低(約幾十毫克/升)。以上兩套系統(tǒng)分別為國(guó)際上兩個(gè)人胰島素生產(chǎn)公司(美國(guó)的Lilly公司及丹麥的Novo公司)擁有，年產(chǎn)量相當(dāng)。下面是在大腸桿菌中以人胰島素原融合蛋白形式生產(chǎn)人胰島素的過(guò)程164克濕細(xì)胞在5體積的裂解緩沖液中破細(xì)胞;離心沉淀包含體;變性劑中溶解包含體，水稀釋沉淀得融合蛋白;融合蛋白在甲酸中溴化氰裂解，減壓蒸去溶劑;裂解物在變性劑中進(jìn)行S-磺酸解;S-磺酸解粗產(chǎn)物上SephadexG25脫鹽，DEAE-SephadexA25分離，活性組分超濾濃縮后上SephadexG50分離，以上三根柱中流動(dòng)相均含尿素，最后SephadexG25脫鹽;純化的S-磺酸型人胰島素原(209毫克)進(jìn)行二硫鍵重組;DEAE-SephadexA25，SephadexG50分離人胰島素原，或用HPLC分離;胰酶和羧肽酶B聯(lián)合作用得人胰島素。
1992年Lilly公司實(shí)研室在J.Biol.Chem.(267，419-425)上發(fā)表了倒置胰島素原(A-C-B，正常為B-C-A)在大腸桿菌系統(tǒng)的非融合形式表達(dá)，有一定的意義。它的目的是為了得到高活性的人胰島素原類(lèi)似物，同時(shí)也希望能用于生產(chǎn)人胰島素。它的提取過(guò)程如下43.5克濕細(xì)胞破細(xì)胞后離心得包含體變性劑中溶解包含體S-磺酸解，透析，調(diào)pH3.6沉淀S-磺酸解粗產(chǎn)物;FPLC陰離子交換分離，流動(dòng)相含尿素，得147毫克S-磺酸型倒置胰島素原;二硫鍵重組，RP-HPLC分離，得37毫克倒置胰島素原;胰酶和羧肽酶B聯(lián)合作用得人胰島素。
在上面的體系中，倒置胰島素原得到了10%的表達(dá)，后加工也有所簡(jiǎn)化，但仍存在不少缺點(diǎn)(1)表達(dá)率并不太高;
(2)仍采用S-磺酸解的轉(zhuǎn)換;
(3)用了昂貴的儀器，流動(dòng)相中含尿素;
(4)存在X-端不均一性(Met°-A-C-B占80%，A-C-B占20%);
(5)倒置胰島素轉(zhuǎn)成人胰島素比胰島素原轉(zhuǎn)成人胰島素難，副反應(yīng)強(qiáng)烈。
發(fā)明的目的由于用大腸桿菌系統(tǒng)以融合蛋白形式生產(chǎn)人胰島素的過(guò)程非常繁瑣，倒置胰島素原的途徑也不太可取，本發(fā)明的目的在于選用一種非融合形式高表達(dá)人胰島素原類(lèi)似物，避開(kāi)融合蛋白的溴化氰裂解，也避開(kāi)前人用的S-磺酸解過(guò)程，盡可能采用簡(jiǎn)單的設(shè)備，并通過(guò)分離純化條件的改變，極大地降低生產(chǎn)成本。
發(fā)明的內(nèi)容及方案將編碼人胰島素前體的基因直接克隆到表達(dá)質(zhì)粒啟動(dòng)子的下游進(jìn)行表達(dá)的工作前人一直沒(méi)有成功，我們認(rèn)為關(guān)鍵是表達(dá)效率太低，誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(10小時(shí))，生成產(chǎn)物幾乎完全降解。我們通過(guò)高表達(dá)質(zhì)粒的選用，用極短的時(shí)間(1小時(shí))就可完成，實(shí)現(xiàn)了高的表達(dá)率。在后加工中，避開(kāi)前人用的S-磺酸解過(guò)程，采用簡(jiǎn)單的條件，簡(jiǎn)單的設(shè)備，只經(jīng)過(guò)一根分子篩柱就可得到純度大于90%的人胰島素前體，極大地降低了生產(chǎn)成本。詳見(jiàn)實(shí)施例。
優(yōu)點(diǎn)及效果與報(bào)道的融合人胰島素前體及非融合A-C-B人胰島素原生產(chǎn)人胰島素比較，本發(fā)明專(zhuān)利有如下優(yōu)點(diǎn)(1)表達(dá)率較高，為20-30%，利于后面的純化，且產(chǎn)率較高;
(2)可避開(kāi)溴化氰的使用，減小后面純化的難度，也減少了環(huán)境污染;
(3)避開(kāi)了S-磺酸解的轉(zhuǎn)換，降低了成本;
(4)選用了簡(jiǎn)單的操作程序及儀器，利于生產(chǎn);
(5)流動(dòng)相中不含變性劑，降低了成本。
實(shí)施例(一)直接表達(dá)人胰島素原編碼人胰島素原的基因的表達(dá)率為20-30%，比Lilly實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的A-C-B人胰島素原的表達(dá)率(10%)高。后加工過(guò)程如下80克濕細(xì)胞于4-10倍體積的緩沖液中(0.05MTris-HCl，5%Triton，8%sucrose，0.05MEDTA，pH8.0)超聲或高壓勻漿細(xì)胞，5000-10000g離心;15克沉淀(主要為包含體)用0.1MTris-HCl，pH8.0，含8M尿素的溶液溶解，在5000-10000g離心;上清加80mgDTT，30-37℃還原兩小時(shí)，用水稀釋四倍得沉淀;沉淀溶解后稀釋至2升0.05MGly-NaOH，pH10.8緩沖液中，4-10℃重組24小時(shí)得人胰島素原的粗液;超濾濃縮后上SephadexG50，用同樣緩沖液洗脫，活性峰超濾后調(diào)pH5～6得沉淀，抽干后得80-150毫克人胰島素原干粉(純度＞90%);胰酶轉(zhuǎn)肽得15-30毫克人胰島素。
