專(zhuān)利名稱(chēng)：用于尿沉渣分析的多層載玻片的制作方法
用于尿沉渣分析的多層載玻片
背景技術(shù)：
本發(fā)明一般性涉及尿的各種類(lèi)型的沉渣和顆粒分析。例子包括白血球、紅血球、上皮細(xì) 胞、卵形脂肪體、透明管型、粒性管型、白細(xì)胞管型、腎細(xì)胞管型、蠟樣管型、脂肪管型、尿酸 晶體、草酸鈣晶體、馬尿酸晶體、磷酸鈣晶體、三磷酸鹽晶體等。此類(lèi)分析可用于確定患者是 否需要醫(yī)療照顧。目前，尿沉渣分析可通過(guò)手工顯微鏡檢術(shù)、流式細(xì)胞光度術(shù)、流式細(xì)胞成象和微流 控載玻片成象來(lái)完成。其中，微流控載玻片成象優(yōu)于其它。手工顯微鏡檢術(shù)精確但卻是勞 動(dòng)密集型的，并且需要經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的技術(shù)人員。流式細(xì)胞光度術(shù)和流式細(xì)胞成象雖然需要較 少的手工作業(yè)，但不夠精確。往往需要隨后進(jìn)行手工顯微鏡檢。流式細(xì)胞成象和流式細(xì)胞 光度術(shù)的例子可分別在US6，825，926和US3，826，364中找到。US5, 699，794討述了本領(lǐng)域的許多其它專(zhuān)利，公開(kāi)了一種用于尿沉渣分析的自動(dòng) 化系統(tǒng)和測(cè)定池(cell)。US3，777，283公開(kāi)了一種塑料載玻片，其中利用了毛細(xì)管力來(lái)將 液體試樣吸入透明的觀(guān)察室。US4, 441，793公開(kāi)了一種用于顯微鑒定的載玻片，其具有一或 兩個(gè)用于通過(guò)移液管將樣品引入觀(guān)察區(qū)的開(kāi)口。然而，所述載玻片沒(méi)有將觀(guān)察室與樣品入 口分離，這使得更加難以在顯微鏡中精確地讀出圖象。在US6，004，821中可找到在載玻片 中進(jìn)行手工顯微鏡檢術(shù)的另一個(gè)例子，其中在單個(gè)包含樣品的載玻片上進(jìn)行了幾種類(lèi)型的 分析。在一類(lèi)分析中，一部分尿樣被送往用于鑒別尿管型的室。該室包括能從樣品中除去 水的吸水層(例如水凝膠)，固定管型以便目視檢查。在另一類(lèi)分析中，析出了細(xì)菌和紅血 球、白血球并可以在具有可變深度的形成顆粒室中看到它們。近年來(lái)，采用微流控技術(shù)的分析在包括尿和血液在內(nèi)的生物樣品中的應(yīng)用越來(lái)越 突出。總的來(lái)說(shuō)，微流控盤(pán)或類(lèi)似的“芯片“通常提供一組互連的室，液體樣品流過(guò)它們與 不同的試劑相遇。樣品與試劑的反應(yīng)提供與分析物在樣品中的存在有關(guān)的信息(例如變色 等)。在典型的微流控裝置中，所述室和互連通道形成在基體層(往往為塑性材料)中，且 在所述基體上放置覆蓋物。例子參見(jiàn)US7，094，354。這種微流控裝置可改造成適應(yīng)尿樣的 沉渣目視分析。然而這種微流控裝置的制造成本相當(dāng)高，可取的將是成本較低的設(shè)計(jì)。本 發(fā)明的發(fā)明人找到了一種成本較低但仍很精確的尿沉渣及其它顆粒的分析方法。US7, 094，354教導(dǎo)了借助于小的離心力在微流控裝置中分離顆粒，特別是從全血 樣品中分離紅血球。這種分離與主體血液分離中采用的大離心力形成對(duì)比。使用了細(xì)長(zhǎng)的 室以使紅血球可以在底部聚集，而分離的血漿從室的頂部抽出。室壁表面制成具有與紅血 球的表面能相匹配或稍低的表面能。