專利名稱：：一種濃集污水或污水處理廠尾水中病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種濃集污水或污水處理廠尾水中病毒的方法。技術(shù)背景通過水傳播的病原微生物是危害人類健康和生態(tài)安全的重大隱患，全世界約有1/4的疾病是由水中病原微生物直接或間接引起的(Gerba,C.P.，Pathogensintheenvironment.In:P印per，I丄，Gerba，C.P.，Brusseau,M丄(Eds.)，PollutionScience.AcademicPress,NewYork,1996.p.279-299)。水環(huán)境中的病原微生物主要分為致病細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物三類，其中病毒在水環(huán)境中含量低，但是致病性強(qiáng)且種類繁多。水環(huán)境中的病毒主要來自人和動(dòng)物的排泄物，這些病毒進(jìn)入水環(huán)境中后，在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間里仍保持較高的傳染性和致病性，常規(guī)的水處理和消毒工藝不能完全將其去除和滅活(Hambidge,A.，Reviewingefficacyofalternativewatertreatmenttechniques.HealthEstate2001.55(6)，23-25)，己有眾多研究者在污水(Baggi,F.,Peduzzi,R.，2000.GenotypingofrotavirusesinenvironmentalwaterandstoolsamplesinSouthernSwitzerlandbynucleotidesequenceanalysisof189basepairsatthe5—endoftheVP7gene.J".Clin.Microbiol.38，3681-3685)、地表水(EijiHaramoto,HiroyukiKatayama，KumikoOguma，andShinichiroOhgakiApplicationofCation—CoatedFilterMethodtoDetectionofNoroviruses，Enteroviruses,Adenoviruses,andTorqueTenoVirusesintheTamagawaRiverinJapan.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,May2005，p.2403-2411)、地下水以及飲用水(Gratacap-Cavallier,B.，Genoulaz，0.，Brengel-Pesce,K.,Soule，H.，Innocenti-Francillard,P.,Bost，M.，Gofti，L.，Zmirou，D.,Seigneurin，J.M.，2000.Detectionofhumanandanimalrotavirussequencesindrinkingwater.Appl.Environ.Microbiol.66，2690-2692)中檢測(cè)出輪狀病毒、諾瓦克病毒、甲型肝炎病毒、腸道病毒、腺病毒等。Sobey等人的報(bào)告中指出，城市生活污水造成的地下水污染已經(jīng)使污水中的病原微生物成為公眾健康的威脅。在1989-1990年間，美國(guó)爆發(fā)的26起通過飲用水傳播的流行疾病就有13起由此而引起(J.E.Scandura，M.D.Sobey.Viralandbacterialcontaminationofgroundwaterfromon—sitesewagetreatmentsystems.WaterScienceandTechnology,1997，35(11-12):141-146.)。也有研究也表明，經(jīng)用于灌溉或直接排入地表水系統(tǒng)的再生水也存在病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)(Ganoulis,AnastasiaPapalopoulou.Riskanalysisofwastewaterreclamationandreuse.Wat.Sci.Tech.1996(33)，297-302.)。因此，快速及時(shí)地檢測(cè)水環(huán)境中病毒污染狀況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)水處理工藝中的失誤，分析病毒傳播途徑，并制定高效的預(yù)防控制手段，這對(duì)于降低輪狀病毒感染風(fēng)險(xiǎn)、預(yù)防控制輪狀病毒疾病爆發(fā)流行、保障水質(zhì)安全具有十分重要的意義。病毒檢測(cè)系統(tǒng)由濃集水樣和檢測(cè)濃縮后水樣中的病毒兩個(gè)部分組成。由于水中病毒的濃度非常低，不能直接檢出，而且環(huán)境中存在大量干擾細(xì)胞感染及分子生物學(xué)檢測(cè)的雜質(zhì)，因此病毒檢測(cè)的主要難點(diǎn)之一就是從大體積水樣中高效地濃集出目標(biāo)病毒并去除濃縮病毒的同時(shí)也被濃縮的干擾物質(zhì)。目前，研究較多、應(yīng)用較廣泛的病毒濃集方法有以下幾種1.吸附-洗脫法吸附-洗脫法是讓病毒吸附在濾材表面，然后用洗脫液將病毒從濾材上洗脫下來。常用的濾材有帶負(fù)電和帶正電的兩種，常用的吸附介質(zhì)一般是濾膜或固體顆粒。常用的洗脫液根據(jù)作用方式不同有兩類一類是改變吸附特性的物質(zhì)，如甘氨酸、三氯乙酸及EDTA等；另一類是和病毒競(jìng)爭(zhēng)吸附位點(diǎn)的蛋白類物質(zhì)，如牛肉提取液(BeefExtract)等。2.絮凝沉淀法絮凝沉淀法，即向水中加入化學(xué)物質(zhì)，形成絮凝沉淀，病毒通過與沉淀結(jié)合而濃縮。常用的無機(jī)絮凝劑有氫氧化鋁、氯化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣；有機(jī)絮凝劑有聚乙二醇和魚精蛋白的硫酸鹽等。絮凝法濃集大體積水樣中的病毒效率不高，一般用于小體積的水樣濃縮，如吸附法的洗脫液中病毒的再濃縮。3.免疫捕獲法免疫捕獲法是基于抗體和抗原特異性結(jié)合的原理。