專(zhuān)利名稱：一種玉米秸稈制備土壤復(fù)合生物修復(fù)劑的制備方法及其在改良土壤土質(zhì)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種玉米秸桿制備土壤復(fù)合生物修復(fù)劑的制備方法及其在改良土壤土質(zhì)中的應(yīng)用，屬于生物制備方法及降解技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于溫室大棚栽培中設(shè)施的不易遷移性，農(nóng)作物經(jīng)常在棚內(nèi)重茬種植，土壤中土傳病原菌大量滋生繁殖，引發(fā)植物病害。而病害的頻繁發(fā)生，又促使農(nóng)民用藥次數(shù)增加，導(dǎo)致土壤中農(nóng)藥殘留升高，形成惡性循環(huán)。以溫室大棚蔬菜為例，我們通過(guò)對(duì)棚內(nèi)和棚外土壤生物檢測(cè)得到棚內(nèi)土壤中多菌靈的殘留量高達(dá)9. 6!1^/1^干土，是棚外的6.7倍，病原菌落數(shù)達(dá)到3. 9 X IO5個(gè)/g干土，是棚外土壤的3倍。而棚內(nèi)土壤中的微生物數(shù)量卻大幅減少 真菌數(shù)減少了 2倍，細(xì)菌數(shù)減少了 7. 8倍，放線菌減少了 5倍?？梢?jiàn)農(nóng)藥殘留和病原菌的大量存在，破壞了土壤生態(tài)平衡。另外，土壤中大量化學(xué)殺菌劑的存在，也可以殺滅或抑制生防木霉T22的生長(zhǎng)繁殖，影響其防治土傳性病害的效果。因此，須采用藥物馴化和紫外線重復(fù)誘導(dǎo)相結(jié)合方法， 對(duì)生防木霉T22進(jìn)行人工選育和改良，使其具有抗藥性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述缺陷，目的在于提供一種對(duì)土壤中土傳病原菌具有良好殺滅或抑制作用、對(duì)農(nóng)藥殘留具有良好降解作用的土壤復(fù)合生物修復(fù)劑及其制備方法，
為此本發(fā)明采用的技術(shù)方案是本發(fā)明按以下工藝步驟進(jìn)行
1)原料加工選擇無(wú)霉變的玉米秸桿、麩皮混合物粉碎至30-40目備用；
2)液體培養(yǎng)其培養(yǎng)基成分包括土豆浸出液8-10ml,(NH4) 2S04 O. 2-0. 4g、K2HPO4 O. 2-0. 3g,CaCO3 lg，補(bǔ)加水至100ml，調(diào)整PH值至6-6. 5，高壓滅菌20_30min，待物料冷卻后分別接入已活化好的木霉菌種T8-2和T22，并于25-28°C、180-200轉(zhuǎn)/min震蕩培養(yǎng)，直至用分光光度計(jì)測(cè)量0D_值達(dá)到O. 30-0. 35時(shí)停止液體發(fā)酵，兩發(fā)酵液作為種子液備用；
3)固體培養(yǎng)取粉碎好的玉米秸桿粉8-10g和麩皮粉2-3g、葡萄糖O.8-0. 9g、(NH4) 2S040. 2-0. 4g、KH2PO4O. 1-0. 2g、MgSO4 · 7H200. 08-0. lg，水 100ml ;其發(fā)酵方法為先用水把上述葡萄糖和無(wú)機(jī)鹽溶解后，再與玉米秸桿粉、麩皮粉攪拌均勻，然后調(diào)節(jié)PH值至5-5. 5， 高壓滅菌25-30min，冷卻后分別接入上述T8-2種子液100_130ml、T22種子液100_130ml， 并攪拌均勻，然后放在25-28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)80-90小時(shí)，然后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量固體發(fā)酵物的分生孢子產(chǎn)量達(dá)到IOltVg個(gè)后，常溫風(fēng)干或在溫度40-45°C的環(huán)境中干燥備用。降解菌T8-2的篩選方法如下
