專利名稱：一株對砷具有耐受性的硫酸鹽還原菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種硫酸鹽還原菌，屬于環(huán)境微生物領域。
背景技術：
硫酸鹽還原菌(sulfate reducing bacteria, SRB)是以有機化合物或無機化合物為電子供體，還原硫酸鹽產生硫化物的一類原核微生物具有多樣的系統(tǒng)發(fā)育分支和生理學特性。硫酸鹽還原菌在厭氧條件下通過異化硫酸鹽還原作用產生硫化物，這一過程會消耗溶液中的硫酸根，可以用于處理硫酸鹽廢水；硫酸鹽還原菌細胞表面的負電性和分泌的胞外物對重金屬離子有較強的靜電吸附和生物絮凝作用；其代謝硫酸根離子的同時會消耗氫離子，降低溶液酸度，可使金屬離子形成氫氧化物沉淀，代謝產生大量的硫化物能與重金屬陽離子結合，形成不溶性的金屬硫化物沉淀，從而降低水體中的游離的金屬濃度。硫酸鹽還原菌處理廢水適用性較強、價格低廉、處理效果較好、無二次污染，一直以來被廣泛用于硫酸鹽廢水，重金屬工業(yè)廢水和酸性礦山廢水的治理并得到較好的發(fā)展，處理菌種從原來的單一硫酸鹽還原菌發(fā)展到復合硫酸鹽還原菌，工藝由分批沉淀發(fā)展到厭氧污泥床、流化床工藝和固定化工藝等。砷是自然界中普遍存在的一種劇毒元素，近年來，人為活動的影響導致大量的砷釋放到環(huán)境中，造成了世界上近百個國家都有地下水砷超標，而亞洲是砷污染最為嚴重的地區(qū)，砷污染是我國乃至全球極具關注的環(huán)境問題。因為大部分礦石中有伴生元素存在，所以金屬開采及冶煉過程排放的廢水中一般都含有銅、汞、鎘、鉛、鋅、砷以及硫酸鹽和硝酸鹽等。如一種典型的金礦生物浸出液中含有高達10g/L的砷和20g/L的鐵，對于這種酸性含砷廢水常采用的是入加石灰的工藝，硫酸根離子轉變成石膏，砷與氫氧化鐵共沉淀得以去除，這種化學處理工藝去除砷的效率低并產生大量的固體廢棄物，處理固廢容易造成二次污染，現在人們普遍認為利用硫酸鹽還原菌代謝產生的硫化氫與砷反應使得砷以雌黃(As2S3)沉淀的形式從溶液中去除是一種高效且無二次污染的工藝。但廢水中高濃度的砷對微生物具有很強的毒性作用，因此為了保證硫酸鹽還原菌處理法對含砷廢水的處理能力，就需要在高濃度砷下仍具有較高的生長代謝活性的硫酸鹽還原菌菌株。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一株對砷具有耐受性的硫酸鹽還原菌，為硫酸鹽還原菌處理砷廢水工藝提供菌種來源。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下—株對砷具有耐受性的硫酸鹽還原菌,其分類命名為腸桿菌(Enterobacter sp.)taihuN3,該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC),保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏日期為2012年
11月23日，保藏編號為CGMCC No. 6886。該菌株是發(fā)明人于2011年10月從太湖貢湖灣湖 底沉積物中分離得到。
上述對砷具有耐受性的硫酸鹽還原菌為革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，長為1. 7-3. 3 μ m，寬為O. 5-0. 7 μ m,生長代謝產生的硫化氫與固體培養(yǎng)基上的Fe2+使菌落呈黑色，圓形，邊緣整齊，直徑f 3mm。上述對砷具有耐受性的硫酸鹽還原菌對不同的碳源利用能力不同，它能以甲醇、乙醇、乳酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、葡萄糖、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、蔗糖為唯一碳源生長，其中以乳酸為碳源時，硫酸鹽還原效率最聞。上述對砷具有耐受性的 硫酸鹽還原菌，其16SrRNA基因上有效長度約為1500kb的核苷酸序列(GenBank中的序列登錄號為JX847659)，將該序列輸入GenBank，用Blast軟件與數據庫序列進行比對分析，結果表明與Enterobacter cloacae的16S rDNA序列相似性較高，為99%?；?6S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結果以及生理生化特性，鑒定為腸桿菌屬(Enterobacter)的一株新菌株。本發(fā)明菌株 Enterobacter sp. taihuN3 的 16S rDNA 序列如SEQ ID No.1所示。上述對砷具有耐受性的硫酸鹽還原菌在廢水處理中的應用。其中，所述的廢水為含砷和硫酸鹽的廢水。有益效果本發(fā)明提供的菌株具有以下優(yōu)點(I)本發(fā)明菌株可利用的碳源范圍廣泛，易于培養(yǎng)。(2)生長代謝活性強，硫酸鹽轉化效率高。(3)本發(fā)明菌株在10-1000mg/LAs (V)濃度下能夠正常生長。(4)本發(fā)明菌株在200mg/LAs (V)下硫酸鹽的還原率達到50%，可用于處理較高濃度的砷廢水，具有良好的應用前景。