適當(dāng)?shù)谋诒砻婺芎兔?xì)管力的結(jié)合使得不使用大離心 力就能實(shí)現(xiàn)紅血球的分離。如果需要在尿樣中鑒別顆粒并加以研究，則這些顆粒應(yīng)當(dāng)是相對(duì)靜止的。上 述US6，004，821中公開(kāi)了一種定位顆粒的手段，即通過(guò)從樣品中吸收水使顆粒固定。 US6, 004, 821還公開(kāi)了使用傾斜室，它能將顆粒按其大小進(jìn)行表觀(guān)分類(lèi)。在本發(fā)明中，通過(guò) 提供具有適當(dāng)表面能的觀(guān)察室來(lái)分離和固定顆粒和沉渣，如下面所詳述的。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種執(zhí)行尿顆粒和沉渣的目視分析裝置。一方面，本發(fā)明涉及一種目視檢 查尿樣的所述顆粒和沉渣的方法。將尿樣引入到包含用于從移液管接受所述樣品的入口的 載玻片中。尿液流入封閉的入口室中，然后通過(guò)毛細(xì)管通道流入封閉的觀(guān)察室中。通過(guò)相 對(duì)于樣品適當(dāng)選擇觀(guān)察室壁的表面能，在所述壁上分離和固定固體物質(zhì)。然后可通過(guò)適當(dāng) 手段例如顯微鏡或自動(dòng)化儀器在觀(guān)察室中目視檢查所述樣品。另一方面，本發(fā)明涉及一種適合目視檢查尿樣的顆粒(例如紅血球)或沉渣(如 尿管型和草酸鈣晶體)的載玻片。該載玻片包括三個(gè)層，即光學(xué)透明的基體層，包含至少一 個(gè)入口室和觀(guān)察室的中間層，其中所述兩室通過(guò)毛細(xì)管通道相連，以及包含用于引入尿樣 的入口開(kāi)口和用于從觀(guān)察室中釋放空氣的排氣口的光學(xué)透明頂層。相對(duì)于樣品的表面能所 述光學(xué)透明層具有高表面能，使得為便于檢查僅借助于表面能分離和固定顆粒和沉渣。一 般而言，所述光學(xué)透明層應(yīng)當(dāng)是高度親水性的。當(dāng)表面相對(duì)于樣品主體液體的表面能大于 顆粒和沉渣相對(duì)于該表面的表面能減去顆粒和沉渣相對(duì)于主體液體的表面能時(shí)，顆粒和沉 渣將會(huì)附著在所述光學(xué)透明層上。此關(guān)系的數(shù)學(xué)表達(dá)式在下文中給出。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明


圖1是本發(fā)明載玻片的頂層的俯視圖。圖2是本發(fā)明載玻片的中間層的俯視圖。圖3是本發(fā)明的三層載玻片的剖視圖。優(yōu)選實(shí)施方案說(shuō)明
總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供一種使用載玻片進(jìn)行尿分析的裝置，其中尿樣通過(guò)移液管引入， 然后通過(guò)毛細(xì)管通道流入一個(gè)區(qū)域，在該區(qū)域可對(duì)樣品進(jìn)行光學(xué)檢查以確定顆粒和沉渣 (如上述的那些)的存在。圖1-3顯示了一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。該載玻片結(jié)合了三個(gè)層(圖3中的10、20和30) 并可以容納25個(gè)獨(dú)立樣品。基體層30為相對(duì)于樣品具有高表面能的光學(xué)透明的材料，如 醋酸纖維素，頂層10為另一片相對(duì)于樣品具有高表面能的光學(xué)透明的材料(例如醋酸纖維 素)，其經(jīng)過(guò)切割以提供用于在引入液體時(shí)除去空氣的排氣縫14和用于通過(guò)移液管引入樣 品的開(kāi)口 12。