產(chǎn)物經(jīng)氨基酸組成分析知B1前含一個(gè)Met，是細(xì)胞翻譯后加工不完全所致，通過(guò)溴化氰裂解，可得正常X-端的人胰島素。
(二)直接表達(dá)小C肽人胰島素原為了增強(qiáng)胰島素二硫健的正確配對(duì)率，可選用小C肽人胰島素原，小C肽由6個(gè)、2個(gè)氨基酸組成的小C肽人胰島素原，甚至A1與B29直接相連，無(wú)C肽的人胰島素前體，都得到了5-10%的表達(dá)。產(chǎn)物后加工同(一)。
(三)直接表達(dá)大C肽人胰島素原由于在大腸桿菌系統(tǒng)中對(duì)于氨基酸殘基數(shù)在120-250范圍的蛋白表達(dá)，一般表達(dá)率都較高，說(shuō)明其可較穩(wěn)定存在于細(xì)胞中，我們通過(guò)基因操作，將C肽加大，以提高直接表達(dá)率，基于A、B鏈間存在足夠的結(jié)構(gòu)信息，C肽大小對(duì)二硫鍵的配對(duì)僅有一點(diǎn)影響，我們選擇了大的C肽，使其內(nèi)部不含半胱氨酸，以防止影響二硫鍵的正確配對(duì)，可得到滿意的結(jié)果。我們將C肽加大了約一倍，將其直接表達(dá)，得到了20-30%的表達(dá)率。產(chǎn)物后加工除用SephadexG75代替SephadexG50外，其他同(一)。
(四)直接表達(dá)Lys-人胰島素原基因由于(一)中表達(dá)產(chǎn)物呈Met-人胰島素原的形式，我們通過(guò)基因突變，得到Lys-人胰島素原基因，使其直接表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)率、后加工成Met-Lys-人胰島素原的過(guò)程及產(chǎn)率與(一)相當(dāng)。
Met-Lys-人胰島素原可通過(guò)胰酶轉(zhuǎn)肽很容易得到N-端正確的人胰島素。
權(quán)利要求
1.一種以大腸桿菌為表達(dá)體系直接表達(dá)人胰島素前體，并進(jìn)行簡(jiǎn)單的后加工，拿到人胰島素前體，以至人胰島素的方法并適用于多肽物質(zhì)的生產(chǎn)其特征在于所述方法包括(1)將編碼人胰島素前體的基因重組到表達(dá)質(zhì)粒啟動(dòng)子的下游，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；(2)表達(dá)產(chǎn)物以包含體形式生成，通過(guò)包含體的溶解、還原及重組，可通過(guò)分子篩柱一步得到純度大于90%的前體分子；(3)前體分子可直接用胰酶在水-有機(jī)液中進(jìn)行轉(zhuǎn)肽，得到人胰島素；
2.根據(jù)權(quán)利要求1.(1)中所述的人胰島素前體基因，其特征在于它包括(1)編碼人胰島素原的基因;(2)編碼小C肽人胰島素前體的基因;(3)編碼大C肽人胰島素前體的基因;(4)編碼在B1Phe前插入C-端為L(zhǎng)ys或Arg的小多肽的前體基因;
3.根據(jù)權(quán)利要求1.(2)中所述其特征在于，重組產(chǎn)物所過(guò)分子篩柱的流動(dòng)相pH為9-12，轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物用DEAE離子交換分離時(shí)，流動(dòng)相為20-50%的異丙醇-水溶液;
4.根據(jù)權(quán)利要求1.(3)中所述其特征在于，轉(zhuǎn)肽反應(yīng)底物Thr酯為L(zhǎng)-ThrOBut及L-Thr(But)OBut的混合物;
5.根據(jù)權(quán)利要求1.中(2)、(3)所述其特征在于，重組人胰島素前體，人胰島素酯，人胰島素均通過(guò)超濾濃縮，調(diào)pH4-6沉淀、離心、干燥得干粉;
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于此方法同樣適應(yīng)其他多肽物質(zhì)的生產(chǎn);
7.根據(jù)權(quán)利要求1和2中所述其特征在于，多肽物質(zhì)分子在50-120個(gè)氨基酸范圍。
全文摘要
本發(fā)明是一種人胰島素的基因工程生產(chǎn)方法。本法采用了大腸桿菌表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)了編碼人胰島素前體基因的直接表達(dá)，排除了傳統(tǒng)采用的融合方式表達(dá)，給后加工帶來(lái)了極大的方便。本法的表達(dá)率在20—30％，經(jīng)細(xì)胞破碎分離包含體，包含體溶解，二硫鍵還原及重組，只經(jīng)一根分子篩柱就可得純度大于90％的人胰島素前體。此產(chǎn)物可直接用胰酶轉(zhuǎn)肽轉(zhuǎn)為人胰島素，產(chǎn)品的化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性，與人胰島素相同。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1075983SQ9310399
公開(kāi)日1993年9月8日 申請(qǐng)日期1993年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月10日
發(fā)明者唐建國(guó), 胡美浩 申請(qǐng)人:北京大學(xué)