將高特異性的純化抗體交聯(lián)于層析材料上，裝填成柱，或具有超順磁性的氧化鐵粒子連接上抗體，抗體與樣品液中對(duì)應(yīng)的致病微生物發(fā)生特異性結(jié)合，在外加磁場(chǎng)的作用下，載有致病微生物的免疫磁性粒子向磁極方向聚集，收集磁粒子，最后用洗脫液洗脫層析材料或磁粒即可得至'J濃集后的病毒(CasasN，SunenE..Detectionofenteroviruses,hepatitisAvirusandrotavirusesinsewagebymeansofanimmunomagneticcapturereversetranscriptionPCRassay[J].MicrobiolRes,2002，157(3):169—175.)。這種結(jié)合過程是特異的，能有效去除各種干擾物質(zhì)，靈敏度極高，操作相對(duì)簡(jiǎn)單。而且具有良好的兼容性，可以很容易與各種檢測(cè)方法相結(jié)合。有研究者把免疫磁珠分離技術(shù)(iramunoraagneticbead-basedseparation，IMS)與PCR技術(shù)結(jié)合在一起，發(fā)展了ims-pcr技術(shù)，提高了pcr檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確性。吸附免疫捕獲技術(shù)的難點(diǎn)是制備高性能的固相載體和病原微生物的特異性抗體，如制備均一球形超順磁性且易于結(jié)合蛋白的磁珠，在國(guó)外多為專利產(chǎn)品且價(jià)格昂貴，國(guó)內(nèi)對(duì)免疫磁珠技術(shù)的研究剛剛起步。4.電阻攔法當(dāng)含微生物的液體流經(jīng)垂直電場(chǎng)內(nèi)的填充層時(shí)，被極化的填充料阻攔了微生物以及其它可形成溶液的物質(zhì)(如核酸、蛋白質(zhì)、甚至分子量比較低的有機(jī)物)。填充料對(duì)很小的顆粒來說不是真正的過濾層，即使最好的微生物吸附劑，它的吸附容量不大，只因?yàn)榉诺搅穗妶?chǎng)中，才轉(zhuǎn)變成高效率的過濾器，吸附容量增大幾十個(gè)數(shù)量級(jí)。填充料上阻留的微生物等在切斷電場(chǎng)后，很容易用水流沖洗下來(丁昌慧，邵榮標(biāo).水中脊髓灰質(zhì)炎病毒濃集方法研究的新進(jìn)展.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2000,10(4):509-510.)。水中理想的濃集方法應(yīng)該具備(1)效果穩(wěn)定，回收率高，能檢測(cè)大體積水樣中微量的病毒；(2)操作簡(jiǎn)單，成本較低，能用于常規(guī)水質(zhì)監(jiān)測(cè)。盡管目前可用的濃集方法有很多種，且各有所長(zhǎng)，但實(shí)際水體中復(fù)雜的水質(zhì)條件，使病毒濃集效果受到影響，為了能更好地應(yīng)用于水質(zhì)安全管理，仍然需要進(jìn)一步探索。相較飲用水而言，城市生活污水和污水廠尾水水質(zhì)條件復(fù)雜，有機(jī)物含量高，利用濾膜法容易堵塞。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種濃集污水或污水處理廠尾水中病毒的方法。本發(fā)明所提供的濃集污水或污水處理廠尾水中病毒的方法，包括以下步驟1)調(diào)節(jié)水樣條件取污水或污水處理廠尾水水樣，加入ai3、使Ar+終濃度為0.5-1mmol/L，將pH值調(diào)節(jié)至3.0-3.5;2)吸附在步驟l)的水樣中，加入硅膠顆粒，攪拌吸附；3)洗脫收集步驟2)吸附后的硅膠，用pH3.0-3.5的H2S04溶液沖洗后，放入pH值為9.0-9.5的尿素-賴氨酸緩沖液中振蕩渦漩，離心收集上清液得到洗脫液；4)洗脫液濃縮將步驟3)得到的洗脫液超濾濃縮。所述方法中，所述步驟l)中，Al3+終濃度優(yōu)選為lmol/L，所述Ar+優(yōu)選為是通過AICI.,加入的。所述方法中，所述步驟l)中，將pH值調(diào)節(jié)至3.0-3.5。所述方法中，所述步驟2)中，所述硅膠顆粒的粒徑為200目，所述硅膠顆粒的添加量可為l一4g/L污水或污水處理廠尾水，優(yōu)選為1g/L污水或污水處理廠尾水。所述方法中，所述步驟2)中，所述攪拌吸附的時(shí)間為10-20分鐘。所述方法中，所述步驟3)中，收集步驟2)吸附后的硅膠是用濾紙過濾收集，所述濾紙優(yōu)選為定性濾紙；所述尿素-賴氨酸緩沖液為的pH值優(yōu)選為9.0;所述沖洗用H2S04溶液pH值優(yōu)選為3.0，所述H2S04溶液的用量為10—20ml/g硅膠顆粒。所述方法中，所述步驟3)中，尿素-賴氨酸緩沖液的用量為20—30ml/g硅膠顆粒；所述振蕩渦漩的時(shí)間為20-30分鐘。所述方法中，所述步驟4)中還包括在洗脫液超濾前先每50ml尿素-賴氨酸緩沖液加入lml50XTE緩沖液，并調(diào)水樣pH為7.0。所述方法中，所述步驟4)中，所述超濾后每1L污水或污水處理廠尾水水樣濃縮至0.l—l.5ml。上述污水處理廠尾水，包括污水處理后的各種出水(如二級(jí)處理出水、三級(jí)處理出水(一般也稱為再生水)等)也可為其他污水如地表水、景觀娛樂用水等。本發(fā)明的方法針對(duì)濁度較高、雜質(zhì)較多的生活污水和污水處理廠尾水，通過向水環(huán)境樣品中投加多價(jià)陽離子和固體顆粒荷電材料吸附水中病毒，收集固體顆粒后利用尿素-賴氨酸溶液洗脫其吸附的病毒，建立了固體顆粒(硅膠)吸附一尿素-賴氨酸溶液洗脫的濃集方法，可在1-2小時(shí)內(nèi)得到濃集病毒的水樣，即省時(shí)間又減少了長(zhǎng)時(shí)間操作造成的病毒死亡，生活污水回收率平均為21%，污水廠尾水回收率平均為27%，與目前同類的研究相比具有較好的回收效率。該方法不僅可以處理大體積高濁度水環(huán)境樣品，還避免使用牛肉提取液(含有較多干擾分子生物學(xué)操作的雜質(zhì))洗脫吸附病毒，利用該方法濃集后的樣品，不僅可以直接利用傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)法檢測(cè)，還可以直接利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)。