中間層20是一片聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯，其經(jīng)過(guò)切割以提供入口室22和觀(guān) 察室觀(guān)，所述兩室通過(guò)毛細(xì)管通道M相連。所述中間層在兩側(cè)都具有丙烯酸涂層膠帶(例 如3M9494)以將中間層粘合到頂層和底層。圖1顯示了如載玻片使用者所看到的頂層10。使用者將從移液管向入口 12中分 配被測(cè)數(shù)量的尿，空氣將通過(guò)排氣縫14排出。圖2顯示了中間層20及其構(gòu)成兩個(gè)室和互 連毛細(xì)管通道的切口。液體將流入入口室22，然后通過(guò)毛細(xì)管M流入觀(guān)察室觀(guān)以供檢查。 第三層30(參見(jiàn)圖幻為基體層，其是光學(xué)透明的，使得可以從觀(guān)察室的上面和下面，即透過(guò) 所述透明頂層或所述透明基體層，進(jìn)行檢查。盡管所示載玻片包含25組形成用于容納和觀(guān)察25個(gè)樣品的位置的切口，但應(yīng)當(dāng) 清楚本發(fā)明并不局限于任何具體的測(cè)試位置組數(shù)。根據(jù)用于觀(guān)察樣品的設(shè)備的能力，其可 為從1到任何適當(dāng)?shù)臄?shù)字。在圖1-3所示的載玻片中，長(zhǎng)為5英寸(127mm)，寬為3. 8英寸(96. 5mm)，頂層和基 體層的厚度為0. 005英寸(0. 127mm)，而中間層包括一對(duì)膠帶在內(nèi)為0.014英寸(0. 356mm)
厚。請(qǐng)注意，由于所述三個(gè)層十分薄，所以在圖3中各層的厚度比實(shí)際尺寸要大得多。樣品量將由入口室、毛細(xì)管和觀(guān)察室的總合容積確定。樣品量的選擇并不重要，因?yàn)橛^(guān)察室 的容積是已知的，因此固體物質(zhì)的量會(huì)與實(shí)際樣品的量有關(guān)。一般，樣品量將由期望的顆 粒數(shù)決定，可以為約0. 1到200 μ L。在此實(shí)施例中，入口通常為直徑大約2mm的圓，排氣 口為1.5X 15. 8mm的狹縫，入口室的容積為1. 53 μ L，觀(guān)察室的容積為約90 μ L。觀(guān)察室寬 14. 53mm，長(zhǎng)17. 78mm，高0. 35mm。如果需要也可采用其它尺寸。例如，觀(guān)察室可以是細(xì)長(zhǎng)的， 從而樣品被鋪展在狹長(zhǎng)的區(qū)域上。這可以實(shí)現(xiàn)更好的顆粒分離和簡(jiǎn)化觀(guān)察裝置(例如用于 記錄分離的沉渣的出現(xiàn)的攝像機(jī))的運(yùn)動(dòng)。由此，對(duì)于90yL的樣品，觀(guān)察室可以為約80mm 長(zhǎng)，3. 2mm寬，而非附圖中顯示的大致正方形的觀(guān)察區(qū)。通常，觀(guān)察室的深度是特別重要的， 因?yàn)閷⒛恳暀z查樣品，而鋪展樣品能使限制可見(jiàn)性的顆粒和沉渣分層最小化。在其它實(shí)施 方案中，中間層的厚度可以與頂層和底層的厚度相等或相似，從而觀(guān)察室的容積為約45 μ L 而非90 μ L。通過(guò)淺的觀(guān)察室來(lái)促進(jìn)顆粒和沉渣在頂層和底層表面上的分離。在某些實(shí)施 方案中，將添加染料以幫助區(qū)別不同類(lèi)型的沉渣，例如透明管型和蠟樣管型。同樣重要的是用于將尿樣從入口室向觀(guān)察室傳輸?shù)拿?xì)管通道的尺寸。如 US7, 094，354中所述，毛細(xì)管的尺寸不能太小以至于阻滯顆粒進(jìn)入觀(guān)察室或限制液體傳輸。 