圖1為腸桿菌(Enterobacter) taihuN3在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖。圖2為腸桿菌(Enterobacter) taihuN3經革蘭氏染色后電子顯微鏡照片。圖3為腸桿菌(Enterobacter) taihuN3和相近菌株的16S rDNA序列進行同源性比對構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。圖4為腸桿菌(Enterobacter) taihuN3生長曲線和培養(yǎng)體系中硫酸鹽濃度。圖5為腸桿菌(Enterobacter) taihuN3在不同碳源培養(yǎng)基中生長曲線。圖6為腸桿菌(Enterobacter)taihuN3在不同碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)的硫酸鹽濃度曲線。圖7為腸桿菌(Enterobacter) taihuN3在不同濃度As (V)處理下生長曲線。圖8為腸桿菌(Enterobacter )taihuN3不同濃度As (V)處理下的培養(yǎng)液中S042_變化曲線。圖9為腸桿菌(Enterobacter) taihuN3亞硫酸鹽還原酶(DSR)基因PCR擴增產物電泳圖。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。實施例1 :本發(fā)明菌株的分離與鑒定。(I)腸桿菌(Enterobacter) taihuN3 的分離和純化。采用液體培養(yǎng)基以硫酸亞鐵作為指示劑，硫酸鹽還原菌的代謝產物硫化氫可以和亞鐵離子形成墨汁色，作為富集得到有硫酸鹽還原菌菌群的標志。采用有螺旋口塞子的小口徑容器(500ml血清瓶)，分裝一定體積的富集培養(yǎng)基后高壓滅菌。按20%的接種量接種太湖底泥至充滿狀態(tài)，蓋緊蓋于30°C恒溫箱內培養(yǎng)，避光靜置約一周，待富集液的顏色成為墨汁色瓶口處散發(fā)出H2S的臭雞蛋味，即表示富集成功。將富集好的菌液分別采用無菌操作做成不同稀釋度的菌懸液。培養(yǎng)皿經滅菌后無菌倒入一層培養(yǎng)基，待凝固后，分別采取10_5 10_9稀釋度的菌懸液O.1ml在各瓊脂平板上進行涂布。涂布完后，讓菌液滲透五分鐘，揭開培養(yǎng)皿一邊將固體培養(yǎng)基再度倒入。在30°C 的條件下培養(yǎng)5-6天，平板中長出的許多黑色球狀小菌落即為所需菌落(圖1)，挑選合適稀釋度的培皿，各個菌落分離得較開，揭去上層培養(yǎng)基，用牙簽挑取單菌落接入新的液體培養(yǎng)基中。重復進行稀釋涂布、夾層培養(yǎng)、挑選等兩次，即可達到對硫酸鹽還原菌的分離純化，獲得可以鑒定、保存、轉接的純菌株。對分離細菌Enterobacter taihuN3進行制片，革蘭氏染色。鏡檢為革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，長為1. 7-3. 3 μ m，寬為O. 5-0. 7 μ m (圖2)(2)富集與分離培養(yǎng)基。KH2PO4O. 5g, NH4Cl1. 0g, CaCl2 · 2H20 O. lg, Na2SO4L 0g, MgSO 4 · 7H20 2. Og,乳酸鈉(80%) 3. 5ml，酵母浸膏1. 0g，FeSO4 · 7H20 O. 5g，Vc O. lg，巰基乙酸鈉 O. lg，蒸餾水 1000ml,調pH到7. 5左右。上述培養(yǎng)基如制成固體培養(yǎng)基，則添加1. 6%瓊脂。(3) 16S rDNA 的 PCR 擴增與測序。以提取的提取細菌的總DNA為模板，使用16S rDNA的通用引物(27F:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；1492R:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)擴增，PCR 反應體系10 μ I 體系，IOXBuffer 1μ I, dNTP O. 5μ I, Mg2+O. 75 μ 1，引物各 O. 25 μ 1，模板dna O. 25 μ 1，rTaq 0. 0625 μ 1，ddH20 6. 9375 μ I。PCR 擴增條件94°C 4min ；94°C lmin,55°C lmin,72°C1. 5min，30 個循環(huán)；72°C IOmin0 用 1% 瓊脂糖凝膠對 16S rDNA 的 PCR 產物做電泳檢測，找到1500bp的目標條帶，進行割膠回收，對PCR產物純化后用PMD19-T載體做TA克隆，挑取陽性克隆子經驗證后委托華大基因測序。