本發(fā)明的方法具有回收率相對(duì)較高、處理水量大、效果穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單、成本低廉、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，在污水及污水處理尾水、再生水、景觀娛樂用水等水環(huán)境病毒檢測(cè)中有廣闊的應(yīng)用前景。圖1為濃集病毒用過濾器結(jié)構(gòu)示意圖圖2為Ar離子濃度對(duì)病毒回收率的影響曲線3為不同濾料對(duì)輪狀病毒的吸附效率比較圖4為Q污水處理廠3月水樣濃縮后RT-PCR直接測(cè)定結(jié)果圖5為污水處理廠4月水樣濃縮后RT-PCR直接測(cè)定結(jié)果圖6為污水處理廠5月水樣濃縮后RT-PCR直接測(cè)定結(jié)果圖7為高碑店污水處理廠5月水樣濃縮后RT-PCR直接測(cè)定結(jié)果圖8為小紅門污水處理廠5月水樣和實(shí)驗(yàn)室生活污水濃縮后RT-PCR直接測(cè)定結(jié)果圖9為昆運(yùn)河頤和園處和昆運(yùn)河紫竹院處5月水樣濃縮后RT-PCR直接測(cè)定結(jié)果圖10為Q污水處理廠3月水樣濃縮后感染的細(xì)胞RT-PCR測(cè)定結(jié)果圖11為Q污水處理廠3月水樣濃縮后利用RT-PCR測(cè)定結(jié)果圖12為利用本發(fā)明的方法濃集水樣病毒及病毒檢測(cè)流程圖具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中的方法中，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例l、污水或污水處理尾水中病毒濃集方法的建立本發(fā)明利用固體顆粒吸附-洗脫法，建立適用于大體積的、水質(zhì)條件復(fù)雜的生活污水和污水廠尾水中病毒的濃集方法。利用固體顆粒吸附洗脫法進(jìn)行污水病毒濃集，基本包括預(yù)過濾、固體顆粒吸附、洗脫、濃縮等步驟。本實(shí)施例以生活污水和二級(jí)出水為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行污水或污水處理尾水中病毒濃集方法的各個(gè)條件的優(yōu)化。測(cè)定生活污水和二級(jí)出水(生活污水二級(jí)處理后出水)的濁度和C0D值，測(cè)得本研究所用污水濁度為10-50NTU，COD為200-250mg/L;二級(jí)出水濁度為0.5-3NTU,COD為50-60mg/L。由于在采用的生活污水和二級(jí)出水中沒有檢測(cè)出輪狀病毒，因此分別取1L生活污水和二級(jí)出水作實(shí)驗(yàn)水樣，分別投入100u1純培養(yǎng)輪狀病毒(其中病毒的準(zhǔn)確含量用real-timeRT-PCR確定)作為樣品進(jìn)行病毒濃集，濃集后的樣品進(jìn)行檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，病毒回收率=(檢測(cè)出輪狀病毒的拷貝數(shù)/投加到水樣中輪狀病毒的拷貝數(shù))X100%。一、檢測(cè)濃集后水樣中輪狀病毒拷貝數(shù)的方法下述實(shí)施例中，如無特別說明，檢測(cè)濃集后水樣中輪狀病毒拷貝數(shù)的方法為下述real-timeRT-PCR法，主要包括RNA提取和real-timeRT-PCR定量檢測(cè)兩個(gè)步驟1.水樣RNA提取取濃集至lml的水樣，按QIAa即"UltraSensVirusKit(Catalogno.53706,QIAGEN)的說明書提取RNA。具體步驟為(1)將lml樣品平衡到室溫(15-25°C)后轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中。(2)在樣品上面加入0.8mlbufferAC，小心加入，避免濺到蓋子上，吸5.6ul載體RNA加入到離心管蓋子上。(3)蓋緊蓋子，顛倒離心管3次，然后漩渦10s。(4)在室溫(15—25。C)下孵育10min。(5)1200Xg離心3min。(6)完全去除上清液。(7)加入300Hi已經(jīng)孵育到60。CbufferAR和20ul蛋白酶K。(8)充分旋渦直到沉淀完全溶解。(9)將混合物放在己預(yù)熱到40。C的heatingblock上搖動(dòng)10rain，設(shè)置為最大轉(zhuǎn)速。(10)用掌上離心機(jī)簡(jiǎn)單地離心，讓黏附在蓋子上的液體下來。(11)加入300ulBufferAB，漩渦以充分混勻，然后簡(jiǎn)單地離心，讓黏附在蓋子上的液體下來。(12)小心地將700ul裂解產(chǎn)物加入到QIAampspincolumn(放在2ml的收集管上)中，不要粘到邊緣。蓋上蓋子，離心，250Xg，lmin。(13)把QIAampspincolumn放在一個(gè)新的2ml收集管上，丟棄盛有濾出液的收集管。小心打開QIAampspincolumn蓋子，加入500y1BufferAWl。6000Xg，離心lmin。(14)把QIAampspincol咖n放在一個(gè)新的2ml收集管上，丟棄盛有濾出液的收集管。小心打開QIAampspincolumn蓋子，加入500y1BufferAW2。20，000Xg，14000rpm，離心3min。(15)把QIAarapspincolumn放在一個(gè)1.5ml離心管上，丟棄盛有濾出液的收集管。小心打開QIAampspincol咖n蓋子，為洗提核酸，加入30ulBufferAVE到QIAampspincolumn中，4°C6000Xg(8000rpm)離心lmin。(16)重復(fù)洗提過程，加入30y1BufferAVE,6000xg(8000rpm)離心lmin。分別取lul做瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA質(zhì)量，并以微量核酸定量?jī)x測(cè)定RNA濃度。立即做逆轉(zhuǎn)錄或者保存于一8(TC。2.輪狀病毒real-timeRT-PCR檢測(cè)方法(1)逆轉(zhuǎn)錄按照ExScript"1RTreagentKit(Code:DRR035A，大連寶生物有限公司)說明書提供的參考進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系(10yl)如表1所示表l.