在IOOmL含多菌靈濃度為200mg/L的富集培養(yǎng)液中加入8_10g長(zhǎng)期受多菌靈污染的土樣，于20-30°C、180-220r/min振蕩培養(yǎng)2_4d，吸取4_6mL轉(zhuǎn)接至多菌靈濃度為400mg/ L富集培養(yǎng)液中，培養(yǎng)2-4d，依次連續(xù)富集，轉(zhuǎn)接4次，使多菌靈濃度依次為200、400、500、600和800mg/L。富集完畢后，取培養(yǎng)液均勻涂布于相同濃度的多菌靈分離純化培養(yǎng)基上， 20-30°C恒溫培養(yǎng)，待平板上出現(xiàn)單菌落后，挑取較大單菌落轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上，20-30°C 恒溫培養(yǎng)，反復(fù)純化后備用。土樣取自江蘇靖江農(nóng)藥廠附近被多菌靈長(zhǎng)期污染的土壤
富集培養(yǎng)基(g/L) =K2HPO4 5. 71，KH2PO4 I. 70，(NH4)2SO4 2. 63，MgSO4 · 7H20 O. 095， MnSO4 O. 05, FeSO4 O. 05，CaCl2 O. 003，加水至 1L，ρΗ=7· O。分離培養(yǎng)基(g/L):富集培養(yǎng)基加2%瓊脂。
PDA培養(yǎng)基(g/L) :土豆200. 0，葡萄糖20. 0，瓊脂18. O,水IL0抗藥性生防菌株T22的選育方法如下通過(guò)藥物馴化和紫外線重復(fù)誘導(dǎo)相結(jié)合方法，對(duì)生防木霉T22進(jìn)行改良，具體方法如下
在接種生防木霉T22，并于20-30°C恒溫培養(yǎng)4-6d的PDA板上，加入少量無(wú)菌水，輕輕洗刷綠色分生孢子，制成IO7個(gè)/mL孢子懸浮液；在含多菌靈10mg/L的PDA培養(yǎng)基上涂抹 O. ImL上述孢子懸浮液，去蓋后在18-22w、波長(zhǎng)230_270nm的紫外燈管下28_32cm處，避光照射75-85min后，立即用黑紙包好，放入25_28°C恒溫箱中培養(yǎng)；選取生長(zhǎng)迅速的變異菌株轉(zhuǎn)接到含多菌靈10mg/L PDA上培養(yǎng)，待產(chǎn)生大量綠色分生孢子后，再按上述方法配制孢子懸浮液，涂抹在含多菌靈20mg/L的PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行第二次紫外線重復(fù)誘導(dǎo)處理；依此類(lèi)推，逐步提高多菌靈濃度達(dá)到1000mg/L，獲得抗藥性變異菌株；
所述PDA培養(yǎng)基土豆180-220g，葡萄糖18_22g，水IOOOmL, pH自然;
含多菌靈培養(yǎng)基把上述PDA培養(yǎng)基熔化后，按要求加入一定量多菌靈粉劑混合均勻后倒入平板制得。如以每畝地為單位，取修復(fù)劑80_100kg、30-40目的玉米秸桿粉100kg、水 20-30kg,將上述組分混合均勻后施入土壤內(nèi)。以土壤量為基準(zhǔn)在含水量為13-15%的土壤內(nèi)加入0. 3-0. 5g/kg的修復(fù)劑，加入 100-110mg/kg農(nóng)藥,進(jìn)行對(duì)土壤內(nèi)農(nóng)藥的降解；所述農(nóng)藥為多菌靈、速克靈、甲基托布津、 撲海因中的一種或多種混合物；其處理時(shí)間10-12天。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明采用了廉價(jià)、可再生的玉米秸桿為原料，分別以處理過(guò)的木霉T22、T8-2為菌種，通過(guò)液固兩項(xiàng)混菌發(fā)酵工藝制備成土壤復(fù)合生物修復(fù)劑。該復(fù)合菌劑具有如下特點(diǎn)(I)可與糞肥一起、或單獨(dú)均勻施入土壤內(nèi)，對(duì)土壤中的殘留多菌靈、速克靈、甲基托布津、撲海因等多種化學(xué)農(nóng)藥殘留有顯著的降解效果，降解率達(dá)40-70%左右， 可使生廣的蔬菜等農(nóng)廣品有害殘留大幅降低，達(dá)到綠色食品標(biāo)準(zhǔn)；(2)對(duì)灰匍萄抱菌、鍵刀菌等土傳病原菌均有良好抑制作用，可防治農(nóng)作物的常見(jiàn)病灰霉病、白粉病和枯萎病等病害，防治效果達(dá)55-70% ；(3)能增加土壤中有益微生物的數(shù)量，改善土壤的微生態(tài)環(huán)境，同時(shí)，還能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，可使農(nóng)作物產(chǎn)量曾加15-30%。