專利名稱：一株高效降解有機(jī)污染物的細(xì)菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種具有降解土壤持久性有機(jī)污 染物苯并芘功能的細(xì)菌。
背景技術(shù)：
研究表明，工業(yè)生產(chǎn)中燃料的不完全燃燒、石油開釆、污水灌溉、焦炭 生產(chǎn)、金屬冶煉、汽車尾氣等都能產(chǎn)生有機(jī)污染物多環(huán)芳烴。多環(huán)芳烴對(duì)人體的毒性表現(xiàn)在強(qiáng)致癌、致突變及致畸性。人類及動(dòng)物癌癥病變有70%~90% 是環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)引起的，而多環(huán)芳烴則是環(huán)境致癌物中最大的一類。吸入 大氣中吸附在微粒上的多環(huán)芳烴而導(dǎo)致的肺癌占總肺癌病變的85%以上，長(zhǎng) 期暴露在含高濃度多環(huán)芳香烴的煙氣、石油分餾、莉青及煤產(chǎn)品等環(huán)境中， 皮膚癌即肺癌發(fā)病率很高。苯并[a]芘(BaP)是多環(huán)芳烴中最具代表性且具有強(qiáng)致癌性的物質(zhì)，它 是含5個(gè)環(huán)的稠環(huán)芳烴，已經(jīng)被許多國(guó)家和組織的環(huán)保和衛(wèi)生機(jī)構(gòu)確認(rèn)為應(yīng)重 點(diǎn)監(jiān)測(cè)和關(guān)注的致癌危險(xiǎn)物?？諝庵斜讲a]芘污染的主要來源有下列幾個(gè)方面(1)工業(yè)鍋爐和家用 爐灶燃煤研究表明我國(guó)主要為燃煤型污染，大同巿作為我國(guó)主要的產(chǎn)煤基 地之一，其能源結(jié)構(gòu)以耗煤為主，燃煤占全巿的總耗能的99%以上，據(jù)分析， 全巿苯并[a]芘的日均值達(dá)到330ng/i^[馬西林,丁中華，劉瑞蓮等.大同巿空 氣中多環(huán)芳烴與人尿中1-羥基芘的分析.環(huán)境化學(xué),1994,13(6):536 542]。唐書 彥等研究了包頭巿大氣中BaP在9年中的含量，表明巿區(qū)內(nèi)BaP的含量為 0.90ug/100m3—2.77ug/100m3，且冬春(釆暖期)大氣中苯并[a]芘的含量高于 夏秋(非釆暖期)，工業(yè)區(qū)附近的大氣BaP含量高于非工業(yè)區(qū)[唐書彥，侯莉 英.包頭巿城區(qū)大氣中BaP濃度十年監(jiān)測(cè)淺析[J].內(nèi)蒙古環(huán)境保護(hù)，1995, 7 (1): 31~34]。 (2)工業(yè)生產(chǎn)lkg燃料在燃燒過程中產(chǎn)生的苯并[a]芘量為: 煤67mg 136mg;木材40mg ~ 68mg;汽油12mg ~ 50.4mg。某些工廠周圍lkm 內(nèi)大氣中的苯并[a]芘濃度為焦化廠0.13嗎/100mS 57.8pg/100m3,煉油廠0.03ng/100m3 ~ 5.04ng/100m3，冶煉廠0.87嗎/100m3 ~ 3.06pg/100m3。焦化和石油化工的興起大大增加苯并[a]芘對(duì)環(huán)境的污染，焦化廠附近500米處的濃度 比一般工業(yè)城巿高出500- 1000倍。在半敞開的焦?fàn)t瀝青加熱附近4m處的苯 并[a]芘濃度高達(dá)78ug/m3 [蹇興超.多環(huán)芳烴(PAH)的污染.環(huán)境保護(hù)，1995, 10: 31 33]。 (3)交通據(jù)報(bào)道汽車每行駛lkm排出的BaP量為8 10mg。隨著機(jī) 動(dòng)車數(shù)量的增加，路面交通堵塞的升高，在一些公路交通路口苯并[a]芘污染 也曰趨嚴(yán)重。此外，在公路隧道中，由于空氣污染擴(kuò)散。致癌性苯并[a]芘濃 度相當(dāng)高。(4)垃圾焚燒和森林失火；(5)烹調(diào)動(dòng)物蛋白烹炸過程中可以 產(chǎn)生苯并[a]芘，散發(fā)到廚房中，從而進(jìn)入人體，這可能是導(dǎo)致炊事人員呼吸 道肺癌發(fā)病率增加的主要原因?？