一株形成生物膜的缺陷短波單胞菌及其在含氰廢水處理中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株形成生物膜的缺陷短波單胞菌及其在含氰廢水處理中的應(yīng)用屬于生物修復(fù)技術(shù)；該缺陷短波單胞菌(Brevundimonas?diminuta)N5，已于2013年04月07日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCCNo.7412。所述缺陷短波單胞菌(Brevundimonas?diminuta)N5可以產(chǎn)生生物膜，當接種量為1.1％，30.6℃時，在含800mg·L-1乙腈的合成廢水中培養(yǎng)24h后，菌株的成膜量OD570nm值為0.632。應(yīng)用該菌株處理含氰廢水，能夠?qū)⒁译娼到饩鷮?00mg·L-1乙腈的降解率從24％-43％提升至30％-53％；該菌株與乙腈降解菌聯(lián)合培養(yǎng)所形成的生物膜在反應(yīng)器運行30d后可將800mg·L-1乙腈完全去除并可降低出水COD值；本發(fā)明提供的菌株能夠與高效乙腈降解菌混合掛膜，提高乙腈的去除效率，可以應(yīng)用于含氰廢水的生物膜法處理。
【專利說明】一株形成生物膜的缺陷短波單胞菌及其在含氰廢水處理中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物修復(fù)技術(shù)，主要涉及一株可產(chǎn)生物膜的缺陷短波單胞菌及其在含氰廢水處理中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]生物膜是具有一定結(jié)構(gòu)性和功能性的高度組織化的微生物群體，是微生物為其自身創(chuàng)造的獨特生存方式。生物膜以其營養(yǎng)需求低，對水流剪切力的忍受度強，適應(yīng)的pH范圍廣以及對抗生素的抗性能力強等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域。生物膜法憑借其成本低、效率高、不會造成二次污染、穩(wěn)定性強、環(huán)境條件要求低等諸多化學方法無法比擬的優(yōu)點，成為污水治理領(lǐng)域的優(yōu)勢方法之一。
[0003]含氰廢水是由氰化物的使用而產(chǎn)生的一種具有較高生物毒性的工業(yè)廢水，是電鍍、金屬加工、煉鋼、采礦、攝影、制藥、煉焦及塑料工業(yè)等生產(chǎn)過程的副產(chǎn)物，其大量排放不僅會造成嚴重的環(huán)境污染，而且危及人類與動植物健康。乙腈是一種含氰基(R-CN)的有機化工原料，廣泛用于制藥、合成纖維、石油化工等領(lǐng)域，是含氰廢水中的主要成分之一。隨著乙腈產(chǎn)量和用量的迅速增加，含氰廢水的排放量亦逐年增大。乙腈可由吸入、食入及皮膚吸收而進入體內(nèi)，在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為劇毒物質(zhì)一氰化氫和乙醛，威脅人畜健康。含氰廢水中的乙腈進入自然水域后會引起魚類等水生生物大批死亡，對生態(tài)環(huán)境造成嚴重的破壞。
[0004]利用生物膜法處理含氰廢水可以為含氰廢水的生物治理提供一個新的途徑。形成生物I旲有利于提聞細菌對有毒物質(zhì)的承受能力和降解能力。向生物I旲反應(yīng)器中投加聞效降解菌進行生物強化是生物法處理含氰廢水的有效手段，然而在實際的污水處理過程中，降解菌株往往難以附著于載體表面，形成生物膜能力較弱。有研究表明，一些細菌能夠發(fā)揮橋梁作用，將多種無親緣關(guān)系的細菌組合進生物膜中，故在廢水的處理中投加生物膜形成菌輔助降解菌掛膜是更可行的方法。因此，篩選出能夠耐受高濃度氰化物的生物膜形成菌株，對于開展含氰廢水的生物膜法處理具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一株形成生物膜能力強并且可以耐受高濃度乙腈的缺陷短波單胞菌，該菌產(chǎn)生的生物膜能夠應(yīng)用于含氰廢水的處理中。
[0006]本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明所提供的生物膜形成菌為缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)N5,已于2013年04月07日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC) ”，其保藏號為CGMCCN0.7412。地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼:100101。上述的缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)N5可以產(chǎn)生生物膜，最適生物膜形成條件為:當培養(yǎng)液中添加Sg.!/1的蔗糖時，接種量
1.1%，培養(yǎng)溫度30.6°C，pH7.6，培養(yǎng)時間37.0h，菌株的成膜量OD57tlnm值為3.062。[0008]缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)N5可耐受高濃度的乙腈:當接種量為1.1%，30.61:時，在含SOOmg.!/1乙腈的合成廢水中培養(yǎng)24h后，菌株的成膜量OD57tol值為0.632。因此，高濃度乙腈對生物膜形成菌的生長沒有明顯抑制作用。
[0009]缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)N5可以提高乙腈降解菌的抗乙腈沖擊能力:投加N5后，能夠提高乙腈降解菌BX2單獨培養(yǎng)所形成的生物膜的抗沖擊水平，在12小時內(nèi)將BX2對含有800mg.L-1乙腈的合成廢水連續(xù)降解率從24% -43%提升至30% -53%。
