重金屬整治系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了通過(guò)細(xì)菌螯合重金屬的系統(tǒng)。該細(xì)菌表達(dá)ppk、mt和/或β-半乳糖苷酶(lacZ)基因且可以耐受至少25μM汞、1,000μM鋅、250μM鎘和3,000μM?Pb。該系統(tǒng)允許容易確定液體中重金屬污染物的存在和容易收集已經(jīng)螯合大量重金屬的細(xì)菌。還提供了一種在細(xì)菌中基因表達(dá)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括噬菌體和質(zhì)體基因表達(dá)元件并遞送特別高水平的蛋白表達(dá)和重金屬抗性。
【專利說(shuō)明】重金屬整治系統(tǒng)
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年8月20日，申請(qǐng)?zhí)枮?01080045997.2，發(fā)明名稱為“重
金屬整治系統(tǒng)”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]本發(fā)明部分地用根據(jù)由美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)授予的美國(guó)政府撥款NSF CBET-0755649開(kāi)發(fā)的材料來(lái)進(jìn)行。政府可以具有本發(fā)明的某些權(quán)益。
[0003]發(fā)明背景
[0004]本專利申請(qǐng)要求2009年8月20日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/235，624號(hào)的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0005]本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生耐受包括汞、鉛、鋅和鎘的重金屬且能夠螯合和累積這些重金屬的基因修飾細(xì)菌以用于生物整治(bioremediation)受污染液體和固體的分子生物學(xué)領(lǐng)域。
[0006]背景描述
[0007]具有相對(duì)高的密度的金屬化學(xué)元素常常被稱為重金屬。重金屬甚至在低濃度下是有毒的。有毒的重金屬包括汞、鎘、鉛、鋅和銀。在重金屬當(dāng)中，汞、鉛和鎘被認(rèn)為是特別有
毒的。
[0008]汞已經(jīng)作為工業(yè)過(guò)程和天然過(guò)程的副產(chǎn)物被引入環(huán)境中且可以高的濃度累積在土壤和沉積物中。Patra, M.和 Sharma A.，Bot.Rev.66:379-422 (2000)。在美國(guó)，燃煤發(fā)電廠每年放出約48噸的汞，而在亞洲和非洲，燃煤發(fā)電廠每年釋放多于1500噸。2009年2月8日檢索的Clean Air Mercury Rule (清潔空氣萊規(guī)則).美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(“EPA”) 2009，www.epa.gov/air/mercuryrule/basic, htm。全世界每年來(lái)自所有源的萊排放估計(jì)在4800-8300噸。2009 年 2 月 8 日檢索的 Mercury Human Exposure (萊人類暴露),EPA2008, www.usepa.gov/mercury/exposure, htm。
[0009]汞化合物是神經(jīng)毒素和電子在細(xì)胞中運(yùn)輸?shù)膹?qiáng)力阻斷劑。所有的汞形式是有毒的并對(duì)人類健康和對(duì)環(huán)境帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。開(kāi)發(fā)成本有效的和高效的整治系統(tǒng)是極其重要的。
[0010]當(dāng)前從環(huán)境清潔汞的整治策略包括沖洗、化學(xué)還原/氧化、挖掘、回收和廠外處置。這些方法是成本高的、環(huán)境破壞性的和無(wú)效的。Karenlampi, S.等人，Environ.Po I lut.1007:225-231 (2000)。其他方法例如玻璃化和混凝土覆蓋使得該地方不能用且對(duì)于整治大面積是不切實(shí)際的。用當(dāng)前技術(shù)從環(huán)境整治一磅汞的成本是數(shù)千美元。Hussein, H.等人,Env.Sc1.Technol.41:8439-8446 (2007)。
[0011]與汞一樣，其他重金屬例如鉛和鎘帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境威脅且必須被整治。鉛是可以累積在軟組織和骨中的強(qiáng)力的神經(jīng)毒素。因?yàn)槠涠拘?，鉛已經(jīng)被EPA和其他機(jī)構(gòu)禁止進(jìn)入消費(fèi)者產(chǎn)品中，包括油漆、汽油、水管、玩具以及其他的。EPA將飲用水中的鉛含量限制為小于0.015ppm。鉛在2007綜合環(huán)境反應(yīng)、補(bǔ)償和責(zé)任法(Comprehensive EnvironmentalResponse Compensation, and Liability Act, CERCLA)危險(xiǎn)物質(zhì)的優(yōu)先級(jí)表中排在第二。
[0012]當(dāng)前在多個(gè)消費(fèi)者應(yīng)用中，尤其在電池中廣泛使用鎘已經(jīng)增加了該重金屬的環(huán)境污染。鎘已經(jīng)被表明是高毒性的，造成嚴(yán)重的中毒、骨退化、細(xì)胞酶抑制和細(xì)胞膜破壞。如在汞的情況一樣，當(dāng)前的整治或捕獲鉛和鎘的方法依賴于使用物理化學(xué)方法，包括使用離子交換樹(shù)脂、沉淀和提取、埋藏、原地覆蓋和廠外處置。Kim，S.等人.J.Biosc1.Bioeng.99:109-114(2005)。這些方法是成本高的和/或?qū)φ恢鲝埍Ｗo(hù)的環(huán)境是破壞性的。需要新的技術(shù)來(lái)促進(jìn)被污染環(huán)境的整治。
[0013]使用有機(jī)體來(lái)整治被污染環(huán)境的生物整治可以提供潛在低的成本和環(huán)境友好的方法。例如，細(xì)菌可以將某些有毒化合物分解為它們的無(wú)毒代謝物。然而，重金屬元素例如汞、鎘和鉛不能被解毒為無(wú)毒代謝物。
[0014]通過(guò)揮發(fā)汞的汞生物整治方法依賴于mer操縱子的表達(dá)，mer操縱子管理Hg2+的運(yùn)輸和還原。mer操縱子基因之一，merA，編碼汞離子還原酶，該酶是催化Hg2+至Hg°的轉(zhuǎn)化的酶。Hgci是低揮發(fā)性的、低反應(yīng)性和低毒性形式的萊。Jackson, W.J.和Summers, A.0.，J.Bacteriol.151:962-970 (1982)。然而，在揮發(fā)過(guò)程中，元素汞釋放到環(huán)境中，在環(huán)境中它可以被轉(zhuǎn)化為毒性更大的形式。揮發(fā)方法的另一個(gè)缺點(diǎn)是其不適合于水處理，因?yàn)榧?xì)菌將揮發(fā)的元素汞釋放到正被整治的相同的水中。
[0015]細(xì)菌并不具有在允許汞在細(xì)胞內(nèi)部累積的同時(shí)提供對(duì)汞的高抗性的內(nèi)源性機(jī)制?；蚬こ桃呀?jīng)用于將來(lái)自其他有機(jī)體的基因與增加汞抗性和累積的目標(biāo)結(jié)合。已知為螯合劑(chelator)或螯合劑(sequestration agent)的分子已經(jīng)被提出作為合適的重金屬清除劑，其可以在有機(jī)體內(nèi)被表達(dá)，
[0016]目標(biāo)是從土壤或水回收重金屬。
[0017]細(xì)菌系統(tǒng)中的金屬硫蛋白和多磷酸鹽(polyphosphate)已經(jīng)被包含在一些重金屬的解毒中。在大腸桿菌中被表達(dá)的這兩種物質(zhì)可以螯合汞、鎘和鉛，且因此保護(hù)細(xì)菌免于某些水平的這些重金屬元素。然而，至今結(jié)果是令人氣餒的。細(xì)菌不能夠有效地螯合這些元素且并不經(jīng)受得住高水平的這些重金屬。這些結(jié)果歸因于螯合劑蛋白劑的穩(wěn)定性的察覺(jué)到的缺乏，產(chǎn)生具有對(duì)重金屬弱的耐受性的細(xì)菌系統(tǒng)。