(4)無(wú)殘留及毒副作用，對(duì)生態(tài)環(huán)境不會(huì)造成任何危害。該復(fù)合生物修復(fù)劑非常適合溫室大棚等保護(hù)地土壤的生物修復(fù)和土傳病害防治。由于保護(hù)地栽培中設(shè)施的不易遷移性，農(nóng)作物經(jīng)常重茬種植，土壤中土傳病原菌大量滋生繁殖，引發(fā)植物病害。而病害的頻繁發(fā)生，又促使農(nóng)民用藥次數(shù)增加，導(dǎo)致土壤中農(nóng)藥殘留升高，形成惡性循環(huán)。該復(fù)合菌劑既可解決保護(hù)地土壤栽培中農(nóng)作物的農(nóng)藥殘留超標(biāo)問(wèn)題，還可以防治植物土傳性病害，提高該菌劑的使用效率。同時(shí)，因能促進(jìn)有益微生物生長(zhǎng)繁殖，改善了生態(tài)環(huán)境。
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另外，未被發(fā)酵利用的秸桿粉隨菌劑施入土壤中，可以起到如下作用一、秸桿粉的加入，使被修復(fù)的土壤變得松軟、透氣，提高了土壤的溶氧量，從而促進(jìn)了木霉T22生防效果和T8-2的酶促降解性能；二、木霉T22和T8-2菌株均能代謝產(chǎn)生纖維素酶，而纖維素酶又可以進(jìn)一步分解秸桿中的纖維素或半纖維素，使之產(chǎn)生葡萄糖等小分子有機(jī)物質(zhì)。這些有機(jī)物既可為T(mén)22和T8-2在土壤中的定殖和繁殖提供營(yíng)養(yǎng)和能源，又可激活土著微生物的降解活性，提高土壤降解效果，為植物提供營(yíng)養(yǎng)，增加作物產(chǎn)量。也就是說(shuō)，秸桿粉成為共代謝底物，為土壤的生物降解提供了碳源和能源，并激活土著微生物，起到了降解菌T8-2 和土著微生物協(xié)同降解的效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :
本發(fā)明按以下工藝步驟進(jìn)行
O原料加工選擇無(wú)霉變的玉米秸桿、麩皮混合物粉碎至30目備用；
2)液體培養(yǎng)其培養(yǎng)基成分包括土豆浸出液8ml、(NH4)2S040 . 4g、K2HPO4O. 3g、CaCO3Ig, 補(bǔ)加水至100ml，調(diào)整PH值至6，高壓滅菌30min，待物料冷卻后分別接入已活化好的木霉菌種T8-2和T22，并于25°C、180轉(zhuǎn)/min震蕩培養(yǎng)，直至用分光光度計(jì)測(cè)量0D_值達(dá)到O. 35 時(shí)停止液體發(fā)酵，兩發(fā)酵液作為種子液備用；
3)固體培養(yǎng)取粉碎好的玉米秸桿粉Sg和麩皮粉2g、葡萄糖O.9g、(NH4) 2S040 . 4g、 KH2PO4O. 2g、MgSO4 · 7H200. Ig^K 100ml ;其發(fā)酵方法為先用水把上述葡萄糖和無(wú)機(jī)鹽溶解后，再與玉米秸桿粉、麩皮粉攪拌均勻，然后調(diào)節(jié)PH值至5，高壓滅菌30min，冷卻后分別接入上述T8-2種子液130ml、T22種子液130ml，并攪拌均勻，然后放在25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90小時(shí)，然后測(cè)量固體發(fā)酵物的產(chǎn)孢量達(dá)到IOltVg個(gè)后，常溫風(fēng)干或在溫度40°C的環(huán)境中干燥備用。T8-2菌株其篩選方法如下
在IOOmL含多菌靈濃度為200mg/L的富集培養(yǎng)液中分別加入8g 土樣，30°C、220r/min 振蕩培養(yǎng)2d，吸取6mL轉(zhuǎn)接至多菌靈濃度為400mg/L富集培養(yǎng)液中，培養(yǎng)4d，依次連續(xù)富集，轉(zhuǎn)接4次，使多菌靈濃度依次為200、400、500、600和800mg/L。富集完畢后，取培養(yǎng)液均勻涂布于相同濃度的多菌靈分離純化培養(yǎng)基上，20°C恒溫培養(yǎng)，待平板上出現(xiàn)單菌落后， 挑取較大單菌落轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上，20°C恒溫培養(yǎng)，反復(fù)純化至純培養(yǎng)后備用。土樣取自江蘇靖江農(nóng)藥廠附近被多菌靈長(zhǎng)期污染的土壤