因此，最小的毛細(xì)管尺寸應(yīng)當(dāng)不小于約100 μ m。優(yōu)選地，最小尺寸應(yīng)為約130 μ m。此外，還 應(yīng)限制毛細(xì)管的長(zhǎng)度以避免顆粒在毛細(xì)管中分離。在附圖所示的設(shè)計(jì)中，毛細(xì)管是高度等 于中間層20的寬度即0. 35mm (350 μ m)，寬度等于200 μ m的縫。毛細(xì)管的側(cè)壁是中間層20 的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯，上下壁是層10和30的醋酸纖維素。盡管在分配尿樣時(shí)移液管 會(huì)施加一些壓力，但毛細(xì)管應(yīng)當(dāng)提供足以快速輸送尿樣的毛細(xì)管力。因此毛細(xì)管壁將本質(zhì) 上是親水性的。還發(fā)現(xiàn)用于頂層和基體層的優(yōu)選的醋酸纖維素出乎意料地能有效地在觀(guān)察室 中分離尿。在用附圖所示類(lèi)型的載玻片所進(jìn)行的測(cè)試中，所用醋酸纖維素是從Grafix Plastics, Cleveland, Ohio獲得的高性能OC-VLB級(jí)薄膜。如前所述，紅血球或其它顆粒 和沉渣被吸引到醋酸纖維素觀(guān)察室的壁上，其被認(rèn)為具有適于分離和固定紅血球及其它顆 粒和沉渣以便進(jìn)行檢查的表面能。如果選擇其它光學(xué)透明材料，則可能需要通過(guò)本領(lǐng)域技 術(shù)人員所熟知的技術(shù)，如添加適合的涂層，來(lái)調(diào)節(jié)它們的表面能。據(jù)發(fā)現(xiàn)，尿中的顆粒和沉渣具有相似的表面能，當(dāng)附著能與尿和沉渣的相匹配或 比之稍低時(shí)附著在透明的觀(guān)察表面上。這可以用以下公式表示
附著自由能=Y沉渣-表面一 Y沉渣-液體一 Y表面-液體。當(dāng)該自由能為至少零或更低時(shí)發(fā)生附著。在以下情形 Y表面-液體(Y沉渣-表面一 Y沉渣-液體，
其中
Y表面-液體=所述表面的表面能與主體液體的表面能之差； Y沉渣-表面=沉渣及其它顆粒的表面能與所述表面的表面能之差； Y沉渣-液體=沉渣及其它顆粒的表面能與主體液體的表面能之差。無(wú)論是表面與液體、表面與沉渣、還是液體與沉渣，兩相之間的差異取決于各個(gè)相 的表面能(爾格/cm)。測(cè)得的尿的表面能一般為55-58爾格/cm，最大范圍為50-65爾格 /cm。據(jù)發(fā)現(xiàn)，所述尿中的尿沉渣的表面能一般等于尿，因此附著主要取決于Y表面-液體， 且當(dāng)所述表面的表面能大于或等于尿時(shí)是有利的。
因此，據(jù)發(fā)現(xiàn)當(dāng)觀(guān)察表面的表面能(爾格/cm)大于50達(dá)因/cm時(shí)，由細(xì)胞、管型、 晶體及其它顆粒組成的尿沉渣牢牢附著在該觀(guān)察表面上，如以下對(duì)比表中所示
(1)表面能由以水作為參照使用測(cè)角計(jì)測(cè)量的液體接觸角確定。當(dāng)在高倍放大率(例如> IOOx)下觀(guān)察沉渣及其它顆粒時(shí)，它們受布朗運(yùn)動(dòng)影響 且只有牢固附著時(shí)才可對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)臋z查。顯微鏡的分辯率應(yīng)至少為1 μ m，優(yōu)選地能夠 辨別0. 1 μ m大小的顆粒。隨著所述光學(xué)層的表面能的增大和所述光學(xué)層之間距離的減小， 沉渣在附著后變得靜止。令人驚訝的是，隨著所述層的表面能的增大，細(xì)胞在附著時(shí)更不容 易改變其自然形狀。