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>反應(yīng)條件為42°C，15min;95°C，2min。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA立即做real-timePCR或保存于一20。C。(2)輪狀病毒特異性引物及標(biāo)準(zhǔn)品本研究所用的引物(在輪狀病毒的VP7基因上設(shè)計(jì))序列如表2所示表2.熒光定量PCR所用引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>擴(kuò)增片段為318bp，引物由三博基因公司合成。所用的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備方法為A.取lml輪狀病毒(滴度為1045TCID5。/ml)，按QIAampKUltraSensVirusKit(Catalogno.53706，QIAGEN)的說明書提取RNA，具體步驟如前所述，獲得30ul纖。B.按照ExScriptTMRTreagentKit(Code:DRR035A，大連寶生物有限公司)說明書提供的參考進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系(10pl)，具體如前所述。C.取逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)引物為上游引物CCTCACTTATACACTTTGCC,下游引物為TTCGCTTCGTCAGTTTGCT;反應(yīng)體系為總共50ul，包括cDNA5uL(0.5ug)，dNTPmix1yL，20uM上游引物1uL，20uM下游游引物liiL，10XPCRbuffer5utL，25慮Mg2+4uL，Taq酶0.5iiL，ddH2032.5";反應(yīng)程序?yàn)橄?5。C，預(yù)變性5min;然后94°C變性lmin，59。C退火45s，72°C延伸lmin，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10min。做2管PCR反應(yīng)，獲得100uLPCR反應(yīng)產(chǎn)物。D.取90uLPCR產(chǎn)物行2X瓊脂糖回收膠，利用膠回收試劑盒(Cat.:DV805A，大連寶生物有限公司)進(jìn)行目的片段的回收純化。回收純化后取2wL進(jìn)行2X瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明回收純化的效果較好，PCR產(chǎn)物為318bp的片段，可用于T-A和其他雙酶切克隆。E.將回收純化的目的片段和pGEM-T-easy載體連接(pGEM-T-easy載體連接試劑盒購自Invitrogen公司)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，挑取克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI酶切鑒定，含有酶切得到318bp的片段的質(zhì)粒的克隆即為陽性克隆，將酶切證明為陽性克隆的菌液送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果blast比對(duì)結(jié)果證明為陽性重組體，且該重組體和GenBank中下載猴輪狀病毒株SA-11的所有VP7的序列具有99%以上的同源性，即得到構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。F.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的大量提取和純化，重取純化的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品lul到200ul的TE緩沖液中，利用紫外分光光度測(cè)量260nm處的OD值，確定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的純度較好。利用DNA質(zhì)量濃度二A260X核酸稀釋倍數(shù)X50/1000的公式計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為3.22ug/ul。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為DNA的拷貝數(shù)=(DNA的質(zhì)量/DNA的摩爾質(zhì)量)X6.02X1023其中l(wèi)bp二649Da計(jì)算獲得為9X107yL。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋，使其每ul拷貝數(shù)分別為9X109、9X108、9X107、9X106、9X105、9X104、9X103、9X102、9X101、9X10°、9X10—'。分別取1U1做real-timePCR，測(cè)定結(jié)果，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)。(3)輪狀病毒real-timePCR依照SYBRRPremixExTaq(Code:DRR041S，大連寶生物有限公司)說明書，熒光定量PCR的反應(yīng)體系(25ul)如表3所示表3.熒光定量PCR的反應(yīng)體系試劑加樣量(yL)cDNA12XSYBRRPremixExTaq12.5<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>反應(yīng)程序如表4所示:表4.熒光定量PCR的反應(yīng);<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在延伸步驟采集熒光信號(hào)，根據(jù)步驟(2)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病毒拷貝數(shù)。以RNaseH20作為陰性對(duì)照。二、污水或污水處理尾水中病毒濃集方法的條件優(yōu)化1、預(yù)過濾的病毒損失分析對(duì)于生活污水，因其懸浮顆粒多，濁度高，用普通定性濾紙先預(yù)過濾。