富集培養(yǎng)基(g/L) =K2HPO4 5. 71，KH2PO4 I. 70，(NH4)2SO4 2. 63，MgSO4 · 7H20 O. 095， MnSO4 O. 05, FeSO4 O. 05，CaCl2 O. 003，加水至 1L，ρΗ=7· O。分離培養(yǎng)基(g/L):富集培養(yǎng)基加2%瓊脂。
PDA培養(yǎng)基(g/L) :土豆200. 0，葡萄糖20. 0，瓊脂18. O,水IL0抗藥性T22菌株選育方法如下通過(guò)藥物馴化和紫外線重復(fù)誘導(dǎo)相結(jié)合方法，對(duì)生防木霉T22進(jìn)行改良，具體方法如下
在接種生防木霉T22，并于30°C恒溫培養(yǎng)4d的PDA板上，加入無(wú)菌水，輕輕洗刷綠色分生孢子，制成IO7個(gè)/mL孢子懸浮液；在含多菌靈10mg/L的PDA培養(yǎng)基上涂抹O. ImL上述孢子懸浮液去蓋在18w、波長(zhǎng)270nm的紫外燈管下28cm處，避光照射75min后，立即用黑紙包好，放入28°C恒溫箱中培養(yǎng)，選取生長(zhǎng)迅速的變異木霉菌株，轉(zhuǎn)接到含多菌靈IOmg/ L的PDA培養(yǎng)基，待產(chǎn)生大量綠色分生孢子后，再按上述方法配制孢子懸浮液，涂抹在含多菌靈20mg/L的PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行第二次紫外線重復(fù)誘導(dǎo)處理；依此類(lèi)推，逐步提高多菌靈濃度達(dá)到1000mg/L，獲得抗藥性變異菌株；
所述PDA培養(yǎng)基土豆180g，葡萄糖22g，水IOOOmL, pH自然；
含多菌靈培養(yǎng)基把上述PDA培養(yǎng)基熔化后，按要求加入一定量多菌靈粉劑混合均勻后倒入平板制得
本發(fā)明所述的修復(fù)劑在土壤處理中的應(yīng)用，其以每畝地為單位，取修復(fù)劑80kg、30目的玉米秸桿粉100kg、水20kg，將上述組分混合均勻后施入土壤內(nèi)。本發(fā)明所述的修復(fù)劑降解土壤內(nèi)殘留農(nóng)藥的應(yīng)用，以土壤量為基準(zhǔn)在含水量為 13%的土壤內(nèi)加入O. 3g/kg的修復(fù)劑,加入100mg/kg農(nóng)藥,進(jìn)行對(duì)土壤內(nèi)農(nóng)藥的降解。本發(fā)明所述的修復(fù)劑降解土壤內(nèi)殘留農(nóng)藥的應(yīng)用，所述農(nóng)藥為多菌靈、速克靈、甲基托布津、撲海因中的一種或多種混合物。本發(fā)明所述的修復(fù)劑降解土壤內(nèi)殘留農(nóng)藥的應(yīng)用，其處理時(shí)間12天。實(shí)施例2:
本發(fā)明按以下工藝步驟進(jìn)行
O原料加工選擇無(wú)霉變的玉米秸桿、麩皮混合物粉碎至40目備用；
2)液體培養(yǎng)其培養(yǎng)基成分包括土豆浸出液10ml、(NH4)2S040·2g、K2HP040. 2g、CaC03lg， 補(bǔ)加水至100ml，調(diào)整PH值至6. 5，高壓滅菌20min，待物料冷卻后分別接入已活化好的木霉菌種T8-2和T22，并于25°C、200轉(zhuǎn)/min震蕩培養(yǎng)，直至用分光光度計(jì)測(cè)量0D_值達(dá)到 0. 30時(shí)停止液體發(fā)酵,兩發(fā)酵液作為種子液備用；
3)固體培養(yǎng)取粉碎好的玉米秸桿粉IOg和麩皮粉3g、葡萄糖0.9g、(NH4) 2S040. 2g、 KH2PO4O. lg、MgSO4 · 7H200. 08g，水100ml ;其發(fā)酵方法為先用水把上述葡萄糖和無(wú)機(jī)鹽溶解后，再與玉米秸桿粉、麩皮粉攪拌均勻，然后調(diào)節(jié)PH值至5. 5，高壓滅菌25min，冷卻后分別接入上述T8-2種子液100-130ml、T22種子液100ml，并攪拌均勻，然后放在28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)80小時(shí)，然后測(cè)量固體發(fā)酵物的產(chǎn)孢量達(dá)到IOltVg后，常溫風(fēng)干或在溫度45°C 的環(huán)境中干燥備用。T8-2菌株其篩選方法如下