绝嗆囬g空氣樣品中含有苯并[a]芘，某三處 酒家廚房油煙中苯并[a]芘含量為0.373pg/100m3 1.483|ig/100m3 [袁彥華,孫 連軍，郭秀蘭等.多環(huán)芳烴化合物環(huán)境污染研究.環(huán)境與健康雜志，1999, 16(3): 182~185]。 6)煙草煙氣吸煙嚴(yán)重的家庭室內(nèi)空氣中苯并[a]芘濃度比不吸 煙的家庭高10倍以上[朱利中，劉勇建，松下秀鶴等.室內(nèi)空氣中多環(huán)芳烴的 污染特征、來源及影響因素分析.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2001, 21(1): 64 68]。 一些國(guó) 家和組織對(duì)肺癌產(chǎn)生的可能因素進(jìn)行了調(diào)查研究，初步認(rèn)為吸煙比大氣污染 對(duì)肺癌的增長(zhǎng)具有更直接的關(guān)系。每天吸煙20支的人可吸入0.6pg 0.8^ig苯并 [a]芘，吸煙者比不吸煙者肺癌的危險(xiǎn)性高2倍。土壤中苯并[a]芘的主要來源是工業(yè)滲漏，固體廢物和大氣沉降。不同區(qū) 域的土壤中苯并[a]芘的含量不同。自然區(qū)土壤中苯并[a]芘的含量為1.5-28.0 pg/kg，石油污染灌溉10余年的土壤苯并[a]芘含量為50 15(Hig/kg,工業(yè)區(qū)特 別是老工業(yè)區(qū)的土壤的含量一般為350 56(^g/kg，老的煉油廠區(qū)的土壤高達(dá) 12000 |ig/kg，飛機(jī)場(chǎng)附近的植被和土壤中多環(huán)芳烴含量比其它控制污染區(qū)高 8 ~ 9倍[王連生.多環(huán)芳烴分析技術(shù).南京大學(xué)出版社，1988]。我國(guó)食品受苯并[a]芘污染的主要途徑有以下幾個(gè)方面(1 )煙塵污染 煤炭、石油、木材等的不完全燃燒，產(chǎn)生的苯并[a]芘附著在不完全燃燒的顆 粒上進(jìn)入空氣，經(jīng)過沉降作用附著于植物表面或土壤中，被葉和根吸收。據(jù) 調(diào)查，工業(yè)區(qū)生產(chǎn)的菜籽，苯并[a]芘的含量為215.5pg/kg，而農(nóng)業(yè)區(qū)同類作 物僅含有2.69ng/kg。 (2)廢水、廢氣污染生產(chǎn)炭黑、煉油、煉焦、合成橡膠、瀝青等行業(yè)的廢水、廢氣中含有大量苯并[a]芘。廢水排入江河湖海中， 通過食物鏈將苯并[a]芘濃縮于魚、蝦、貝、海菜等水產(chǎn)品中。某地調(diào)查鰻魚 中苯并[a]芘含量為lng/kg 2.7pg/kg,遠(yuǎn)高于海水中的含量。瀝青中苯并[a] 芘的含量高達(dá)2.5%~3.5%，噴燒瀝青時(shí)苯并[a]芘散發(fā)在空氣中，對(duì)環(huán)境和空 氣造成極大污染。汽車排放的廢氣是環(huán)境和食物中苯并[a]芘增加的一個(gè)重要 來源，燃燒lkg汽油可排放12pg 50嗎的苯并[a]芘。(3)食品加工過程中的 污染生魚、生豬肉、生羊肉等一般檢出苯并[a]芘的量極少，但燒烤后含量 明顯增加。烤制食品常用的燃料有煤、木炭、焦炭、煤氣和電熱等，其食品 與燃燒產(chǎn)物直接接觸，除煙塵中的苯并[a]芘可使食品遭受污染外，烘烤時(shí)有 機(jī)物受熱分解，亦經(jīng)環(huán)化，聚合形成苯并[a]芘，從而使食品中的苯并[a]芘含 量增加。苯并[a]芘對(duì)人體的致癌劑量為13.3mg。由于苯并[a]芘的五個(gè)苯環(huán)的排列 是非對(duì)稱的，而使得各結(jié)合鍵上的電子密度有明顯的差異。苯并[a]芘的4,5-鍵(菲環(huán)雙鍵)具有高電子密度(被稱之謂"K區(qū)")。易與細(xì)胞內(nèi)的大分子(如DNA, RNA等)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，有可能破壞DNA和RNA的正常功能，主要是使DNA 的遺傳信息發(fā)生改變，引起細(xì)胞致突變，從而引發(fā)癌變。