將1L生活污水濾紙截下的沉淀用酸堿洗脫法洗脫，具體方法為用pH為3.0的H2S04溶液(約5ml)洗去過濾得到的固體顆粒表面的陽離子，然后放入30-50mlpH為10.5的NaOH中渦旋30min。洗脫液和固體顆粒的混合物用離心分離，取上清液離心超濾至lml，按照步驟一的方法提取RNA利用real-timeRT-PCR方法檢測(cè)到回收效率〈1%的病毒，考慮到酸堿洗脫法的洗脫效率低，實(shí)際濃集過程中因預(yù)過濾而損失的病毒應(yīng)在14%左右。2、添加陽離子及其濃度的優(yōu)化將(按照步驟l的方法預(yù)過濾處理后)生活污水和二級(jí)出水(生活污水二級(jí)處理后出水)各分成4組，每組1L，分別加入不同濃度(0，1，5，1Ommol/L)的Al3+(加入A1C1:,)，攪拌5-10min使絮體充分生成。調(diào)節(jié)pH于3.0。將約5g硅膠(100目)鋪于濾紙上，放在抽濾器(裝置圖如圖l所示，漏斗面為孔徑為80微米的沙濾面，直徑為10厘米，與錐形瓶的接口為磨沙接口，在實(shí)際應(yīng)用中在沙濾面上平鋪定性濾紙。圖l中l(wèi)為玻璃漏斗，2為沙濾面，3為錐形瓶，4為磨沙接口，5為真空泵接口)的布氏漏斗里，讓水樣通過。過濾后，收集硅膠，按照步驟l所述的酸堿洗脫法洗脫。將硅膠和洗脫液的混合物4000rpra，5min，4。C離心分離，取上清液，調(diào)節(jié)ra值為7左右，加入lmlIOXTE緩沖液。超濾至lml，按照步驟一的方法提取RNA，利用real-timeRT-PCR方法檢測(cè)其回收率，結(jié)果如表5和圖2所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在水樣中投加Ar能有效提高病毒的回收效率。投加lniMAr，調(diào)節(jié)pH為3時(shí)，回收效率最高，分別為8%和11.2%。當(dāng)An農(nóng)度繼續(xù)增加時(shí)，二級(jí)出水中的病毒回收率反而下降，lmM為其峰值所在處，這可能是因?yàn)锳r過多時(shí)，洗脫不易，而且形成的含有機(jī)雜質(zhì)的絮體有可能干擾后續(xù)分子生物學(xué)操作；而污水中的病毒回收率增長(zhǎng)平緩，可能是因?yàn)槲鬯乃|(zhì)條件更復(fù)雜，雜質(zhì)更多。表5.水樣中陽離子濃度對(duì)病毒回收率的影響A產(chǎn)濃度(mM)污水生活污水二級(jí)處理后出水12平均值12平均值0癒N/AN/A2.23%N/A2.23%16.60%6.60%6.60%3.42%19.01%11.22%12.44%2.57%7.51%2.52%5.51%4.01%102.40%15.69%9.04%4.98%2.95%3.96%3、固體吸附顆粒材料的選擇設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)比較三種不同的固體吸附顆粒材料(分別為200目硅膠(G200)，100目硅膠(G200)和二氧化硅顆粒(Si02))的回收效果。它們的顆粒大小是依次增大的，而且硅膠和二氧化硅顆粒表面的光滑程度是不同的。分別取200目硅膠(G200)，100目硅膠(G200)或二氧化硅顆粒(Si02)各2一3g設(shè)對(duì)生活污水或二級(jí)出水進(jìn)行吸附，將濾紙鋪在步驟2所述的抽濾器的漏斗里(圖l)，對(duì)污水進(jìn)行抽率吸附過濾。分別取按照步驟1的方法預(yù)過濾后的1L生活污水或二級(jí)出水中，分別加入lmMAl:!+(加入lmMA1C13)，調(diào)節(jié)pH為3.0，分別用上述漏斗里裝有5g200目硅膠(G200)，100目硅膠(G200)或二氧化硅顆粒(Si02)的抽濾器，進(jìn)行抽率，設(shè)兩個(gè)重復(fù)(如表6所示)，抽率后，收集固體吸附顆粒材料，分別按照步驟1所述的酸堿洗脫法洗脫，洗脫后得到的液體用超濾法再濃縮至lral，用步驟一的方法檢測(cè)濃集后水樣中輪狀病毒拷貝數(shù)，計(jì)算其回收率。結(jié)果如表6中所示，結(jié)果表明，回收率比較高的濾料是200目的硅膠。這可能是因?yàn)檫@種硅膠顆粒更精細(xì)，表面較光滑，易于洗脫。但是回收率普遍偏低(〈10%)，尤其是生活污水的回收率(〈5%)很低?？赡苁且?yàn)樯钗鬯|(zhì)條件復(fù)雜，病毒可能吸附在懸浮物或膠體上，依靠改變pH值的酸堿洗脫法很難將其洗脫下來。另外，固體懸浮物及A1(0H)3絮體的混合物和硅膠難以分離，大大增加了操作難度。而且這些雜質(zhì)對(duì)后續(xù)操作過程如超濾、提取RNA甚至熒光定量PCR檢測(cè)有嚴(yán)重干擾作用。表6.水樣經(jīng)不同濾料過濾后洗脫液中的病毒檢出量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>將上述固體顆粒吸附過濾后的水樣調(diào)節(jié)pH為7，加入lmlIOXTE緩沖液，超濾至lml，提取RNA后測(cè)定其中輪狀病毒的含量計(jì)算其占所加入病毒總量的比率，結(jié)果如表7所示，則固體顆粒吸附率為100%-上述固體顆粒吸附過濾后的水樣中的病毒占所投入病毒總量的比率，結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，這3種固體顆粒的吸附效率均很高，達(dá)到99.8%以上。表7.經(jīng)不同濾料過濾后的水樣中病毒的含量占投入病毒量的比例<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4、固體吸附顆粒材料的吸附方式優(yōu)化用200目硅膠作為固體吸附顆粒材料，水樣條件調(diào)節(jié)為Al"濃度為lmM，pH為3.0。分別用兩種不同方式進(jìn)行吸附過濾吸附方式一是將約5g200目硅膠鋪于濾紙上，放在步驟2所述的抽濾器的漏斗里(圖l)，讓水樣通過，效果類似于裝柱;吸附方式二是將1一4g200目硅膠投入水樣中，攪拌5-10rain，使病毒和固體顆粒充分接觸后，用漏斗里鋪有濾紙的抽濾器(圖l)過濾收集。相比而言第二種操作更簡(jiǎn)單。對(duì)于同一種固體吸附顆粒來說，采用不同吸附過濾方式顯然只可能對(duì)吸附效率有影響。因此，檢測(cè)了水樣用不同方式吸附過濾后過濾液中的病毒含量占投入病毒的量的比率，即將不同方式吸附過濾后過濾液用超濾法再濃縮至lml，用步驟一的方法檢測(cè)濃集后水樣中輪狀病毒拷貝數(shù)，計(jì)算其占投入病毒的比率從而計(jì)算得到不同吸附方式的吸附率。