在IOOmL含多菌靈濃度為200mg/L的富集培養(yǎng)液中分別加入12g 土樣，20°C、180r/ min振蕩培養(yǎng)4d，吸取4mL轉(zhuǎn)接至多菌靈濃度為400mg/L富集培養(yǎng)液中，培養(yǎng)2d，依次連續(xù)富集，轉(zhuǎn)接4次，使多菌靈濃度依次為200、400、500、600和800mg/L。富集完畢后，取培養(yǎng)液均勻涂布于相同濃度的多菌靈分離純化培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)，待平板上出現(xiàn)單菌落后，挑取較大單菌落轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng),反復(fù)純化至純培養(yǎng)后備用。土樣取自江蘇靖江農(nóng)藥廠附近被多菌靈長(zhǎng)期污染的土壤
富集培養(yǎng)基(g/L) =K2HPO4 5. 71，KH2PO4 I. 70，(NH4)2SO4 2. 63，MgSO4 · 7H20 O. 095， MnSO4 0.05, FeSO4 O. 05，CaCl2 O. 003，加水至 1L，ρΗ=7· O。分離培養(yǎng)基(g/L):富集培養(yǎng)基加2%瓊脂。
PDA培養(yǎng)基(g/L) :土豆200. 0，葡萄糖20. 0，瓊脂18. O,水IL0抗藥性T22菌株選育方法如下通過(guò)藥物馴化和紫外線重復(fù)誘導(dǎo)相結(jié)合方法,對(duì)生防木霉T22進(jìn)行改良，具體方法如下
在接種生防菌T22，并于20°C恒溫培養(yǎng)4-6d的PDA板上，加入無(wú)菌水，輕輕洗刷綠色分生孢子，制成IO7個(gè)/mL孢子懸浮液；在含多菌靈10mg/L的PDA培養(yǎng)基上涂抹O. ImL上述孢子懸浮液去蓋在22w、波長(zhǎng)230nm的紫外燈管下32cm處，避光照射85min后，立即用黑紙包好，放入22°C恒溫箱中培養(yǎng)，選取生長(zhǎng)迅速的變異木霉菌株，并將其轉(zhuǎn)接到含多菌靈 10mg/L PDA上培養(yǎng)，待產(chǎn)生大量綠色分生孢子后，再按上述方法配制孢子懸浮液，涂抹在含多菌靈20mg/L的PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行第二次紫外線重復(fù)誘導(dǎo)處理；依此類(lèi)推，逐步提高多菌靈濃度達(dá)到1000mg/L，獲得抗藥性變異菌株；
所述PDA培養(yǎng)基:土豆180g,葡萄糖18g,水IOOOmL, pH自然;
含多菌靈培養(yǎng)基把上述PDA培養(yǎng)基熔化后，按要求加入一定量多菌靈粉劑混合均勻后倒入平板制得。本發(fā)明所述的修復(fù)劑在土壤處理中的應(yīng)用，其以每畝地為單位，取修復(fù)劑100kg、 40目的玉米秸桿粉100kg、水30kg，將上述組分混合均勻后施入土壤內(nèi)。本發(fā)明所述的修復(fù)劑降解土壤內(nèi)殘留農(nóng)藥的應(yīng)用，以土壤量為基準(zhǔn)在含水量為 15%的土壤內(nèi)加入0. 5g/kg的修復(fù)劑,加入110mg/kg農(nóng)藥,進(jìn)行對(duì)土壤內(nèi)農(nóng)藥的降解。本發(fā)明所述的修復(fù)劑降解土壤內(nèi)殘留農(nóng)藥的應(yīng)用，所述農(nóng)藥為多菌靈、速克靈、甲基托布津、撲海因中的一種或多種混合物。本發(fā)明所述的修復(fù)劑降解土壤內(nèi)殘留農(nóng)藥的應(yīng)用，其處理時(shí)間10天。實(shí)施例3
本發(fā)明按以下工藝步驟進(jìn)行
O原料加工選擇無(wú)霉變的玉米秸桿、麩皮混合物粉碎至35目備用；