紅血球在強(qiáng)附著條件下尤其不容易將細(xì)胞狀改變到圓鋸齒狀。優(yōu)選沉 渣盡可能處于其自然形狀以便正確分類(lèi)。觀(guān)察區(qū)的大小取決于所用的觀(guān)察裝置，還取決于待檢查的顆粒和沉渣的濃度和大 小。觀(guān)察裝置如顯微鏡一般使用高倍視域(HPF)來(lái)檢查沉渣。400X的放大率能顯示所述室 上 330微米X330微米大小的區(qū)域。當(dāng)頂光學(xué)層與中間光學(xué)層之間的距離為100微米的 毛細(xì)管間隙時(shí)，觀(guān)察的尿體積為0. 011 μ L。尿沉渣的臨床解釋所認(rèn)為的陽(yáng)性結(jié)果是指一般 包含3-5000個(gè)沉渣對(duì)象的HRP。用分離的圖象測(cè)量多個(gè)HRP，以提供充分的取樣。HRP數(shù)通 常為俘獲10-100個(gè)圖象以使0. 1-10 μ L的樣品量被測(cè)量?？赏ㄟ^(guò)自動(dòng)化掃描階段來(lái)測(cè)量 多個(gè)圖象，其使得能夠覆蓋分布在觀(guān)察區(qū)不同位置的許多HPF。觀(guān)察的尺寸和形狀必須充分 自由以包含待測(cè)圖象的數(shù)量。圖象以易于被觀(guān)察裝置測(cè)量的模式以最小的重疊和范圍誤差 排列。實(shí)施例顯示了特別有用的樣品尺寸。所述多個(gè)圖象可以小于樣品尺寸。應(yīng)當(dāng)注意， 盡管所示淺室深的觀(guān)察室基本為正方形或長(zhǎng)方形，但其它尺寸和形狀也是可以的。通常，樣 品觀(guān)察室為正方形、橢圓形、圓形或長(zhǎng)方形，俘獲的圖象為正方形或矩形圖像，但不排除其 它形狀。上述的本發(fā)明的載玻片適用于適合接受和檢查這種載玻片的自動(dòng)化儀器。這種儀 器通常能夠定位載玻片和將光學(xué)系統(tǒng)聚焦在各個(gè)觀(guān)察室上。本發(fā)明的載玻片還可以使用具 有適合放大倍數(shù)的顯微鏡手動(dòng)地檢查。用于光學(xué)層的材料可包括親水性的玻璃和塑料。這些材料便宜、光學(xué)透明、平坦且 不彎曲，極為適合底層。據(jù)發(fā)現(xiàn)，如果提供足夠的時(shí)間來(lái)達(dá)到靜態(tài)平衡，細(xì)胞和尿沉渣會(huì)在 任何離心力下主要附著到底層。優(yōu)選達(dá)到靜態(tài)平衡的時(shí)間盡可能短(<3分鐘)以使系統(tǒng)能 夠快速完成分析。當(dāng)層的表面能增大或?qū)娱g的毛細(xì)管間隙減小時(shí)，所有尿沉渣附著到底層 上的時(shí)間(到達(dá)靜態(tài)平衡的時(shí)間)縮短，如以下對(duì)比表中所示
權(quán)利要求
1.用于目視檢查尿樣顆粒和沉渣的樣品載玻片，包括(a)光學(xué)透明材料的基體層；(b)包含至少一組構(gòu)成測(cè)試位置的切口的中間層，所述切口形成至少一個(gè)用于接收尿 樣的入口室、至少一個(gè)觀(guān)察室和至少一個(gè)在所述入口室與所述觀(guān)察室之間流體連通的親水 性的毛細(xì)管通道；(c)光學(xué)透明材料的頂層，所述頂層包含構(gòu)成用于向所述入口室中引入所述尿樣和用 于從所述觀(guān)察室中排出空氣的開(kāi)口的切口 ；其中(a)和(c)的所述光學(xué)透明材料具有相對(duì)于所述尿樣的表面能使得在所述光學(xué)透 明材料表面上分離和固定所述顆粒和沉渣的表面能。
2.權(quán)利要求1的樣品載玻片，其中所述光學(xué)透明材料具有至少50達(dá)因/cm的表面能。