[0018]金屬硫蛋白被哺乳動(dòng)物、植物和真菌中存在的mt基因編碼。Sousa，C.等人，J.Bacteriol.180:2280-2284(1998)。然而，已經(jīng)表明金屬硫蛋白(MT)當(dāng)在細(xì)菌中被表達(dá)時(shí)是不穩(wěn)定的。Berka, T.等人，J.Bacteriol.170:21-26 (1988)。因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)MT蛋白當(dāng)在細(xì)菌中被表達(dá)時(shí)是不穩(wěn)定的，所以mt基因已經(jīng)與穩(wěn)定劑例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合，產(chǎn)生 GST-MT 融合。Chen, S.和 Wilson D.B.，Appl.Env.Microbiol.63:2442-2445(1997)。各種GST-MT構(gòu)建體包括釀酒酵母(GST-YMT)、人類(GST-HMT)和豌豆(pea) (GST-PMT)。含有GST-HMT的細(xì)胞沒(méi)有被表明為產(chǎn)生可溶的MT蛋白，
[0019]且該構(gòu)建體并不賦予對(duì)汞的任何抗性。表達(dá)YMT和PMT構(gòu)建體的細(xì)胞已經(jīng)被表明耐受具有至多5μ M汞的液體，至多5μ M汞是幾乎無(wú)毒的水平。更重要地，表達(dá)這兩個(gè)構(gòu)建體的細(xì)胞看來(lái)并不累積汞或保護(hù)細(xì)胞免于汞，除非細(xì)胞還工程化為表達(dá)mer操縱子的汞轉(zhuǎn)運(yùn)基因。也已經(jīng)進(jìn)行各種不成功的嘗試來(lái)工程化靶向細(xì)菌周質(zhì)的粗糙脈孢菌(N.crassa)的mt基因和其他人類mt基因的多個(gè)拷貝。然而，這些蛋白的不穩(wěn)定性和不溶性已經(jīng)不斷阻止它們用作有效的整治劑。Valls，M.和Lorenzo, V.，F(xiàn)EMS Micr0.Reviews, 26:327-338 (2002)。雖然這些融合蛋白賦予對(duì)于汞的某些有限的耐受性，但該效應(yīng)并不能明確地歸因于MT蛋白，因?yàn)檫€已知GST，即融合配偶體，結(jié)合重金屬例如萊。Chen, S.和 Wilson D.B., Appl.Environ.Microbiol.63: 2442-2445 (1997) ；Deng, X.和 Wi Ison D.B.，Appl.Microbiol.Biotechnol.56: 276-279 (2001) ；Custodio, Η.M.等人,Arch.Environ.0ccup.Health60:17-23 (2005)。
[0020]因此，已經(jīng)推斷出，用金屬硫蛋白基因修飾的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌在細(xì)胞中沒(méi)有提供足夠的抗性。Beattie, J.H.等人，Toxicol.Lett.157:69-78 (2005) ；0dawara, F.等人，J.Biochem.118:1131-1137(1995) ；Park, J.D.等人，Toxicology.163:93-100 (2001)。對(duì)該失敗給出的解釋包括小的金屬硫蛋白肽被細(xì)胞蛋白酶快速降解、低的蛋白收率和可能的對(duì)細(xì)胞溶質(zhì)中的氧化還原路徑的干擾。Sousa, C.等人，J.Bacteriol.180:2280-2284(1998)；Yang, F.等人,Protein Expr.Purif.53:186-194 (2007)。
[0021]并且，用金屬硫蛋白基因工程化細(xì)菌以增強(qiáng)對(duì)鋅的抗性的嘗試已經(jīng)證明是無(wú)效的。Odawara, F.等人，同上。
[0022]在細(xì)菌中表達(dá)的金屬硫蛋白融合基因已經(jīng)顯示僅僅提供對(duì)鎘毒性的臨界耐受性，最多 50mg/ 升(約 150 μ Μ)。Odawara, F.等人，同前；Keasling, J.D.,和 Hupf, G.A.AppliedEnv.Microbiol.62:743-746 (1996)。這些研究并不表明細(xì)菌可以在高的鎘濃度中生長(zhǎng)良好，這是因?yàn)樵?0mg/L的鎘之后，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與在沒(méi)有鎘的培養(yǎng)基(media)中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞相比生長(zhǎng)顯著降低。
[0023]其他人關(guān)注于工程化多磷酸鹽激酶(polyphosphate kinase, “ppk”)基因以在細(xì)菌中表達(dá)。ppk酶負(fù)責(zé)已知吸收(螯合)汞的正磷酸鹽的長(zhǎng)線型聚合物的合成。與mt相似，僅ppk融 構(gòu)建體已被提出和利用。例如，產(chǎn)氣克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes) ppk基因已經(jīng)與假單胞菌衍生的merT和merP基因融合。merT和merP基因促進(jìn)汞的內(nèi)在化。融合意味著提高穩(wěn)定性，且選擇融合組分部分是由于相信汞內(nèi)在化將被限制，這還將限制表達(dá)PPk基因的細(xì)菌的生物整治效果。Pan-Hou，H.等人，Biol.Pharm.Bull.24:1423-1426(2001) ；Pan-Hou, H.等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.10325:159-164(2002) ο表達(dá)這些構(gòu)建體的細(xì)菌能夠從溶液累積高達(dá)16 μ M汞和24μΜ的有機(jī)汞化合物。在元素汞的存在下的細(xì)菌生長(zhǎng)在16 μ M汞時(shí)被完全破壞。當(dāng)將表達(dá)構(gòu)建體的工程化的細(xì)菌放在海藻酸鹽珠上時(shí)，已經(jīng)顯示出增加的對(duì)汞的抗性。然而，汞整治失效，且細(xì)菌在40-80 μ M汞的存在下喪失生活力。Kyono，Μ.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.62:274-278(2003)。
[0024]植物整治和真菌整治(非工程化的有機(jī)體)已經(jīng)成為試圖通過(guò)使鉛累積在根或葉中來(lái)生物整治鉛的方法。Huang, L.Z.等人，Biodegradation20:651-660 (2009) ；Vimala, R.和Das, N., J., Hazard.Mat.168:376-382 (2009)?，F(xiàn)今沒(méi)有提出對(duì)于鉛的有效的細(xì)菌生物整治技術(shù)。
[0025]由上述系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的工程化的細(xì)菌對(duì)重金屬的低的抗性水平排除了它們作為有效的生物整治系統(tǒng)的應(yīng)用。甚至在具有低的汞濃度的水中，這些系統(tǒng)將不是有效的，因?yàn)楣瘜⒁愿哂谟上到y(tǒng)耐受的濃度的濃度累積在細(xì)胞內(nèi)。
[0026]發(fā)明概述
[0027]在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于表達(dá)細(xì)菌中的重金屬螯合基因的載體，其包括以下功能連接的元件:
[0028]載體骨架，[0029]轉(zhuǎn)錄組成型啟動(dòng)子序列，其源自質(zhì)體16Srrn基因，
[0030]翻譯增強(qiáng)子元件序列，其源自噬菌體T7基因10，
[0031]螯合劑的編碼序列，
[0032]其中載體是在細(xì)菌中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，載體還包括3’UTR不依賴P因子的翻譯終止子。優(yōu)選地，3’ UTR是質(zhì)體rpsl6轉(zhuǎn)錄終止子或大腸桿菌rrnB轉(zhuǎn)錄終止子。更優(yōu)選地，3’ UTR是質(zhì)體rpsl6轉(zhuǎn)錄終止子。