2)液體培養(yǎng)其培養(yǎng)基成分包括土豆浸出液9ml、(NH4)2SO4O.3g、K2HP040. 25g、CaC03lg， 補(bǔ)加水至100ml，調(diào)整PH值至6. 2，高壓滅菌25min，待物料冷卻后分別接入已活化好的木霉菌種T8-2和T22，并于25-28°C、190轉(zhuǎn)/min震蕩培養(yǎng)，直至用分光光度計(jì)測(cè)量OD6tltl值達(dá)到 0. 32時(shí)停止液體發(fā)酵，兩發(fā)酵液作為種子液備用；
3)固體培養(yǎng)取粉碎好的玉米秸桿粉9g和麩皮粉2.5g、葡萄糖0. 85g、(NH4)2SO4O. 3g、 KH2PO4O. 15g、MgSO4 · 7H200. 09g，水100ml ;其發(fā)酵方法為先用水把上述葡萄糖和無(wú)機(jī)鹽溶解后，再與玉米秸桿粉、麩皮粉攪拌均勻，然后調(diào)節(jié)PH值至5. 2，高壓滅菌28min，冷卻后分別接入上述T8-2種子液120ml、T22種子液120ml，并攪拌均勻，然后放在27°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)85小時(shí)，然后測(cè)量固體發(fā)酵物的產(chǎn)孢量達(dá)到IOltVg后，常溫風(fēng)干或在溫度42°C的環(huán)境中干燥備用。T8-2菌株其篩選方法如下
在IOOmL含多菌靈濃度為200mg/L的富集培養(yǎng)液中分別加入IOg 土樣，25°C、200r/min 振蕩培養(yǎng)3d，吸取5mL轉(zhuǎn)接至多菌靈濃度為400mg/L富集培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3d，依次連續(xù)富集，轉(zhuǎn)接4次，使多菌靈濃度依次為200、400、500、600和800mg/L。富集完畢后，取培養(yǎng)液均勻涂布于相同濃度的多菌靈分離純化培養(yǎng)基上，25°C恒溫培養(yǎng)，待平板上出現(xiàn)單菌落后， 挑取較大單菌落轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上，25°C恒溫培養(yǎng)，反復(fù)純化至純培養(yǎng)后備用。土樣取自江蘇靖江農(nóng)藥廠附近被多菌靈長(zhǎng)期污染的土壤
富集培養(yǎng)基(g/L) =K2HPO4 5. 71，KH2PO4 I. 70，(NH4)2SO4 2. 63，MgSO4 · 7H20 O. 095，MnSO4 O. 05, FeSO4 O. 05，CaCl2 O. 003，加水至 1L，ρΗ=7· O。分離培養(yǎng)基(g/L):富集培養(yǎng)基加2%瓊脂。
PDA培養(yǎng)基(g/L) :土豆200. 0，葡萄糖20. 0，瓊脂18. O,水IL0抗藥性T22菌株選育方法如下通過(guò)藥物馴化和紫外線重復(fù)誘導(dǎo)相結(jié)合方法,對(duì)生防木霉T22進(jìn)行改良，具體方法如下
在接種生防木霉T22，并于25°C恒溫培養(yǎng)5d的PDA板上，加入無(wú)菌水，輕輕洗刷綠色分生孢子，制成IO7個(gè)/mL孢子懸浮液；在含多菌靈10mg/L的PDA培養(yǎng)基上涂抹O. ImL上述孢子懸浮液去蓋在20w、波長(zhǎng)253. 7nm的紫外燈管下30cm處，避光照射80min,立即用黑紙包好，放入25°C恒溫箱中培養(yǎng)，選取生長(zhǎng)迅速的變異木霉菌株，接種在含多菌靈IOmg/ L的PDA培養(yǎng)基上，待產(chǎn)生大量綠色分生孢子后，再按上述方法配制孢子懸浮液，涂抹在含多菌靈20mg/L的PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行第二次紫外線重復(fù)誘導(dǎo)處理；依此類(lèi)推，逐步提高多菌靈濃度達(dá)到1000mg/L，獲得抗藥性變異菌株；
所述PDA培養(yǎng)基土豆200g，葡萄糖20g，水IOOOmL, pH自然；