測序后得到腸桿菌(Enterobacter) taihuN3的16S rDNA長度為1391bp的序列，提交到GenBank與其他已有菌株序列進行比對，并用MEGA軟件通過NJ方法對菌株的16SrRNA序列進行分類及系統(tǒng)發(fā)育分析(見圖3),測序所得序列與Enterobacter cloacae的16S rDNA序列相似性較高，為99%?；?6S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結果，鑒定為腸桿菌屬(Enterobacter)的一株新菌株。實施例2 :本發(fā)明菌株的生長特性。在厭氧管中加入9. 8ml培養(yǎng)基，接種O. 2ml對數期的腸桿菌(Enterobacter)taihuN3菌液，在厭氧箱中30°C避光培養(yǎng)。(培養(yǎng)基配方同上述富集分離培養(yǎng)基)，分別于接種后的 0、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、7011、8011、9011、10011取樣，測定菌液在60011111處
的吸光度。用0. 22 pm濾膜過濾樣品，用離子色譜測定樣品中SO/—濃度。腸桿菌(Enterobacter) taihuN3生長曲線和培養(yǎng)基中S042_濃度變化曲線如圖4所示，接種后的10-40小時為對數生長期，40-80h為穩(wěn)定期，80h后菌液吸光度下降，菌體逐漸衰亡。在開始培養(yǎng)的20h內培養(yǎng)基中的硫酸鹽含量沒有變化，30-80h培養(yǎng)基中硫酸鹽濃度逐漸下降，80h硫酸鹽濃度趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)基中硫酸鹽含量從初始的1400mg/L下降到430mg/L，硫酸鹽轉化率為70%。硫酸鹽含量的下降與菌株的生長保持一致，在菌株生長的穩(wěn)定期培養(yǎng)基中硫酸鹽含量下降最快。實施例3 :本發(fā)明菌株對不同碳源的利用。在不含有機碳源的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方KH2P040. 5g，NH4Cl1. 0g, CaCl2 2H200. lg, Na2SO41. 0g, MgSO 4 7H20 2. 0g，乳酸鈉(80%) 3. 5ml，Vc 0. lg，巰基乙酸鈉 0. lg，蒸餾水1000ml，調pH7. 5)中分別添加甲醇、乙醇、乳酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、葡萄糖、苯酚、琥拍酸鹽、朽1檬酸鹽、鹿糖，接種處于對數生長期的菌株腸桿菌(Enterobacter) taihuN3 (將大量培養(yǎng)細菌離心，用無菌水清洗菌體)，在厭氧箱中30°C避光培養(yǎng)，于24h、48h、72h、96h、120測定菌液在波長600nm下的吸光度和培養(yǎng)基中硫酸鹽的濃度，以此評價菌株對不同碳源的利用能力。(糖醇類濃度為0. 8%，其他為0. 2%)除了苯酹外，添加的其他9種碳源都能被腸桿菌(Enterobacter) taihuN3唯一利用于菌株生長。圖5中菌株對6種碳源利用速率葡萄糖 > 乳酸 > 甲醇 > 乙醇〉乙酸〉丙酸。葡萄糖的利用速度最快，但很快菌株衰亡。圖6中腸桿菌(Enterobacter) taihuN3以6種不同有機物為唯一碳源生長還原硫酸鹽。硫酸鹽還原率乳酸 > 甲醇 > 乙醇 > 乙酸、丙酸、葡萄糖。綜合起來腸桿菌(Enterobacter) taihuN3以乳酸為碳源生長代謝最好。實施例4 :本發(fā)明菌株對砷的耐受性。設置7個砷處理組，向富集分離培養(yǎng)基中添加Na3AsO4,配制含砷培養(yǎng)基其中As (V)濃度分別為 2. 5g/L, lg/L, 500mg/L, 200mg/L, lOOmg/L, 50mg/L, lOmg/L,調 pH7. 3,滅菌后接種處于對數生長末期的菌株腸桿菌(Enterobacter) taihuN3,在厭氧箱中30°C避光培養(yǎng)，分別在接種后的0h，24h，48h，96h和120h取樣，測定菌液在在波長600nm下的吸光度和培