[0033]在另一個(gè)實(shí)施方式中，螯合劑由mt、ppk或β _半乳糖苷酶(IacZ)基因編碼,且基因在細(xì)菌中被表達(dá)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，螯合劑是由PPk合成的多磷酸鹽，且細(xì)菌抵抗高達(dá)約100 μ M汞、至少約1000 μ M鋅、至少約250 μ M鎘或至少約3，000 μ M鉛。
[0034]在又一個(gè)實(shí)施方式中，mt基因是哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白。更優(yōu)選地，螯合劑由小鼠mtl基因序列編碼，且細(xì)菌抵抗高達(dá)約160 μ M汞、至少250 μ M鎘、1,000 μ M鋅或3，000 μ M鉛。
[0035]在還另一個(gè)實(shí)施方式中，螯合劑由半乳糖苷酶(IacZ)基因序列編碼，且細(xì)菌抵抗高達(dá)約140 μ M汞和至少250 μ M鎘、1，000 μ M鋅或3，000 μ M鉛。
[0036]在還另外的另一個(gè)實(shí)施方式中，載體骨架是質(zhì)粒骨架。
[0037]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種包括轉(zhuǎn)基因螯合劑的細(xì)菌，其中細(xì)菌抵抗在至少約25 μ M和至少約100 μ M之間的Hg。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑基因從強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄，并側(cè)翼為選定的5’UTR和任選的選定的3’UTR，例如至少在4，000和8，500拷貝之間的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄物每ng總mRNA對(duì)應(yīng)于螯合劑基因，更優(yōu)選地在6，000和7，500拷貝之間的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄物每ng總mRNA對(duì)應(yīng)于螯合劑基因。在還更優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑基因從源自質(zhì)體16S rrn基因的轉(zhuǎn)錄組成型啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄，螯合劑基因側(cè)翼為源自噬菌體T7基因10的5’UTR翻譯增強(qiáng)子元件序列。仍還更優(yōu)選地，螯合劑基因從源自質(zhì)體16Srrn基因的轉(zhuǎn)錄組成型啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄，且側(cè)翼為源自噬菌體T7基因10的5’ UTR轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件序列和質(zhì)體rpsl6基因3’ UTR不依賴P因子的翻譯終止子序列。
[0038]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑編碼序列對(duì)應(yīng)于mtl基因，且細(xì)菌抵抗高達(dá)約160 μ M汞或抵抗至少約250 μ M鎘、1，000 μ M鋅或3，000 μ M鉛。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑編碼序列對(duì)應(yīng)于β -gal ( β -半乳糖苷酶/lacZ)基因，且細(xì)菌抵抗高達(dá)約140 μ M汞或抵抗至少約250 μ M鎘、1，000 μ M鋅或3，000 μ M鉛。在還另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑編碼序列對(duì)應(yīng)于β-gal基因，且細(xì)菌抵抗高達(dá)約140 μ M汞或抵抗至少約1，000 μ M鋅或3，000 μ M鉛。在仍還另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑編碼序列對(duì)應(yīng)于ppk基因，且其中細(xì)菌抵抗約250 μ M鎘、1，000 μ M鋅或3，000 μ M鉛。
[0039]在另外的實(shí)施方式中，細(xì)菌包括功能上連接于轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)的mt、ppk或β -gal基因序列，所述系統(tǒng)還包括:
[0040] 轉(zhuǎn)錄組成型啟動(dòng)子,其源自質(zhì)體16S rrn基因，
[0041]翻譯增強(qiáng)子元件，其源自噬菌體T7基因10，和
[0042]不依賴P因子的轉(zhuǎn)錄終止子序列。
[0043]在還另外的實(shí)施方式中，細(xì)菌當(dāng)在包含汞、鎘、鋅或鉛的液體環(huán)境中時(shí)，累積汞、鋪、鋒或鉛且在萊的存在下在著色上變深。
[0044]在還又一實(shí)施方式中，細(xì)菌當(dāng)在包含汞、鎘、鋅或鉛的液體環(huán)境中時(shí)，累積汞、鎘、鋅或鉛，且細(xì)菌形成聚集體和沉淀物。在不同的還又一實(shí)施方式中，細(xì)菌當(dāng)在包含汞的液體環(huán)境中時(shí)，累積汞，且細(xì)菌形成聚集體和沉淀物。
[0045]根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，細(xì)菌是大腸桿菌、假單胞菌(Pseudomonas)、藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)或芽抱桿菌(Bacillus)。
[0046]在不同的實(shí)施方式中，當(dāng)包括mt、ppk或β -gal基因序列的細(xì)菌在生物過(guò)濾器上生長(zhǎng)時(shí)，其可以從受污染液體除去重金屬。且其被便利地處理，例如從液體除去。
[0047]在另一個(gè)不同的實(shí)施方式中，半乳糖苷酶裂解5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)的能力由于重金屬的存在而與重金屬的濃度按比例地降低。
[0048]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于從液體清除汞污染的方法，該方法包括: [0049]將表達(dá)mt、ppk或β -半乳糖苷酶基因的細(xì)菌培養(yǎng)物加入所述液體中，其中所述細(xì)菌培養(yǎng)物中的細(xì)菌抵抗在約25 μ M Hg和至少約100 μ M Hg之間的Hg，和
[0050]在足以允許所述汞的螯合的一段時(shí)間之后從所述液體除去所述細(xì)菌。根據(jù)方法的一個(gè)實(shí)施方式，在所述細(xì)菌形成塊(clump)之后除去所述細(xì)菌。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，細(xì)菌通過(guò)篩分、抽吸或從過(guò)濾器除去細(xì)菌來(lái)除去。
[0051]根據(jù)另一個(gè)方面，提供了一種監(jiān)測(cè)汞水平的方法，該方法包括將表達(dá)半乳糖苷酶基因的細(xì)菌培養(yǎng)物加入液體中，其中細(xì)菌培養(yǎng)物中的細(xì)菌抵抗在約25 μ M Hg和至少約140 μ M Hg之間的Hg，和
[0052]將X-gal加入樣品中和測(cè)試樣品以確定細(xì)菌代謝5_漠_4_氣_3_ Π引噪基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)以產(chǎn)生藍(lán)色著色的能力以便確定萊在樣品中的濃度。
[0053]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種從液體清除汞污染的方法，該方法包括:
[0054]將所述液體放在包括固體基質(zhì)的裝置中，其中所述基質(zhì)還包括β_半乳糖苷酶，而沒(méi)有細(xì)胞載體；和
[0055]當(dāng)所述液體被從所述固體基質(zhì)洗脫時(shí)，收集所述液體。
[0056]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)重金屬污染的試劑盒，該試劑盒包括:
[0057]流體容器，