含多菌靈培養(yǎng)基把上述PDA培養(yǎng)基熔化后，按要求加入一定量多菌靈粉劑混合均勻后倒入平板制得。本發(fā)明所述的修復(fù)劑在土壤處理中的應(yīng)用，其以每畝地為單位，取修復(fù)劑90kg、35 目的玉米秸桿粉100kg、水25kg，將上述組分混合均勻后施入土壤內(nèi)。本發(fā)明所述的修復(fù)劑降解土壤內(nèi)殘留農(nóng)藥的應(yīng)用，以土壤量為基準(zhǔn)在含水量為 14%的土壤內(nèi)加入O. 4g/kg的修復(fù)劑,加入105mg/kg農(nóng)藥,進(jìn)行對(duì)土壤內(nèi)農(nóng)藥的降解。本發(fā)明所述的修復(fù)劑降解土壤內(nèi)殘留農(nóng)藥的應(yīng)用，所述農(nóng)藥為多菌靈、速克靈、甲基托布津、撲海因中的一種或多種混合物。本發(fā)明所述的修復(fù)劑降解土壤內(nèi)殘留農(nóng)藥的應(yīng)用，其處理時(shí)間10-12天。
權(quán)利要求
1.一種玉米秸桿制備土壤復(fù)合生物修復(fù)劑的制備方法，其特征在于，按以下工藝步驟進(jìn)行I)原料加工選擇無(wú)霉變的玉米秸桿、麩皮混合物粉碎至30-40目備用；2)液體培養(yǎng)其培養(yǎng)基成分包括土豆浸出液8-10ml、( NH4) 2S04 0 . 2-0 . 4g、K2HPO40.2-0. 3g,CaCO3 lg，補(bǔ)加水至100ml，調(diào)整PH值至6-6. 5，高壓滅菌20_30min，待物料冷卻后分別接入已活化好的木霉菌種T8-2和T22，并于25-28°C、180-200轉(zhuǎn)/min震蕩培養(yǎng)，直至用分光光度計(jì)測(cè)量0D_值達(dá)到0. 30-0. 35時(shí)停止液體發(fā)酵，兩發(fā)酵液作為種子液備用；3)固體培養(yǎng)取粉碎好的玉米秸桿粉8-10g和麩皮粉2-3g、葡萄糖0. 8-0. 9g、(NH4) 2S040. 2-0. 4g、KH2PO4O. 1-0. 2g、MgSO4 7H200. 08-0. lg，水 100ml ;其發(fā)酵方法為先用水把上述葡萄糖和無(wú)機(jī)鹽溶解后，再與玉米秸桿粉、麩皮粉攪拌均勻，然后調(diào)節(jié)PH值至5-5. 5， 高壓滅菌25-30min，冷卻后分別接入上述T8-2種子液100_130ml、T22種子液100_130ml， 并攪拌均勻，然后放在25-28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)80-90小時(shí)，然后用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量固體發(fā)酵物的分生孢子產(chǎn)量達(dá)到IOltVg個(gè)后，常溫風(fēng)干或在溫度40-45°C的環(huán)境中干燥備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種玉米秸桿制備土壤復(fù)合生物修復(fù)劑的制備方法，其特征在于，降解菌T8-2的篩選方法如下在IOOmL含多菌靈濃度為200mg/L的富集培養(yǎng)液中加入8_10g長(zhǎng)期受多菌靈污染的土樣，于20-30°C、180-220r/min振蕩培養(yǎng)2_4d，吸取4_6mL轉(zhuǎn)接至多菌靈濃度為400mg/ L富集培養(yǎng)液中，培養(yǎng)2-4d，依次連續(xù)富集，轉(zhuǎn)接4次，使多菌靈濃度依次為200、400、500、 600和800mg/L ;富集完畢后，取培養(yǎng)液均勻涂布于相同濃度的多菌靈分離純化培養(yǎng)基上， 20-30°C恒溫培養(yǎng)，待平板上出現(xiàn)單菌落后，挑取較大單菌落轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上，20-30°C 恒溫培養(yǎng)，反復(fù)純化后備用；富集培養(yǎng)基(g/L) =K2HPO4 5. 71，KH2PO4 I. 70, (NH4)2SO4 2. 63，MgSO4 7H20 0.095， MnSO4 0. 05，F(xiàn)eSO4 0. 05，CaCl2 0. 003，加水至 1L, pH=7. 0 ；分離培養(yǎng)基(g/L):富集培養(yǎng)基加2%瓊脂；PDA培養(yǎng)基(g/L) :土豆200. 0，葡萄糖20. 0，瓊脂18. 0,水IL0