養(yǎng)基中硫酸鹽的濃度。腸桿菌(Enterobacter)taihuN3 在 2. 5g/L, lg/L, 500mg/L, 200mg/L, 100mg/L,50mg/L和10mg/LAs(V)下的生長狀況如圖7所示，隨著砷濃度增高，細菌生長的延遲期延長，但菌液吸光度值最大保持在0. 4-0. 5之間,說明腸桿菌(Enterobacter)taihuN3在生長初期受到了高濃度砷的影響，但通過自身的代謝調節(jié)可以完全消除砷的影響，并在生長的對數期和穩(wěn)定期保持較高的生長率，因此認為腸桿菌(Enterobacter) taihuN3是一株能夠耐受砷的菌株。腸桿菌(Enterobacter)taihuN3 在 200mg/L, 100mg/L, 50mg/L 和 10mg/LAs (V)下培養(yǎng)液中硫酸鹽濃度變化曲線如圖8所示，隨著培養(yǎng)基中As濃度的逐漸升高，體系中硫酸鹽的消耗量速率降低，但仍然保持50%以上的轉化率，該菌株在硫酸鹽還原菌用于處理較高濃度的砷廢水方面具有良好的應用前景。實施例5 :本發(fā)明菌株腸桿菌(Enterobacter) taihuN3在處理金屬廢水中的應用亞硫酸鹽還原酶(DSR)基因的擴增。以提取的提取細菌的總DNA為模板，使用DSR引物(DSR1F:5，-ACSCACTGGAAGCACG-3，;DRS4R :5，-GTGTAGCAGTTACCGCA-3’)擴增。PCR 體系10μ I體系，IOXBuffer I μ I, dNTP O. 5 μ 1，Mg2+0. 75 μ 1，引物各 O. 25 μ 1，模板 dna O. 25 μ I,rTaq O. 0625 μ l，ddH20 6. 9375 μ I。PCR條件94°C 4min ；94°C 30s,53°C 50s,72°C1. 5min,30個循環(huán)；72°C IOmin。用1%瓊脂糖凝膠對16S rDNA的PCR產物做電泳檢測，在1900bp的位置有條明亮的條帶，即是該菌株(圖9)亞硫酸鹽還原酶(DSR)基因的擴增產物。異化型亞硫酸鹽還原酶(dissimilatory sulfite reductase, DSR)是硫酸鹽還原菌還原S042_產生H2S的關鍵酶之一，S042_首先在ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸還原酶的作用下獲得2個電子，成為SO廣，SO廣在DSR的催化下，通過一系列電子轉移過程最終還原形成S2_。DSR廣泛存在于各種硫酸鹽還原菌中，且DSR基因在同一類群的SRB中相當保守，在不同類群SRB中卻有較大差別，可以作為SRB的分類與進化的指標。實施例6 :腸桿菌(Enterobacter) taihuN3在處理砷廢水中的應用。
將低溫保藏的腸桿菌(Enterobacter) taihuN3菌種接種于裝有富集分離液體培養(yǎng)基的厭氧管中活化，將活化后的菌種接種到500ml富集分離液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，待長至對數生長期，將擴大培養(yǎng)的菌液接種于配制的含AsO廣人工廢水中，同時補加等體積的富集分離培養(yǎng)基，30°C密封培養(yǎng)處理金屬廢水(每隔3天補加培養(yǎng)基)。該水中5價As濃度200mg/L, SO廣濃度800mg/L,經過處理后腸桿菌(Enterobacter) taihuN3將5價As還原成3價As，并與其產生的H2S生成As2S3沉淀，出水As (V)濃度下降到2. 4mg/L, S042_濃度169mg/L，As (V)去除率為98. 8%，SO廣去除率為78. 9%。
權利要求
1.一株對砷具有耐受性的硫酸鹽還原菌,其分類命名為腸桿菌(Enterobacter sp.) taihuN3，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012 年11月23日，保藏編號為CGMCCNo. 6886。
2.權利要求1所述的對砷具有耐受性的硫酸鹽還原菌在廢水處理中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的廢水為含砷和硫酸鹽的廢水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株對砷具有耐受性的硫酸鹽還原菌，其分類命名為腸桿菌(Enterobacter sp.)taihuN3，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2012年11月23日，保藏編號為CGMCC No.6886。本發(fā)明還公開了對砷具有耐受性的硫酸鹽還原菌在廢水處理中的應用。本發(fā)明菌株可利用的碳源范圍廣泛，易于培養(yǎng)。生長代謝活性強，硫酸鹽轉化效率高。本發(fā)明菌株在10-1000mg/LAs(V)濃度下能夠正常生長。本發(fā)明菌株在200mg/LAs(V)下硫酸鹽的還原率達到50%，可用于處理較高濃度的砷廢水，具有良好的應用前景。
文檔編號C02F101/10GK103013868SQ201210512360
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權日2012年12月4日
發(fā)明者肖 琳, 劉瑩 申請人:南京大學