[0058]指示劑條上的表達(dá)β_半乳糖苷酶(β-galactosidase)或β_半乳糖苷酶(β -galactosidase enzyme)的細(xì)菌培養(yǎng)物，
[0059]X-gal，和
[0060]顯示著色的圖表，所述著色對(duì)應(yīng)于與指示劑條上的表達(dá)半乳糖苷酶或半乳糖苷酶的細(xì)菌培養(yǎng)物接觸的液體中的Hg的各種濃度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，試劑盒還包括比色增強(qiáng)劑(colorimetric enhancer)。
[0061]在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)重金屬污染的試劑盒，該試劑盒包括:
[0062]流體容器，
[0063]表達(dá)β -半乳糖苷酶、ppk或mtl的細(xì)菌培養(yǎng)物,和
[0064]顯示深的著色的指示劑條，所述深的著色對(duì)應(yīng)于表達(dá)半乳糖苷酶、ppk或mtl的所述細(xì)菌培養(yǎng)物當(dāng)在液體中各種濃度的所述重金屬的存在下生長(zhǎng)時(shí)的著色。
[0065]附圖簡(jiǎn)述
[0066]圖1闡明細(xì)菌在所指示的濃度的汞的存在下生長(zhǎng)的能力。使培養(yǎng)物在汞中生長(zhǎng)16小時(shí)，之后它們的生長(zhǎng)作為培養(yǎng)物的光密度(0D_)的函數(shù)被測(cè)量。圖1A表示未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。圖1B表示工程化的細(xì)菌培養(yǎng)物，包括表達(dá)β-gal蛋白的所指示的質(zhì)粒。圖1C表示工程化的細(xì)菌培養(yǎng)物，包括表達(dá)mtl蛋白的所指示的質(zhì)粒。圖1D表示工程化的細(xì)菌培養(yǎng)物，包括表達(dá)ppk酶的所指示的質(zhì)粒。
[0067]圖2闡明細(xì)菌在所指示的濃度的汞的存在下生長(zhǎng)的能力。使培養(yǎng)物在汞中生長(zhǎng)120小時(shí)，且它們的生長(zhǎng)作為培養(yǎng)物的光密度(OD6J的函數(shù)被測(cè)量。圖2A表示未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。圖2B表示表達(dá)β-gal蛋白的工程化的細(xì)菌培養(yǎng)物。圖2C表示表達(dá)mtl蛋白的工程化的細(xì)菌培養(yǎng)物。圖2D表示表達(dá)ppk酶的工程化的細(xì)菌培養(yǎng)物。
[0068]圖3闡明根據(jù)本發(fā)明制備的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄功效。從螯合劑的mRNA制備cDNA。mRNA拷貝數(shù)被計(jì)算并被歸一化為總的所提取的RNA。圖3A比較在未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(“wt”)中和在用P16s-gl0-mtl-3’ UTR遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中從mRNA轉(zhuǎn)錄物體外產(chǎn)生的cDNA。圖3B比較在wt細(xì)菌中和在用P16s-glO-ppk-3’UTR遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中從mRNA轉(zhuǎn)錄物體外產(chǎn)生的cDNA。
[0069]圖4是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的用于受污染液體的生物整治的設(shè)備的圖示。
[0070]圖5是細(xì)菌增強(qiáng)表達(dá)盒的示意圖。圖中涉及的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)僅表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式。Prrn是指轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子是質(zhì)體16S rrn啟動(dòng)子。5’UTR(非翻譯 區(qū))表示翻譯增強(qiáng)子元件。優(yōu)選的5’UTR是來(lái)自噬菌體T7的基因
10。轉(zhuǎn)基因優(yōu)選地編碼螯合劑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑由lacZ、mtl或ppk基因編碼。3’UTR是指轉(zhuǎn)錄終止子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄終止子是質(zhì)體rpsl6終止子或大腸桿菌rrnB終止子。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄終止子是rpsl6終止子。
[0071]圖6是表示在120 μ M汞中生長(zhǎng)的表達(dá)IacZ和mtl基因的細(xì)菌的聚集的圖。圖6的圖是所觀察的聚集的Polaroid照片的示意圖。在工程化為表達(dá)IacZ基因(圖6A)和mtl基因(圖6B)的細(xì)菌的培養(yǎng)物中觀察到沉淀。
[0072]圖7闡明工程化為表達(dá)螯合劑的細(xì)菌整治汞污染的培養(yǎng)基，即使培養(yǎng)基對(duì)不表達(dá)螯合劑的細(xì)菌(“wt”)無(wú)害的能力。圖7A示出wt細(xì)菌在沒(méi)有汞的培養(yǎng)基；包含120μΜ汞的培養(yǎng)基；和經(jīng)處理的培養(yǎng)基中持續(xù)24小時(shí)的生長(zhǎng)。經(jīng)處理的培養(yǎng)基最初包含120 μ M汞并通過(guò)暴露于根據(jù)本發(fā)明工程化為表達(dá)IacZ基因的細(xì)菌120小時(shí)，隨后除去細(xì)菌細(xì)胞來(lái)處理。圖7Β示出wt細(xì)菌在沒(méi)有汞的培養(yǎng)基；包含120 μ M汞的培養(yǎng)基；和經(jīng)處理的培養(yǎng)基中持續(xù)24小時(shí)的生長(zhǎng)。經(jīng)處理的培養(yǎng)基最初包含120 μ M汞并通過(guò)暴露于根據(jù)本發(fā)明工程化為表達(dá)mtl基因的細(xì)菌120小時(shí)，隨后除去細(xì)菌細(xì)胞來(lái)處理。
[0073]圖8闡明根據(jù)本發(fā)明工程化為表達(dá)IacZ基因的細(xì)菌確定液體樣品的重金屬污染程度的用途。為了更易于目測(cè)，圖被選擇為呈現(xiàn)比色皿的Polaroid照片中捕獲的數(shù)據(jù)。(著色以其強(qiáng)度代表比色皿的Polaroid照片中觀察到的著色。)比色皿A在包含0μ M汞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；Β在包含5 μ M汞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；C在包含10 μ M汞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；且D在包含20 μ M汞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。板(panel) I示出在所指示的水平的汞的存在下生長(zhǎng)16小時(shí)之后的0D_測(cè)量結(jié)果。板II是板I中的測(cè)量結(jié)果的圖示。板III是如在板II的相應(yīng)的比色皿中的細(xì)菌，但比色皿中加入100 μ g/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-吡喃半乳糖苷(X-gal)底物每ml培養(yǎng)基。細(xì)菌與暴露于汞的水平成反比地喪失其裂解X-gal和產(chǎn)生典型藍(lán)色的能力。