大量動(dòng)物試驗(yàn)已證 實(shí)苯并[a]芘能夠引發(fā)肺癌、皮膚癌、胃癌等癌變[朱雨辰，曹曉煜.淺談苯并 [a]芘[J].江蘇環(huán)境科學(xué)，1999， 12(4): 43~44]。其代謝產(chǎn)物的毒性作用通 常是經(jīng)過氧化代謝過程產(chǎn)生的中間體與大分子反映導(dǎo)致靶細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的 改變，終代謝產(chǎn)物二氫二醇環(huán)氧苯并芘(BPDE)不僅能和DNA形成加合物， 而且代謝過程中產(chǎn)生的大量活性氧簇(ROS)也會(huì)造成DNA損傷。DNA損傷 后如果得不到及時(shí)修復(fù)，就會(huì)在復(fù)制過程中產(chǎn)生突變，最終致癌。微生物降解苯并[a]芘有兩種途徑:一種是作為微生物的唯一碳源和能源,另 一種是共代謝或共氧化作用。雖然多環(huán)芳烴的去除途徑主要靠微生物降解,但 苯并[a]芘因其分子結(jié)構(gòu)內(nèi)苯環(huán)的高度密集,以及其高的辛醇水分配系數(shù),而具 有很強(qiáng)的難降解性。共代謝是指微生物在有可利用的唯一碳源時(shí)，對(duì)它原來不 能利用的物質(zhì)也能分解代謝的現(xiàn)象[程國(guó)玲,李培軍,王鳳友等.多環(huán)芳烴污染 土壤的植物與微生物修復(fù)研究進(jìn)展[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備,2003， 4(6): 30-36]。當(dāng)一級(jí)基質(zhì)存在時(shí),一級(jí)基質(zhì)的代謝能提供足夠的碳源和能源,供微生物生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的降解酶,從而降解二級(jí)基質(zhì),共代謝被認(rèn)為是降解難降解有機(jī)物的主要方式。苯并[a]芘被細(xì)菌降解時(shí)，在雙加氧酶的進(jìn)攻下,一 般先在碳4，5 、 9，10 、 11，12位置上生成順式二氫二醇2苯并[a]芘,然后相應(yīng) 的二氫二醇2苯并[a]芘之間的化學(xué)鍵分別斷裂，生成開環(huán)化合物，該類化合物 進(jìn)一步被降解[鞏宗強(qiáng)，李培軍,王新等.真菌對(duì)土壤中苯并(a)芘的共代謝降解 [J].環(huán)境科學(xué)研究，2001, 14 (6): 36 ~ 39]。本發(fā)明是從長(zhǎng)期受到有機(jī)污染的農(nóng)田土壤中分離、篩選到一株具有高效 降解苯并[a]芘功能的細(xì)菌。該菌株可以用于降解環(huán)境中的有機(jī)污染物苯并[a] 芘，在修復(fù)菜地和農(nóng)田有機(jī)污染方面具有廣闊的應(yīng)用前景。 .發(fā)明內(nèi)容(一) 要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一株高效降解有機(jī)污染物的細(xì)菌，本發(fā)明的又一目 的是公開該細(xì)菌的應(yīng)用。(二) 技術(shù)方案本發(fā)明所述的短波單孢菌CB vww/^o"a5 sp.),該菌株已于2008年11月 17曰被保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱 CGMCC,保藏編號(hào)為CGMCCNo. 。該菌經(jīng)形態(tài)、生理生化特征分析和16srDNA基因序列同源性分析，鑒定 為變型細(xì)菌a亞群柄桿菌科短波單孢菌屬CBwvM"Amw7^sp.)。該菌最適生長(zhǎng) 溫度為3(TC，最適生長(zhǎng)pH為7 8。該菌形態(tài)特征菌落形態(tài)圓形凸起，表面光滑濕潤(rùn)，乳白色，邊緣規(guī)則； 菌體形態(tài)菌體細(xì)桿狀，G-,長(zhǎng)2um，寬0.3um。 