[0010]上述缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)N5在含氰廢水中的應(yīng)用:缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)N5能夠促使乙腈降解菌BX2在生物膜內(nèi)大量增殖并發(fā)揮其降解作用，投加N5后MBBR反應(yīng)器運行30d，出水乙腈的濃度Omg.L—1，COD濃度為38.5mg.L -1。
[0011]所述的乙腈降解菌BX2為紫紅色紅球菌(Rhodococcus rhodochrous),已于2013年04月07日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，其保藏號為CGMCCN0.7411。當乙腈濃度為800mg.L-1時，在35°C，環(huán)境pH為7.5的條件下，16h時Rhodococcus sp.BX2對乙腈的降解率為95.98 %。見于孫晶，熊明華，成小松Rhodococcus sp.BX2菌對乙腈的降解特性及其降解途徑研究[J].環(huán)境科學學報，2012，32(5):1041-1048.[0012]生物膜反應(yīng)器裝置見于Chunyan Li, Immobilization of Rhodococcusrhodochrous BX2(an acetonitriledegrading bacterium)with biofilm-formingbacteria for wastewater treatment, Bioresource Technologyl31(2013)390-396.[0013]本發(fā)明提供的菌株，豐富了生物膜形成菌的多樣性，為細菌生物膜結(jié)構(gòu)及機理研究提供重要菌株資源，該生物膜形成菌為生物膜法處理含氰廢水奠定了基礎(chǔ)。應(yīng)用該菌株與高效乙腈降解菌聯(lián)合培養(yǎng)產(chǎn)生的生物膜處理含氰廢水，能夠提高乙腈的去除效，率降低出水COD值，可以應(yīng)用于含氰廢水的生物膜法處理。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)N5在不同外加碳源條件下的生物膜形成量。
[0015]圖2缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)N5在不同鹿糖添加濃度下的生物膜形成量。
[0016]圖3缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)N5對乙腈的耐受及利用情況。
[0017]圖4缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta) N5與乙腈降解菌聯(lián)合培養(yǎng)時生物膜形成量。
[0018]圖5乙腈降解菌單獨培養(yǎng)對乙腈的生物降解能力。
[0019]圖6缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)N5與乙腈降解菌聯(lián)合培養(yǎng)時對乙腈的生物降解能力。
[0020]圖7MBBR生物膜反應(yīng)器模擬含氰廢水處理過程中，出水乙腈殘留量變化曲線。
[0021 ] 圖8MBBR生物膜反應(yīng)器模擬含氰廢水處理過程中，出水COD變化曲線?！揪唧w實施方式】
[0022]實例1、缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)N5的分離、純化及鑒定
[0023](I)缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta) N5的分離純化
[0024]本發(fā)明提供的缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta) N5,分離于腈纟侖廢水和污泥培養(yǎng)的生物膜，腈綸廢水和污泥樣品采集自大慶某腈綸廢水處理廠，其具體分離和純化過程如下:
[0025]采用MBBR(Moving Bed Biofilm Reactor)生物膜反應(yīng)器,對污泥和廢水樣品進行生物膜培養(yǎng)。反應(yīng)器由透明的聚苯乙烯材料制成，有效容積10L，反應(yīng)器中添加聚乙烯材料制成的工業(yè)用生物膜載體和載玻片載體。將污泥樣品和腈綸廢水投加到反應(yīng)器中，以連續(xù)流方式從底部進水上部排水，于25°C條件下培養(yǎng)，每12h曝氣6h，水力停留時間24h連續(xù)培養(yǎng) 20-30d。
[0026]采集運行了 20-30d的生物膜反應(yīng)器中載體，運用掃描電子顯微鏡觀察載體上生物膜的形成狀態(tài)，并對生物膜上的細菌進行分離和純化。具體操作步驟如下:在無菌條件下，將附有生物膜的載體放入無菌三角瓶中，加入20mL無菌生理鹽水，在漩渦混合器上振蕩30min，洗下生物膜上的細菌。取50 μ L經(jīng)梯度稀釋后的菌懸液涂布LB平板和含1%乙腈的LB平板，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜，挑取菌落形態(tài)差異較大的單菌落，進一步分離純化3-4次。經(jīng)反復(fù)純化后的菌株放_80°C和4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0027]所述的培養(yǎng)基配制方法如下，LB培養(yǎng)基:酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g7NaCl 10.0g,蒸餾水1000mL,按2%的比例添加瓊脂，pH調(diào)至7.0~7.2，115°C滅菌20min ;含1%乙腈的LB培養(yǎng)基:在LB培養(yǎng)基中按I %體積比例添加乙腈。