結(jié)果如表8所示，結(jié)果表明吸附方式二吸附率略低，但相差不大，吸附效率依然很高(〉99.5%)。因?yàn)楣枘z用量少，易于洗脫，操作簡(jiǎn)單，故決定采用第二種過濾方式，即采用將硅膠投入水中，攪拌5-10min，使病毒和固體顆粒充分接觸，用濾紙過濾收集硅膠。從以上對(duì)不同固體吸附顆粒和吸附方式選擇中可以看出，吸附效率都很高，即吸附步驟對(duì)回收效率影響不大。表8.水樣經(jīng)不同吸附顆粒吸附方式的吸附率檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>5、洗脫方法的優(yōu)化比較了四種洗脫法的洗脫效率(1)酸堿洗脫法用pH為3.0的H2S04溶液(約5ml)洗去固體顆粒表面的陽離子，然后放入30-50mlpH為10.5的NaOH中渦旋30min。洗脫液和固體顆粒的混合物用離心分離，取上清液留作超濾用。(2)牛肉提取液洗脫法將收集的固體顆粒放入30-50mlpH值為9.5的3%的牛肉提取液(BeefExtract),渦旋30min。(3)尿素-賴氨酸洗脫法尿素-賴氨酸溶液(Urea-argininephosphatebuffer,UAPB)由以下成分組成1.5M尿素0.02M賴氨酸0.008MNaH2P04。pH值為9.0。具體方法為將收集的固體顆粒放入50mlUAPB，渦旋30min。(4)甘氨酸-蘇氨酸洗脫法甘氨酸和蘇氨酸濃度分別為0.5mM,調(diào)節(jié)pH值為10。將收集的固體顆粒放入50ml溶液中，渦旋30min。將分別取1L生活污水水樣調(diào)節(jié)至Al'J+含量為lraM，選硅膠(100目)為濾料，按照步驟4所述吸附方式二所述方法進(jìn)行吸附過濾，將吸附的硅膠顆粒分別用四種洗脫方法洗脫。將洗脫液進(jìn)行濃縮，除了第二種洗脫方法得到的洗脫液用有機(jī)絮凝法(將洗脫液pH調(diào)節(jié)為3.5，緩慢攪拌20min，至有沉淀出現(xiàn)，離心，收集沉淀，溶解于加入Na2HPCU容液，超濾至lml)，其它均用將洗脫液直接超濾至lml后，提取RNA，利用real-timeRT-PCR方法測(cè)其回收率。設(shè)置兩個(gè)重復(fù)。結(jié)果如表9所示，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果表9中可以看出，利用尿素-賴氨酸洗脫法的回收率最高，而且重復(fù)性較好，平均值為27%;其次是甘氨酸-蘇氨酸洗脫法，在1015%之間；牛肉提取液的回收效率是最低的，僅為5.21%。而且，牛肉提取液中含有的豐富有機(jī)物使得洗脫液變得混濁，使超濾再濃縮過程非常困難，而且其中的雜質(zhì)對(duì)后續(xù)分子生物學(xué)操作有很大的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明傳統(tǒng)的牛肉提取液洗脫法和Katayama提出的酸堿洗脫法，并不適用于濁度高、雜質(zhì)多的二級(jí)出水和城市生活污水。表9.水樣經(jīng)不同濾料過濾后洗脫^菱中的病毒檢出量<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>6、洗脫液再濃縮方法的選擇實(shí)驗(yàn)中采用超濾法濃縮洗脫液，即在超濾管中加入待超濾的洗脫液，離心，收集濃縮后的溶液。在步驟5中所述采用牛肉提取液洗脫時(shí)，洗脫液中的膠體太多，超濾十分不易，故采用有機(jī)絮凝法。方法如下將洗脫液pH調(diào)節(jié)為3.5，緩慢攪拌20min，至有沉淀出現(xiàn)，離心，收集沉淀，溶解于加入Na2HP(U容液，超濾后待用。這種方法在步驟3中，已經(jīng)證實(shí)超濾再濃集的回收效率幾乎達(dá)100%。從表9中可以看出，利用有機(jī)絮凝法再濃集其中的病毒，最后的病毒回收率十分低(<2%)。這可能是由于洗脫效率過低引起的，可能是在洗脫液再濃縮時(shí)損失了很多病毒，也有可能是牛肉提取液濃縮后含有的大量有機(jī)物質(zhì)對(duì)后續(xù)分析產(chǎn)生了干擾，而引起偏差。顯然，與超濾法相比，這種方法的可行性不高。三、污水和污水處理廠尾水中病毒濃集方法的建立綜上所述，每1L污水的濃集方法的主要步驟為(1)取生活污水(對(duì)于生活污水，因其懸浮顆粒多，濁度高，用普通定性濾紙先預(yù)過濾，取濾液進(jìn)行處理)或污水處理廠尾水1L，水樣中加入Ar+至最終濃度為lmM，攪拌5—10min。(2)加入l-2g200目的硅膠顆粒，攪拌5-10min。(3)用定性濾紙過濾水樣，用約5ml的pH^.0的H2SO4溶液沖洗硅膠，然后收集硅膠顆粒。(4)將硅膠顆粒放入約50mlpH二9.0的尿素-賴氨酸緩沖液(1.5M尿素0.02M賴氨酸0.008MNa跳，PH值為9.0)中，振蕩渦漩20-30min。(5)離心分離固體顆粒和洗脫液的混合物，收集上清液，加入lml50XTE緩沖液，調(diào)pH為7.0，然后超濾至lml得到濃集了污水中病毒的溶液。用該方法對(duì)1L上述投入純培養(yǎng)輪狀病毒的生活污水或生活污水二級(jí)出水作為樣品進(jìn)行病毒濃集，濃集后的樣品進(jìn)行檢測(cè)病毒拷貝數(shù)，病毒回收率=(檢測(cè)出輪狀病毒的拷貝數(shù)/投加到水樣中輪狀病毒的拷貝數(shù))X100%。設(shè)置3個(gè)重復(fù)，結(jié)果表明本發(fā)明的方法的濃集生活污水中輪狀病毒的效率為21%，誤差范圍為7%;本發(fā)明的方法的濃集生活污水二級(jí)出水中輪狀病毒的效率為27%，誤差范圍為4.5%。實(shí)施例2、污水或污水處理廠尾水中病毒濃集方法的效果鑒定1.水樣采集方法采樣用塑料樣品瓶，取水時(shí)盡量減少與空氣接觸時(shí)間，用手握住樣品瓶底部，將瓶迅速浸入水面下，然后將瓶口轉(zhuǎn)向水流方向，待水樣充滿至瓶體積2/3時(shí)，在水中塞上瓶蓋，取出水面。將取回的水樣保存于4'C冰箱中，盡快完成實(shí)驗(yàn)操作。2.實(shí)際水樣采集地點(diǎn)及取樣體積實(shí)際水樣的監(jiān)測(cè)地點(diǎn)包括北京市Q污水處理廠(進(jìn)水、二級(jí)出水和再生水)、G污水處理廠(進(jìn)水、二級(jí)出水和再生水)、X污水處理廠(進(jìn)水和二級(jí)出水)和昆運(yùn)河某兩處水樣。