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種玉米秸桿制備土壤復(fù)合生物修復(fù)劑的制備方法，其特征在于，抗藥性生防菌株T22選育方法如下通過(guò)藥物馴化和紫外線重復(fù)誘導(dǎo)相結(jié)合方法，對(duì)生防木霉T22進(jìn)行改良，具體方法如下在接種生防木霉T22，并于20-30°C恒溫培養(yǎng)4-6d的PDA板上，加入少量無(wú)菌水，輕輕洗刷綠色分生孢子，制成IO7個(gè)/mL孢子懸浮液；在含多菌靈10mg/L的PDA培養(yǎng)基上涂抹0.ImL上述孢子懸浮液，去蓋后在18-22w、波長(zhǎng)230_270nm的紫外燈管下28_32cm處，避光照射75-85min后，立即用黑紙包好，放入25_28°C恒溫箱中培養(yǎng)；選取生長(zhǎng)迅速的變異菌株轉(zhuǎn)接到含多菌靈10mg/L PDA上培養(yǎng)，待產(chǎn)生大量綠色分生孢子后，再按上述方法配制孢子懸浮液，涂抹在含多菌靈20mg/L的PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行第二次紫外線重復(fù)誘導(dǎo)處理；依此類(lèi)推，逐步提高多菌靈濃度達(dá)到1000mg/L，獲得抗藥性變異菌株；PDA 培養(yǎng)基土豆 180-220g，葡萄糖 18-22g，水 IOOOmL, pH 自然;含多菌靈培養(yǎng)基把上述PDA培養(yǎng)基熔化后，按要求加入一定量多菌靈粉劑混合均勻后倒入平板制得。
4.一種利用權(quán)利要求I或2或3所述的修復(fù)劑在土壤處理中的應(yīng)用，其特征在于，以每畝地為單位，取修復(fù)劑80-100kg、30-40目的玉米秸桿粉100kg、水20-30kg，將上述組分混合均勻后施入土壤內(nèi)。
5.一種利用權(quán)利要求I或2或3所述的修復(fù)劑降解土壤內(nèi)殘留農(nóng)藥的應(yīng)用，其特征在于，以土壤量為基準(zhǔn)在含水量為13-15%的土壤內(nèi)加入0. 3-0. 5g/kg的修復(fù)劑，加入 100-110mg/kg農(nóng)藥,進(jìn)行對(duì)土壤內(nèi)農(nóng)藥的降解。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的修復(fù)劑降解土壤內(nèi)殘留農(nóng)藥的應(yīng)用，其特征在于，所述農(nóng)藥為多菌靈、速克靈、甲基托布津、撲海因中的一種或多種混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的修復(fù)劑降解土壤內(nèi)殘留農(nóng)藥的應(yīng)用，其特征在于，其處理時(shí)間10-12天，降解率達(dá)40-70%左右。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種玉米秸稈制備土壤復(fù)合生物修復(fù)劑的制備方法及其在改良土壤土質(zhì)中的應(yīng)用。本發(fā)明采用了廉價(jià)、可再生的玉米秸稈為原料，分別以處理過(guò)的木霉T22、T8-2為菌種，通過(guò)液固兩項(xiàng)混菌發(fā)酵工藝制備成土壤復(fù)合生物修復(fù)劑。該修復(fù)劑對(duì)土壤具有良好修復(fù)作用、對(duì)土壤中的農(nóng)藥殘留具有良好降解效果、對(duì)土傳性病原菌具有很強(qiáng)的抑制或殺滅、對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,對(duì)生態(tài)環(huán)境無(wú)害。
文檔編號(hào)B09C1/10GK102580996SQ201210011948
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者張新科, 曹雨平, 王武林, 田連生, 秦建華, 陳菲 申請(qǐng)人:揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院