[0028](2)生物膜的定性及定量檢測
`[0029]參考Srdjan Stepanovic等描述的試管檢測法和96孔細胞培養(yǎng)板檢測方法分別對分離得到的細菌進行生物膜形成定性及定量檢測。(Stepanovic S，Vukovic' D, DakicI, et al.A modified microtiter—plate test for quantification of staphylococcalbiofilm formation[J].Journal of Microbiological Methods,2000,40:175-179.)
[0030](3)缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta) N5 的鑒定
[0031]參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠等，2001)，微生物學試驗(第三版)對生物膜形成菌株進行形態(tài)學及生理生化指標檢測。
[0032]缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta) N5的分子生物學鑒定:以SDS法提取細菌的總DNA為模板，采用細菌16S rDNA通用引物BSF8 / 27:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 BSR1510 / 1492:5' -GGTTACCTTCTTACGACTT-3';對強成膜細菌16S rDNA的保守區(qū)進行PCR擴增。采用細菌gyrB基因引物UPl:GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNA 和 UP_2r:AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT對強成膜細菌的gyrB基因進行PCR擴增。
[0033]PCR 反應(yīng)體系均為:dNTP4 μ L (2.5mmol / L)，10 X buffer5 μ L，上下游引物各2 μ L (50 μ mo I / L)，rTaq 酶 0.5 μ L，模板 DNAl μ L，加 ddH20 M 50 μ L0 反應(yīng)條件依次為:94°C 5min，94°C 45s, 55 °C 1.5min，72°C 2.0min，變性、退火、延伸共 35 個循環(huán)，72 °C 延伸IOmin ；94°C 5min，94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 1.0min，變性、退火、延伸共 35 個循環(huán)，72°C延伸IOmin0 PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用凝膠成像系統(tǒng)觀察分析。PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化及測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。
[0034]以試管培養(yǎng)法分離得到的菌株N5所形成的生物膜沿液面緊貼試管壁向下生長，同時在液面形成一層較薄的膜，液面膜與試管結(jié)合，管壁上的膜與試管的粘附性較高。以96孔細胞培養(yǎng)板孔內(nèi)洗脫液在570nm處的OD值作為生物膜形成量的評價指標，生物膜定量檢測結(jié)果為OD57tlnm大于2.3。
[0035]分離得到的生物膜形成菌N5的形態(tài)特征和生長特點:單一菌落為圓形，表面凸起，邊緣整齊，不透明，濕潤，粘稠，不易挑起，牛肉膏瓊脂平板上菌落淡黃色；菌株個體橢圓形或球形，無芽孢，有鞭毛，大小約為300-500X600-900nm革蘭氏陰性；靜置培養(yǎng)時培養(yǎng)液體表面形成較薄菌膜，貼壁處有菌膜，菌液均勻混濁。
[0036]分離得到的生物膜形成菌N5部分生理生化特征如表1所示:
[0037]表1生物膜形成菌N5生理生化特征
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一株缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)N5,該菌株已于2013年04月，07日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)”，保藏號為CGMCCN0.7412。
2.如權(quán)利要求1所述的一株缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta) N5產(chǎn)生生物膜。
3.如權(quán)利要求1所述的一株缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta) N5在含氰廢水處理中 的應(yīng)用。
【文檔編號】C02F3/34GK103881947SQ201410077624
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】李春艷, 成小松, 李大鵬, 孫晶, 徐春紅, 臧海蓮, 熊明華, 成毅, 安雪姣 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學