生理生化特性 接觸酶反應(yīng)陽性； 氧化酶反應(yīng)陽性；生長(zhǎng)溫度4"不生長(zhǎng)，28"生長(zhǎng)，37。C不生長(zhǎng)；耐鹽性試驗(yàn)2。/。NaCl生長(zhǎng)，5。/。NaCl生長(zhǎng)，7。/。NaCl不生長(zhǎng)；苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)陽性；利用檸檬酸鹽陰性；水解淀粉陰性； 卵黃卵磷脂酶陰性； 甲基紅試驗(yàn)陽性； V. P試驗(yàn)陰性； PH5.7生長(zhǎng)陰性；糖醇發(fā)酵產(chǎn)酸葡萄糖陽性，甘露醇陽性，乳糖陰性，蔗糖陰性。 該菌能高效降解苯并[a]芘，可應(yīng)用于修復(fù)菜地和農(nóng)田有機(jī)污染。 (三)有益效果本發(fā)明所述的短波單孢菌(^^w/"&wo"w sp.)在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)30天 對(duì)土壤中的苯并[a]芘降解率達(dá)到80%,在修復(fù)菜地和農(nóng)田有機(jī)污染方面具有 很好的應(yīng)用前景。本發(fā)明所述的短波單孢菌(5^vw"^mo"必sp.),該菌株已于2008年11月17 曰被保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC, 保藏編號(hào)為CGMCC No.。


圖1是本發(fā)明所述短波單孢菌CS^vww^mo"as sp.)在液體培養(yǎng)條件下的生 長(zhǎng)曲線；圖2是本發(fā)明所述短波單孢菌CBwvw"Amw20s sp.)在液體培養(yǎng)條件下對(duì)苯 并[a]芘的降解曲線；圖3是本發(fā)明所述短波單孢菌(5^vw"Amo/ms sp.)對(duì)土壤中苯并[a]芘的降解曲線。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。 實(shí)施例1 本發(fā)明所述短波單孢菌08 ^ ^//附0 05 sp.)的分離稱取10g沉積物樣到90ml無菌水中，加入一定量的玻璃珠，搖床中振蕩 3h。靜置30min后，移取5ml上清液到45ml含有苯并[a]芘終濃度為5mg/1 的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，25°C, 150r/min避光培養(yǎng)。以后每隔8d移取適量菌液至 新的無機(jī)鹽-苯并[a]芘液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，連續(xù)富集培養(yǎng)32d后，移取混 合菌液稀釋至l(T6，涂布于2216E培養(yǎng)基平板上分離、純化，記錄單菌落形 態(tài)并斜面保存菌種。2216E培養(yǎng)基(1000ml): pH7.6-7.8，蛋白胨5g,酵母浸膏l(xiāng)g,轔酸高 鐵0.01g，陳海水1000ml。無機(jī)鹽培養(yǎng)基(NH4)2S04 0.5g/l， NaNO30.5g/l, CaCl2 0.02g/l， KH2P04 1.0g/l， NaH2PO41.0g/l, MgSO40.2g/l， pH7.5。實(shí)施例2本發(fā)明所述短波單孢菌(^"^" ^> 0"^5口.)的對(duì)苯并[3]芘的降解降解實(shí)驗(yàn)在裝液量為250ml的三角瓶中進(jìn)行。溶液中苯并[a]芘的濃度為 5mg/l。接入本發(fā)明所述短波單孢菌(^^vw"&mowwsp.)