[0074]圖9證明了根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)β-gal的細(xì)菌中β_半乳糖苷酶活性的減小。圖9Α是在所指示的量的汞和100μ g/ml X-gal的存在下生長(zhǎng)的細(xì)菌的照片。每一個(gè)培養(yǎng)物小瓶下面的有色棒接近小瓶中的內(nèi)容物的顏色并意圖用作與檢測(cè)試劑盒一起供應(yīng)的顏色代碼。圖9B描繪了用于容納/培養(yǎng)培養(yǎng)物的管，包括表達(dá)β -gal的細(xì)菌、X-gal和被污染流體。容器附有或伴有(attached thereto or comes accompanied by)指不細(xì)菌培養(yǎng)物在所指示的濃度的汞的存在下的預(yù)期的顏色強(qiáng)度的顏色圖表。圖9C是圖9B的示意圖。
[0075]圖10 示出表明包括 pBSK-P16S-glO-lacZ_3’ UTR( “l(fā)acZ”)、pBSK-P16S-glO-mtl-3’ UTR( “mtl”)和 pBSK-P16S-glO-ppk_3’ UTR( “ppk”)表達(dá)盒的細(xì)菌細(xì)胞系耐受包含所指示的濃度的鎘、鉛和鋅的培養(yǎng)基并在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的能力的細(xì)菌生物測(cè)定。未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株JM109用作對(duì)照。在補(bǔ)充有鋅、鎘和鉛的LB營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24h之后測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)物吸光度(0D600nm)。圖10A示出在1，000 μ M的ZnC12中生長(zhǎng)的細(xì)菌細(xì)胞系。圖10B示出在250 μ M CdCl2中生長(zhǎng)的細(xì)菌系。圖10C示出在3，000 μ M的乙酸鉛Pb (C2H3O2)2.3Η20中生長(zhǎng)的細(xì)菌克隆。
[0076]圖11示出通過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因的基因的細(xì)菌螯合汞。根據(jù)本發(fā)明的被IacZ構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在37°C在包含120 μ M汞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)120h。細(xì)菌通過(guò)離心、洗滌和再懸浮在與初始培養(yǎng)物的體積相同的體積的培養(yǎng)基中來(lái)除去。處理再懸浮的細(xì)胞(“LacZ細(xì)菌”)以釋放任何汞并通過(guò)原子吸收光譜法來(lái)分析。經(jīng)處理的培養(yǎng)基的汞濃度和表達(dá)IacZ基因的細(xì)菌的汞濃度從光譜測(cè)定法結(jié)果來(lái)計(jì)算。
[0077]在這些圖中所描繪的實(shí)驗(yàn)被執(zhí)行多次。在顯示棒偏差(bar deviation)的圖(圖1、圖2、圖3、圖7、圖10和圖11)中所描繪的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)被執(zhí)行至少三份，且棒示出在結(jié)果內(nèi)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0078]除非另外指出，否則在這些圖中所描繪的其中細(xì)菌生長(zhǎng)被測(cè)量的實(shí)驗(yàn)中，每一種培養(yǎng)物的起始接種物(“種子”)是0.01OD6c?的起始培養(yǎng)物的相等大小的等分部分。
[0079]在測(cè)試IacZ構(gòu)建體的有效性的某些實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌培養(yǎng)物(未被轉(zhuǎn)化的和被轉(zhuǎn)化的)包含200mg/ml IPTG0然而，應(yīng)注意，在IacZ基因從組成型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)中，不需要由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。
[0080]詳細(xì)描述
[0081]本發(fā)明提供了安全的、高效的和成本有效的使用螯合劑(chelation agent)/螯合劑(sequestration agent)的重金屬整治方法。優(yōu)選的實(shí)施方式集中在表達(dá)螯合劑的細(xì)菌細(xì)胞的使用上。
[0082]三種示例性螯合劑已經(jīng)在細(xì)菌中被表達(dá)，使得細(xì)菌抵抗高水平的重金屬且尤其是抵抗鉛、鎘、鋅和汞:金屬硫蛋白(mt)、多磷酸鹽激酶(ppk)和β_半乳糖苷酶蛋白。驚人地，現(xiàn)在已經(jīng)表明螯合劑基因可以產(chǎn)生高水平的表達(dá)和宿主細(xì)胞對(duì)重金屬的抗性的方式在細(xì)菌中被表達(dá)。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，采用基于非細(xì)胞的螯合劑。
[0083]在基于細(xì)菌細(xì)胞的系統(tǒng)中，螯合劑蛋白被表達(dá)，而不一定是融合蛋白的一部分。不需要mer基因的同時(shí)表達(dá)。對(duì)于表達(dá)這些基因的細(xì)菌，不需要海藻酸鹽或相似化合物的支撐床。工程化的細(xì)胞經(jīng)得起高水平的重金屬。這些驚人的觀察已經(jīng)允許開(kāi)發(fā)細(xì)胞的和基于蛋白的生物整治的有效方法，如本申請(qǐng)中所描述的。
[0084]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供載體以在宿主細(xì)菌細(xì)胞中引入和表達(dá)基因。載體是能夠在宿主細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制的核酸結(jié)構(gòu)。載體骨架可以包括轉(zhuǎn)化標(biāo)記物的基因，以指示載體對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化標(biāo)記物可以是用于從不含載體的正常細(xì)胞區(qū)分和選擇存在載體的細(xì)胞的選擇性標(biāo)記物基因。這樣的標(biāo)記物是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常使用的選擇性標(biāo)記物包括賦予對(duì)特定的抗生素例如氨芐青霉素的抗性的基因。一些載體骨架還可以包括僅僅指示哪些細(xì)胞被載體轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物基因。轉(zhuǎn)化標(biāo)記物是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。通常使用的指示劑標(biāo)記物基因是編碼β_半乳糖苷酶的IacZ基因的序列。其他通常使用的轉(zhuǎn)化標(biāo)記物包括各種螢光素酶基因和GFP。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌整治其在上面生長(zhǎng)的液體或固體表面?？蛇x擇地，固體表面通過(guò)暴露于液體而首先被浸泡/浙濾重金屬，且然后根據(jù)本發(fā)明工程化的有機(jī)體從液體除去重金屬。
[0085]載體的一個(gè)組分是包括多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的克隆位點(diǎn)，其中這些標(biāo)記物以及另外的所需的核酸序列可以被引入載體中，且通過(guò)轉(zhuǎn)化被引入細(xì)胞中。
[0086]本發(fā)明的優(yōu)選的載體是質(zhì)粒。優(yōu)選的質(zhì)粒是工程化為允許表達(dá)轉(zhuǎn)基因的遺傳序列的質(zhì)粒。存在大量的已知的和被表征的載體。參見(jiàn)，例如Stanford數(shù)據(jù)庫(kù):http://genome-www.Stanford.edu/vectordb/vector_pages/plasmid_pages/Plasmid.html,上次訪問(wèn)在2009年6月30日。允許相對(duì)容易地引入表達(dá)盒的質(zhì)粒的實(shí)例是本領(lǐng)域熟知的和商
業(yè)上可得到的。優(yōu)選的載體是pBlueSeript?