3.權(quán)利要求2的樣品載玻片，其中(a)和(c)的所述光學(xué)透明材料為醋酸纖維素。
4.權(quán)利要求1的樣品載玻片，其中所述中間層由聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯制成。
5.權(quán)利要求1的樣品載玻片，其中所述中間層(b)通過(guò)雙面膠帶粘合和密封到所述頂 層(a)和所述底層(c)上。
6.權(quán)利要求1的樣品載玻片，包含25組構(gòu)成一組測(cè)試位置的切口。
7.權(quán)利要求1的樣品載玻片，其中所述樣品為約2-200μL。
8.權(quán)利要求1的樣品載玻片，其中所述中間層的厚度為約0.100-0. 35mm，所述頂層的 厚度使得能提供至少0. 9mm的工作距離。
9.權(quán)利要求1的樣品載玻片，其中所述毛細(xì)管通道尺寸不小于ΙΟΟμπι。
10.權(quán)利要求1的樣品載玻片，其中所述觀(guān)察室的容積為約0.1-200 μ L0
11.目視檢查尿樣顆粒和沉渣的方法，包括(a)獲得尿樣；(b)將所述(a)的樣品引入樣品載玻片中；和(c)檢查所述樣品載玻片中的所述(a)的樣品；其中所述樣品載玻片包括相對(duì)于所述尿樣的表面能具有高表面能的光學(xué)透明材料的 基體層；包含至少一組構(gòu)成測(cè)試位置的切口的中間層，所述切口構(gòu)成至少一個(gè)用于接收所 述尿樣的入口室、至少一個(gè)觀(guān)察室和至少一個(gè)在所述入口室與所述觀(guān)察室之間流體連通的 親水性的毛細(xì)管通道；和所述光學(xué)透明材料的頂層；所述頂層包含構(gòu)成用于向所述入口室 中弓丨入所述尿樣和用于從所述觀(guān)察室中排出空氣的開(kāi)口的切口。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述光學(xué)透明材料具有約38-50達(dá)因/cm的表面能。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述光學(xué)透明材料為醋酸纖維素。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述中間層由聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯制成。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述中間層通過(guò)雙面膠帶粘合和密封到所述頂層和所 述基體層上。
16.權(quán)利要求11的方法，其中所述載玻片包含25組切口。
17.權(quán)利要求11的方法，其中所述顆粒和沉渣被固定在所述光學(xué)透明的頂層和底層 的表面上。
全文摘要
借助于由三個(gè)層構(gòu)成的包含封閉的觀(guān)察室的載玻片進(jìn)行了尿樣的目視分析，其中所述觀(guān)察室接收由移液管移入載玻片外層上的開(kāi)口中的尿樣。樣品從所述入口開(kāi)口進(jìn)入中間層中的入口室并穿過(guò)毛細(xì)管通道進(jìn)入觀(guān)察室，在觀(guān)察室中進(jìn)行顆粒和沉渣檢查。
文檔編號(hào)C02F1/44GK102131737SQ200980132188
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2009年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月21日
發(fā)明者H·盧, M·J·普吉亞 申請(qǐng)人:西門(mén)子醫(yī)療保健診斷公司