的菌懸液，使培養(yǎng)液中 初始細(xì)胞濃度達(dá)到2.0x 107個(gè)/ml，同時(shí)設(shè)不接菌對(duì)照，各3個(gè)重復(fù)，在28'C 下振蕩培養(yǎng)l、 2、 4、 6、 8、 10d后，取樣分析培養(yǎng)液中苯并[a]芘的含量及活 菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為活菌數(shù)量在第6天的數(shù)量達(dá)到了3.5xl()Scfu/m1,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌體 數(shù)量逐漸減少，10天時(shí)活菌數(shù)量為9xl0"cfii/ml，如附圖1所示。無苯并[a]芘的降解率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，至第10天增到40%, 如附圖2所示。實(shí)施例3 本發(fā)明所述短波單孢菌CB"vM"Awo"os sp.)對(duì)土壤中苯并[a]芘的 降解取中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院東門外實(shí)驗(yàn)田土壤，將土壤過2mm篩，在三角瓶中加 入30g 土壤，濕熱滅菌30min，向瓶中加入苯并[a]芘-丙酮母液(5mg/ml )300ul， 使苯并[a]芘的終濃度達(dá)到50mg/kg。按10%的量向土壤中加入測(cè)試菌菌懸液， 同時(shí)以無菌水作為對(duì)照，隨時(shí)補(bǔ)加無菌水，使土壤水分為30%，置25'C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，分別在7d、 14d、 21d、 28d、 42d取樣測(cè)苯并[a]芘的殘留量。苯并[a]芘殘留量的測(cè)定方法將培養(yǎng)后的土壤風(fēng)干后取lg，放在50ml 離心管中，加3ml丙酮超聲萃取30min后，11000r/min離心，離心10min, 取上清到新的離心管中，在65"水浴鍋中將丙酮蒸發(fā)至干后加10ml環(huán)己烷， 充分混勻后在分光光度計(jì)上于296nm處測(cè)其吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖3所示，在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)30天對(duì)土壤中的苯并[a] 芘降解率達(dá)到80%。
權(quán)利要求
1、一株高效降解有機(jī)污染物的短波單孢菌(Brevundimonas sp.)CGMCCNo. id="icf0001" file="A2008102261930002C1.tif" wi="22" he="8" top= "35" left = "29" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于所述的有機(jī)污染物是苯并[a]芘。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的菌株在修復(fù)菜地和農(nóng)田有機(jī)污染方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株高效降解有機(jī)污染物的短波單孢菌(Brevundimonassp.)CGMCC No.2746。該菌在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)30天對(duì)土壤中的苯并[a]芘降解率達(dá)到80％，在修復(fù)菜地和農(nóng)田有機(jī)污染方面具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)B09C1/10GK101402931SQ20081022619
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日
發(fā)明者任天志, 孫建光, 晶 徐, 徐明崗, 楊肖娥, 胡海燕 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所