[0087]在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，提供了用于在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)螯合劑的質(zhì)粒。質(zhì)粒包括具有整合劑基因和允許質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)整合劑基因至聞水平的其他兀件的表達(dá)盒。其他元件(“基因表達(dá)元件”)包括啟動(dòng)子序列、翻譯增強(qiáng)子序列和轉(zhuǎn)錄終止序列，全部以本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解的方式在功能上連接。應(yīng)注意，盡管期望由于它們強(qiáng)烈增強(qiáng)表達(dá)的能力而選擇的全部三個(gè)表達(dá)元件的存在，但是螯合劑基因甚至在缺乏轉(zhuǎn)錄終止序列時(shí)被充分地表達(dá)至本文描述的水平。
[0088]調(diào)整特征的任何有效的組合可能產(chǎn)生令人滿意地高的和穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明優(yōu)選地用強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子來(lái)實(shí)施。預(yù)期質(zhì)粒可以包括不同類型的啟動(dòng)子，例如組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、細(xì)胞特異性的或組織特異性的啟動(dòng)子。同樣地，可能的是，以特定組合的其他有效的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和終止子可以產(chǎn)生令人滿意地高的和穩(wěn)定的表達(dá)。
[0089]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用源自質(zhì)體16S rrn基因序列的組成型啟動(dòng)子。Sriraman, P.等人，Plant Physiol.117:1495-1499 (1998)和 Yukawa, Μ.等人，PlantMolecular Biology23:359-365 (2005)。16S rrn啟動(dòng)子序列被集成為盒的功能元件。
[0090]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中提供的表達(dá)盒的另一個(gè)元件是翻譯增強(qiáng)子序列(“5’UTR”)。翻譯增強(qiáng)子序列增強(qiáng)質(zhì)粒中的轉(zhuǎn)基因蛋白序列的翻譯。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的翻譯增強(qiáng)子是噬菌體T7基因105’增強(qiáng)子元件。Olins, P.0.和Rangwala, S.H.，J.Biol.Chem.264:16973-16976(1989)。本發(fā)明中利用的增強(qiáng)子元件的序列被整合在表達(dá)盒的用于擴(kuò)增mtl、ppk和IacZ基因的合成的5’基因側(cè)翼PCR寡核苷酸(引物)內(nèi)。
[0091] 可以用于適當(dāng)?shù)纳镎尾呗缘馁|(zhì)粒的另一個(gè)元件由編碼本身是螯合劑或能夠產(chǎn)生螯合分子的酶的蛋白的基因序列組成。螯合劑蛋白和能夠產(chǎn)生螯合分子的酶兩者/任一個(gè)在本文可互換地被稱為“螯合劑(chelator agent)”或“螯合劑(sequestrationagent)”。換句話說(shuō),直接地是螯合劑或產(chǎn)生螯合分子(chelating molecule)或螯合分子(sequestering molecule)的任何基因產(chǎn)物是根據(jù)本發(fā)明的螯合劑。一些螯合劑的實(shí)例包括ppk、mtl、植物螯合肽、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和merP。
[0092]一種優(yōu)選的這樣的螯合劑是金屬硫蛋白(MT)蛋白。金屬硫蛋白(MT)是以生物學(xué)鈍化形式螯合金屬離子的富含半胱氨酸的低分子量金屬結(jié)合肽。Hamer，D.H., Annu.Rev.Biochem.55:913-51 (1986)。一種特別優(yōu)選的 mt 基因源自小鼠(“mtl 基因”)并編碼mtl蛋白。包含小鼠mtlcDNA的pCMV-SPORTIO載體獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)克隆 #MGC47147。還參見(jiàn) Strausberg, R.L.等人，Proc Natl Acad SciUSA99:16899-16903 (2002)。mtl基因通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從包含mtl基因的cDNA的質(zhì)粒pCMV-SPORTIO擴(kuò)增。mtl編碼序列的美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心序列，gi#:BC036990，用于設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)通過(guò)PCR分離mtl編碼序列用于隨后克隆的PCR擴(kuò)增引物。
[0093]另一個(gè)優(yōu)選的螯合劑基因序列是編碼多磷酸鹽激酶的ppk序列，多磷酸鹽激酶負(fù)責(zé)強(qiáng)烈螯合的多磷酸鹽的合成。無(wú)機(jī)多磷酸鹽是通過(guò)高能磷酸酐鍵連接的正磷酸鹽的帶負(fù)電荷的長(zhǎng)線型聚合物鏈。Kornberg，A.，J.Bacteriol.177:491-496(1995)。這些磷酸鹽聚合物可以在長(zhǎng)度上變化且對(duì)于所有活的有機(jī)體是普遍存在的。由PPk基因編碼的酶多磷酸鹽激酶承擔(dān)從ATP聚合Y磷酸鹽以形成長(zhǎng)的多磷酸鹽鏈。優(yōu)選的ppk基因源自細(xì)菌，尤其是源自大腸桿菌，且優(yōu)選的PPk螯合劑是從該基因表達(dá)的多磷酸鹽激酶和該多磷酸鹽激酶的多磷酸鹽產(chǎn)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，PPk基因通過(guò)PCR使用從NCBI序列NC000913設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物從大腸桿菌K12擴(kuò)增。(ppk基因是上述NCBI序列上的2.07kb區(qū)，從堿基 2，621，066 至 2，623，132。) Akiyama, M.等人，J.Biol.Chem.267:22556-22561 (1992) 和 Blattner, F.R.等人，Science.277:1453-1474 (1997)。
[0094]又一個(gè)優(yōu)選的螯合劑基因序列是源自大腸桿菌K12的半乳糖苷酶的IacZ基因序列。Κ12的3，072堿基對(duì)IacZ基因是大腸桿菌中的乳糖操縱子的一部分并表達(dá)酶β -半乳糖苷酶，該酶催化二糖例如乳糖的水解。Kalnins, Α.等人，ΕΜΒ02:593-597 (1983)。大腸桿菌β_半乳糖苷酶是可由作為輔因子的鉀和鎂離子活化的464kDa四聚體蛋白。該酶由于其代謝X-Gal的能力而已被廣泛用于分子生物學(xué)和遺傳學(xué)，X-Gal是無(wú)色改性的半乳糖，其被代謝形成亮藍(lán)色的且可以作為指示劑或報(bào)告標(biāo)記物起作用的不溶性產(chǎn)物(5-溴-4-氯吲哚)。IacZ基因通過(guò)PCR使用從NCBI序列NC_000913設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物從大腸桿菌K12基因組DNA擴(kuò)增。(IacZ是3.08kb區(qū)，從堿基362，455至365，529。)Blattner, F.R.等人，Science.277:1453-1474 (1997)。
[0095]應(yīng)注意，關(guān)于汞螯合，除非另外特別地論述，否則本發(fā)明本文通常是指并示例無(wú)機(jī)汞的螯合。然而，如果系統(tǒng)還包括功能性轉(zhuǎn)基因裂合酶，例如諸如merB基因，那么本發(fā)明還允許有機(jī)汞螯合。Ruiz, 0.等人，Plant Physiol.132:1344-1352(2003) ；Bizily S., ProcNatl Acad Sci USA96:6808 - 6813(1999)。
[0096]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中呈現(xiàn)的表達(dá)盒的另一個(gè)任選的元件由轉(zhuǎn)錄終止序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄終止序列是3’UTR不依賴P因子的轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的3’ -UTR序列的實(shí)例包括細(xì)菌的和質(zhì)體衍生的rpsl6。對(duì)于細(xì)菌的rrnB終止子序列的描述由Abe，H.等人，Genes to Cells, 4:87-97 (1999)提供。特別優(yōu)選的終止子是由Hayes, M.L.等人，Nucleic Acids Res.34:3742-3754(2006)描述的質(zhì)體衍生的 rpsl6 終止子(本文其他地方還稱為rpsT)，其中“T”代表“末端”。rpsl6基因轉(zhuǎn)錄終止子序列被整合為mtl、ppk和IacZ基因的合成的3’ PCR擴(kuò)增寡核苷酸(引物)的一部分。