其中，進(jìn)水(初沉池后面)取樣體積為10L，二級(jí)出水、再生水和地表水各取20L。3.常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)方法檢測(cè)如下指標(biāo)(1)化學(xué)需氧量C0D(2)總氮含量TN(3)總磷含量TP(4)氨氮含量NH:廠N(5)正磷含量OP以上指標(biāo)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，結(jié)果見表12。表12實(shí)際水樣水質(zhì)參數(shù)列表<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>4.水樣濃集方法分別取表12所示的污水，其中生活污水IOL，污水廠二級(jí)出水20L和再生水20L，地表水20L，將這些水樣進(jìn)行如下處理(1)加入A1C13至最終濃度為lraM，攪拌5-10min，將pH值調(diào)節(jié)至3.0。(2)分別加入lg/L污水(生活污水10g，二級(jí)出水、再生水或地表水20g)200目的硅膠顆粒，攪拌10-20rain。(3)用定性濾紙過濾水樣，每lg硅膠用10ml的pH=3.0的H2S04溶液沖洗硅膠，然后收集硅膠顆粒。(4)將硅膠顆粒放入pH=9.0的尿素-賴氨酸緩沖液(1.5M尿素0.02M賴氨酸0.008MNaH2P04，PH值為9.0)中，每lg硅膠顆粒用10ml尿素-賴氨酸緩沖液，振蕩渦漩20-30rain。(5)離心分離固體顆粒和洗脫液液的混合物，收集上清液，加入lml50XTE緩沖液/50ml尿素-賴氨酸緩沖液，調(diào)pH為7.0，然后超濾至2ml。(6)取其中l(wèi)ral濃縮液感染細(xì)胞MA-104后，提取細(xì)胞RNA。(7)另外lml直接提取病毒RNA，進(jìn)行real-timeRT-PCR擴(kuò)增(見實(shí)施例1)。5.RT-PCR方法直接測(cè)定水樣中的病毒(1)逆轉(zhuǎn)錄按照ExScript"RTreagentKit(Code:DRR035A)說明書提供的參考進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系(10iil)為表13逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系17<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>可根據(jù)需要相應(yīng)放大反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為42°C，15min;95°C，2min。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA立即做real-tiraePCR反應(yīng)或保存于一20。C。(2)幾種水中常見病毒特異性引物針對(duì)典型病毒設(shè)計(jì)的引物如表14所示表14實(shí)際水樣檢測(cè)中PCR擴(kuò)增所用引物<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如表15所示:表15.PCR的<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>反應(yīng)程序如表16所示表16.PCR的反應(yīng)程序<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>反應(yīng)結(jié)束后，將樣品做凝膠電泳。圖4一9所示為凝膠電泳照片，照片中字母A-G代表七種病毒(如表14所示)，1-17代表水樣編號(hào)，見表12。RT-PCR結(jié)果如圖4一9所示，從RT-PCR結(jié)果可以看出，水樣經(jīng)濃縮后利用RT-PCR直接檢測(cè)，在Q污水處理廠5月進(jìn)水(圖6中A7)、二級(jí)出水(圖6中A8)，X污水處理廠5月進(jìn)水(圖8中A13)、二級(jí)出水(圖8中A14)和實(shí)驗(yàn)室生活污水(圖8種A15)中檢出輪狀病毒RV-SA-11;在X污水處理廠5月進(jìn)水(圖8中B13)中檢測(cè)出有人輪狀病毒RV-Wa;在頤和園地表水中檢出了諾沃克病毒(NV-GII)(圖4.7中A7)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的濃集方法能有效濃集水樣痕量病毒，在17個(gè)水樣中，檢測(cè)病毒呈陽性的有5個(gè)，檢測(cè)出有輪狀病毒和諾瓦克病毒存在，特別是在小紅門污水廠進(jìn)水中，檢測(cè)出有人輪狀病毒存在。6.用ICC-RT-PCR測(cè)定水中具有感染性的病毒(1)細(xì)胞感染方法(a)將濃集后lral水樣用0.2um的濾膜過濾除菌。(b)在除菌后的水樣中加入100y1濃度為0.002%的胰酶，37'C孵育lh。(c)取一瓶(25cm2)生長(zhǎng)至單層的MA-104細(xì)胞(ATCC，美國(guó)細(xì)胞典藏中心，保藏號(hào)為ATCCCRL-2378.1)，去掉培養(yǎng)基，用pH為7.2的無菌PBS洗一次，加入37。C孵育后的水樣和lml無血清DMEM培養(yǎng)基(購自Hyclone公司)。37°C，5%C02孵育1.52h，每20min平搖一次，以便病毒充分進(jìn)入細(xì)胞。(d)孵育1.52h后，去掉水樣和無血清DMEM培養(yǎng)基，加入4ml含有2X胎牛血清的面EM培養(yǎng)基，37°C，5%(:02培養(yǎng)23天。(e)培養(yǎng)2天后，觀察細(xì)胞病變情況。完全去掉上清，加入lmlTrizol，充分混勻，用于細(xì)胞總RNA提取。(2).Trizol法提取細(xì)胞總RNA(a)去掉細(xì)胞上清液，加入lmlTrizol，平搖5min，使之與細(xì)胞充分混勻。(b)收集lmlTrizol充分混勻的細(xì)胞液體于1.5ml的印pendorf管中，室溫放置10min。