[0097]產(chǎn)生包括這些遺傳元件的盒的常規(guī)方法是產(chǎn)生為轉(zhuǎn)基因的PCR引物的合成的寡核苷酸，其中兩個(gè)PCR引物分別包括5’控制元件(啟動(dòng)子、增強(qiáng)子)和3’ -UTR。雖然在上文我們描述了被采用來(lái)獲得和制備以將特定的遺傳元件轉(zhuǎn)移到表達(dá)盒中的特定的分子方法(PCR、合成的寡核苷酸等)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可選擇的引物、可選擇的設(shè)計(jì)和另外的方法學(xué)可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生表達(dá)盒和包括這些遺傳元件的轉(zhuǎn)移載體的相同的目標(biāo)。
[0098]構(gòu)建表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括功能連接的:用于表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和基因表達(dá)控制元件。上面列出的是優(yōu)選的元件:源自質(zhì)體16S rrn基因的啟動(dòng)子；源自噬菌體T7基因10的5’UTR ;和rrnB序列或rpsl6轉(zhuǎn)錄終止子(3’-UTR),優(yōu)選地rpsl6。(注意,在本專利說(shuō)明書中，rpsl6和rpsT是對(duì)于相同的3’ -UTR可互換使用的名稱。)該盒包括細(xì)菌中使用的調(diào)整元件的想不到的組合，如下面進(jìn)一步詳述的，該組合現(xiàn)在已經(jīng)被證明在細(xì)菌中提供強(qiáng)的表達(dá)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式， 本發(fā)明的載體中的表達(dá)控制序列包括強(qiáng)啟動(dòng)子和5’ UTR,優(yōu)選地16S rrn啟動(dòng)子序列和噬菌體T7基因105’ UTR0在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，載體還包括3’ UTR，優(yōu)選地rrnB或rpsl63’ UTR，還更優(yōu)選地rpsl63’ UTR0根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，細(xì)菌工程化為高度表達(dá)這些螯合劑轉(zhuǎn)基因序列。所得到的細(xì)菌抵抗高水平的重金屬污染。
[0099]作為推論，本文所描述的優(yōu)選的啟動(dòng)子5’ UTR和3’ UTR的組合包括用于高水平表達(dá)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄物和翻譯產(chǎn)物的優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)，無(wú)論被表達(dá)的轉(zhuǎn)基因是螯合劑還是一些其他基因產(chǎn)物。
[0100]用于將載體引入各種細(xì)胞和有機(jī)體的轉(zhuǎn)化方法是熟知的。例如，可以經(jīng)由氯化鈣/熱激方法(化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞方法)、電穿孔、經(jīng)由質(zhì)粒接合、粒子轟擊等等引入載體構(gòu)建體。
[0101]載體被轉(zhuǎn)化到有機(jī)體中以便表達(dá)螯合劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，載體被轉(zhuǎn)化到可以用于生物整治的有機(jī)體中，例如植物、真菌、藻類或細(xì)菌。
[0102]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，有機(jī)體是細(xì)菌。優(yōu)選的細(xì)菌是環(huán)境上普遍存在的、非挑剔生長(zhǎng)的、在天然環(huán)境中易于供養(yǎng)(sustainable)的細(xì)菌。用本發(fā)明的編碼螯合劑的表達(dá)盒和/或轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的特別優(yōu)選的細(xì)菌是大腸桿菌、假單胞菌(例如，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeuriginosa))、藍(lán)細(xì)菌(例如，共同念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostoc commune)或悅目顫藍(lán)細(xì)菌(Oscillatoriaamoena))和芽抱桿菌(例如臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus))。
[0103]在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，螯合劑基因序列是lacZ、mtl或ppk。表達(dá)β -半乳糖苷酶、金屬硫蛋白和多磷酸鹽激酶的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌被表明能夠從液體除去重金屬和汞。上文所描述的細(xì)菌構(gòu)建體已經(jīng)在汞抗性和累積方面顯著提高至先前所報(bào)告的至少8倍的水平。
[0104]β -半乳糖苷酶(“ β -gal”)是細(xì)菌中乳糖代謝所需要的四肽酶。β -gal是熟知的，這是因?yàn)槠涞鞍仔蛄性?970年公諸于眾。不知β-gal蛋白螯合重金屬或汞。如下面的實(shí)施例中所描述的，β -gal現(xiàn)在已經(jīng)被表明具有對(duì)汞的高親和力并在被過(guò)表達(dá)時(shí)有效結(jié)合萊。未知β-gal可以賦予暴露于高濃度的萊的細(xì)菌抗性。并且，β-gal防止高濃度的鎘、鋅和鉛的有害影響。[0105]當(dāng)β-半乳糖苷酶表達(dá)盒(pBSK-P16S-glO-BY-rpst)被引入細(xì)菌中時(shí)，觀察到高水平的轉(zhuǎn)錄。此外，細(xì)菌變得抵抗高濃度的汞。未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在暴露于5 μ g/ml Hg時(shí)顯示顯著的生長(zhǎng)減弱且在較高的濃度下根本不生長(zhǎng)，但是被表達(dá)β-gal的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌抵抗0、5、10、20、40、80、100、120、140和160 μ M汞的測(cè)試濃度中的每一個(gè)。圖1和圖2中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不僅經(jīng)受得住高達(dá)約140 μ M的汞濃度，而且實(shí)際上在這些汞水平下繁殖。其他數(shù)據(jù)(圖1和2中未示出)顯示被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌還在160 μ MHg下繁殖。包含質(zhì)粒的細(xì)菌容易耐受在受污染水和土壤中見(jiàn)到的相似濃度的汞，在這些濃度的汞下生長(zhǎng)和復(fù)制。
[0106]相似的實(shí)驗(yàn)證明了細(xì)菌當(dāng)根據(jù)本發(fā)明被β-gal轉(zhuǎn)化時(shí)，可以抵抗包含高達(dá)至少約250μΜ鎘(參見(jiàn)圖10)的培養(yǎng)基并在該培養(yǎng)基中復(fù)制。并且，根據(jù)本發(fā)明被β-gal轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能夠抵抗包含高達(dá)至少約1，000 μ M鋅的培養(yǎng)基并在該培養(yǎng)基中有效地復(fù)制。該相同的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌證明對(duì)高達(dá)至少約3，000 μ M鉛的抗性。
[0107]當(dāng)mtl表達(dá)盒(pBSK-P16S-glO-mtl_rpst)被引入細(xì)菌中時(shí),觀察到高水平的轉(zhuǎn)錄。參見(jiàn)圖3A。此外，細(xì)菌變得抵抗高濃度的汞。被表達(dá)mtl的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌抵抗20、40、60、80、100、120、140和160 μ M汞的汞濃度。圖1和圖2中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不僅經(jīng)受得住高達(dá)至少約160 μ M的汞濃度，而且實(shí)際上在這些汞水平下繁殖。應(yīng)注意，細(xì)菌的生長(zhǎng)速率與汞水平成比例地稍微下降。盡管如此，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生長(zhǎng)的飽和水平。包含質(zhì)粒的細(xì)菌容易耐受在受污染水和土壤中見(jiàn)到的相似濃度的汞，在這些濃度的汞下生長(zhǎng)和復(fù)制。