(c)加入200ul的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管(溶液充分乳化，成乳白狀，無分相現(xiàn)象)，室溫放置10min。(d)離心4。C、13000r/rain、15rain，取上層液相移入另一管(切忌吸動(dòng)白色中間相)。(e)加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min。(f)離心4°C、13000r/min、15min，(這時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)靠近管底的壁上有一星點(diǎn)的白色沉淀物，就是它了)用移液器小心吸去所有上清。(g)lml75。/。乙醇洗一遍，離心4°C、8000r/rain、10min，用移液器小心吸去所有上清，在超凈臺(tái)中干燥5min。(h)加入20u1DEPC處理水。立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后凍存于一7(TC，可保存一年；若加入DEPC水后則只能在一20。C保存1個(gè)月左右。同時(shí)直接將濃集水樣提取RNA后，用RT-PCR檢測(cè)病毒，作為對(duì)照。ICC-RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，直接用RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，圖IO和圖11中照片中字母A-G代表七種病毒(如表14所示)，l-17代表水樣編號(hào)，見表12。從圖中可以看出，Q污水處理廠3月水樣經(jīng)濃縮后利用細(xì)胞感染和RT-PCR結(jié)合的技術(shù)，在進(jìn)水(圖10中Gl)和出水(圖10中G2)中檢測(cè)出諾沃克病毒(NV-GII)，在出水中檢測(cè)出甲型肝炎病毒HAV(圖10中C2)。但是這三個(gè)水樣直接利用RT-PCR方法沒有檢測(cè)出任何病毒(圖ll)，本研究結(jié)果表明ICC-RT-PCR方法比直接利用RT-PCR方法靈敏，而且，本研究結(jié)果表明，在清河污水處理廠3月份的進(jìn)水、二級(jí)出水和再生水中都存在一定濃度的具有感染性的甲型肝炎病毒和諾沃克病毒。權(quán)利要求1、一種濃集污水或污水處理廠尾水中病毒的方法，包括以下步驟1)調(diào)節(jié)水樣條件取污水或污水處理廠尾水水樣，加入Al3+，使Al3+終濃度為0.5-1mol/L，將pH值調(diào)節(jié)至3.0-3.5；2)吸附在步驟1)的水樣中，加入硅膠顆粒，攪拌吸附；3)洗脫收集步驟2)吸附后的硅膠，用pH3.0-3.5的H2SO4溶液沖洗后，放入pH值為9.0-9.5的尿素-賴氨酸緩沖液中振蕩渦漩，離心收集上清液得到洗脫液；4)洗脫液濃縮將步驟3)得到的洗脫液超濾濃縮得到濃縮了病毒的污水樣品。2、根據(jù)權(quán)利要求i所述的方法，其特征在于所述步驟i)中，Ar+終濃度為lmol/L，所述A13+是通過A1C13加入的。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，將污水或污水處理廠尾水的pH值調(diào)節(jié)至3.0。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述硅膠顆粒的粒徑為200目，所述硅膠顆粒的添加量為l一4g/L污水或污水處理廠尾水，優(yōu)選為lg/L污水或污水處理廠尾水。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述攪拌吸附的時(shí)間為10-20分鐘。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，收集步驟2)吸附后的硅膠是用濾紙過濾收集，所述濾紙優(yōu)選為定性濾紙；所述尿素-賴氨酸緩沖液為的pH值為9.0;所述沖洗用H2S04溶液pH值為3.0，所述H2SCU容液的用量為10一20ml/g硅膠顆粒。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，尿素-賴氨酸緩沖液的用量為20—30ml/g硅膠顆粒；所述振蕩渦漩的時(shí)間為20-30分鐘。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟4)中還包括在洗脫液超濾前先每50ml尿素-賴氨酸緩沖液加入lral50XTE緩沖液，并調(diào)水樣pH為7.0。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述步驟4)中，所述超濾后每1L污水或污水處理廠尾水水樣濃縮至0.l—l.5ml。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于當(dāng)所述污水為生活污水時(shí)，所述步驟l)中，還包括將所述污水在調(diào)節(jié)水樣前進(jìn)行過濾。全文摘要本發(fā)明公開了一種濃集污水或污水處理廠尾水中病毒的方法。該病毒濃集的方法，包括以下步驟1)調(diào)節(jié)水樣條件取污水或污水處理廠尾水水樣，加入Al³⁺，使Al³⁺終濃度為0.5-1mol/L，將pH值調(diào)節(jié)至3.0-3.5；2)吸附在步驟1)的水樣中，加入硅膠顆粒，攪拌吸附；3)洗脫收集步驟2)吸附后的硅膠，用pH3.0-3.5H₂SO₄溶液沖洗后，放入pH值為9.0-9.5的尿素-賴氨酸緩沖液中振蕩渦漩，離心收集上清液得到洗脫液；4)洗脫液濃縮將步驟3)得到的洗脫液超濾濃縮。本發(fā)明的方法不僅具有回收率相對(duì)較高、處理水量大、效果穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，還可以將濃集后的樣品直接用于分子生物學(xué)操作，為快速準(zhǔn)確檢測(cè)水環(huán)境中的病毒提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。文檔編號(hào)C02F9/02GK101164918SQ200710175738公開日2008年4月23日申請(qǐng)日期2007年10月11日優(yōu)先權(quán)日2007年10月11日發(fā)明者苗何,施漢昌,丹李,萬楊,昕胡申請(qǐng)人:清華大學(xué)