[0108]相似的實(shí)驗(yàn)證明了根據(jù)本發(fā)明表達(dá)mtl的細(xì)菌克隆可以抵抗包含高達(dá)至少約250 μ M鎘和高達(dá)至少1000 μ M鋅的培養(yǎng)基并在該培養(yǎng)基中復(fù)制。表達(dá)mtl的細(xì)菌克隆還呈現(xiàn)對(duì)高達(dá)至少約3，0 00 μ M鉛的抗性。參見(jiàn)圖10。
[0109]同樣地，當(dāng)PPk表達(dá)盒被引入細(xì)菌中時(shí)，觀察到高水平的轉(zhuǎn)錄。參見(jiàn)圖3B。此外，細(xì)菌變得抵抗高濃度的汞。被表達(dá)mtl的上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌抵抗20、40、60、80和IOOyM汞。圖1和圖2中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不僅經(jīng)受得住高達(dá)約100 μ M的汞濃度，而且實(shí)際上在這些汞水平下繁殖。包含質(zhì)粒的細(xì)菌容易耐受在受污染水和土壤中存在的相似濃度的汞，在這些濃度的汞下生長(zhǎng)和復(fù)制。
[0110]相似的實(shí)驗(yàn)證明了根據(jù)本發(fā)明表達(dá)ppk的細(xì)菌克隆可以抵抗包含高達(dá)約3，000 μ M鉛和1，000 μ M鋅的培養(yǎng)基并在該培養(yǎng)基中復(fù)制。另外，轉(zhuǎn)基因細(xì)菌抵抗高達(dá)約250 μ M的鎘。參見(jiàn)圖10。
[0111]清楚地，包括質(zhì)體16S rrn衍生的啟動(dòng)子、T7基因10衍生的5’ UTR和細(xì)菌衍生的rrnB或質(zhì)體衍生的rpsl63’ UTR的載體以高的拷貝數(shù)表達(dá)這些所闡明的螯合劑基因。作為推論，組合的這些表達(dá)控制序列可以用于以高的水平表達(dá)其他基因，具有如對(duì)于螯合劑基因看到的相似的拷貝數(shù)，或至少約4，000 ;4，500 ；5,000 ;5，500 ;6，000 ;6，500 ;7，000 ；7，500 ;8，000 ;8，500 全長(zhǎng)拷貝每 ng 總 mRNA。
[0112]細(xì)菌中包括強(qiáng)啟動(dòng)子和/或適當(dāng)?shù)?’ UTR和3’ UTR以造成在細(xì)菌中生產(chǎn)至少約4，000 ;4，500 ;5，000 ;5，500 ;6，000 ;6，500 ;7，000 ;7，500 ;8，000 ;8，500 全長(zhǎng)拷貝每 ng 總
mRNA的螯合劑mRNA的任何遺傳構(gòu)建體，使得包括這樣的構(gòu)建體的細(xì)菌能夠通過(guò)螯合重金屬同時(shí)抵抗包括重金屬的環(huán)境并在該環(huán)境中繁殖而有效地整治包含重金屬的液體或固體。優(yōu)選地，細(xì)菌表達(dá)約6，OOO至7，500拷貝的螯合劑每ng總mRNA。
[0113]具有包括β_半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌還可以有效地用作用于檢測(cè)汞與汞污染和溢出以及其他重金屬的生物傳感器。X-gal的裂解釋放5，5’-二溴-4，4’-二氯-靛，一種不溶性藍(lán)色化合物。在化合物X-Gal (和X-gal類似物)的存在下表達(dá)β -半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌產(chǎn)生容易地可區(qū)別的深藍(lán)色顏色反應(yīng)。然而，現(xiàn)在觀察到藍(lán)色顏色的強(qiáng)度與汞的濃度成比例下降。參見(jiàn)圖8和圖9。同樣地，其他重金屬例如鎘的存在可以具有破壞X-gal (和X-gal類似物)的裂解和藍(lán)色化合物的產(chǎn)生的相同效果。這些特征使得β-gal適合作為原位或體外生物傳感器。因此，半乳糖苷酶在細(xì)菌中的表達(dá)保護(hù)細(xì)菌免于汞的有害影響，但也降低了酶代謝乳糖和乳糖類似物例如X-gal的能力。
[0114]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于檢測(cè)重金屬的試劑盒。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，試劑盒包括流體的測(cè)試小瓶或容器、測(cè)試條上的表達(dá)半乳糖苷酶或半乳糖苷酶的細(xì)菌培養(yǎng)物、5-溴-4-氯_3_ Π引哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)和指不劑條。指不劑條包含確定半乳糖苷酶還原X-gal的程度的顏色標(biāo)記物。每一種標(biāo)記物可以具有不同色調(diào)的藍(lán)色，這樣的顏色色調(diào)通過(guò)暴露于不同濃度的重金屬例如汞來(lái)預(yù)先確定。
[0115]試劑盒用來(lái)實(shí)施檢測(cè)汞或包括鎘、鉛和鋅的其他重金屬的方法。該方法包括將測(cè)試樣品放在流體容器中的步驟。任選地，在測(cè)試樣品是固體的情況下，加入液體以從固體釋放汞/重金屬。加入X-gal。將流體與細(xì)菌培養(yǎng)物或包括β-gal蛋白的測(cè)試條接觸預(yù)定的時(shí)間段。接著，將培養(yǎng)物的顏色與指示劑條上的標(biāo)記物進(jìn)行比較以確定汞是否存在流體中和在流體中的濃度。在高的重金屬或汞濃度的一些情況下，試劑盒可以僅提供陽(yáng)性/陰性結(jié)果且并不指示全部濃度范圍。
[0116]上述試劑盒的可選擇的實(shí)施方式還可以包括一組標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品可以包括各種具有在溶液中的各種濃度的Hg的標(biāo)準(zhǔn)容器。作為非限制性實(shí)例，容器可以具有以下Hg濃度:Α:0μΜ ;Β:5μΜ ;C:10yM ;和 D:20yM。
[0117]試劑盒可以按以下方式利用。將指定體積的測(cè)試材料和液體(如果材料是固體)放在測(cè)試小瓶中，將一定體積的指示濃度的Hg標(biāo)準(zhǔn)品放在每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)小瓶中A:O μ M ;B: 5 μ M ;C: 10 μ M ;和D: 20 μ Μ。將一定體積的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌放在測(cè)試小瓶和標(biāo)準(zhǔn)小瓶中的每一個(gè)中。將X-gal加入到每一個(gè)小瓶。允許培養(yǎng)物溫育指定的時(shí)間段。優(yōu)選地，溫育時(shí)間在約I分鐘和20分鐘之間，更優(yōu)選地在5和10分鐘之間。在溫育時(shí)間結(jié)束之后，將測(cè)試小瓶的著色與標(biāo)準(zhǔn)小瓶的著色進(jìn)行比較以便確定汞在樣品中的大致濃度。
[0118]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)充分理解，可選擇的實(shí)施方式圍繞汞和其他重金屬逐漸地降低β-gal的與重金屬的濃度相關(guān)聯(lián)的裂解X-gal的能力的概念而被容易地設(shè)計(jì)。作為實(shí)例，但不限于這些實(shí)例，細(xì)菌以非液體形式(例如，凍干的)被提供，包括β-gal的細(xì)菌是細(xì)菌的環(huán)境菌株，溫育在特定的溫度下例如在37°C或在室溫下進(jìn)行，采用純化的β -gal而不是培養(yǎng)物混合物中表達(dá)β -gal基因的細(xì)菌或β -gal表達(dá)載體或β -gal酶增加著色測(cè)定可以與汞的濃度相關(guān)聯(lián)的范圍。測(cè)試樣品是固體或固體的液體洗滌物。同樣地，可選擇的顏色測(cè)定和/或用于精確地測(cè)量顏色變化的光學(xué)儀器(例如，分光光度計(jì)、比色計(jì))的使用是可能的。顏色效果增強(qiáng)技術(shù)的使用還是已知的和可能的。這些可選擇的設(shè)計(jì)和其他的是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0119] 在本發(fā)明的又一個(gè)方面，半乳糖苷酶蛋白本身，即不存在細(xì)胞載體，可以用作重金屬或汞的螯合劑，用作原位和體外應(yīng)用的溢出清理系統(tǒng)的一部分。β-gal是商業(yè)上可得到的和可以通過(guò)熟知的標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)容易地從表達(dá)酶的有機(jī)體純化。大量酶的分離可以通過(guò)其過(guò)表達(dá)和針對(duì)酶的抗體的商業(yè)可用性來(lái)促進(jìn)。為了制造目的，β-gal在細(xì)胞中的表達(dá)可以通過(guò)加入IPTG來(lái)操縱/增加。β-gal蛋白的商業(yè)供應(yīng)商是已知的，例如Sigma-Aldrich0
[0120]同樣地，金屬硫蛋白和多磷酸鹽激酶的多磷酸鹽產(chǎn)物可以獨(dú)立地，即不存在細(xì)胞載體下作為包括鋅、鎘、鉛或汞的重金屬的螯合劑用于整治努力。
[0121]此外，在本發(fā)明中已經(jīng)表明，強(qiáng)啟動(dòng)子或特定的5’ UTR和3’ UTR或優(yōu)選地強(qiáng)的質(zhì)體啟動(dòng)子、噬菌體T7增強(qiáng)子和有效的質(zhì)體衍生的轉(zhuǎn)錄終止子序列的特定組合允許金屬硫蛋白(mtl基因)、多磷酸鹽激酶(ppk基因)和β-半乳糖苷酶(IacZ基因)在細(xì)菌中表達(dá)至允許它們作為汞和其他金屬的有效的生物整治系統(tǒng)的用途和商業(yè)化的水平。上述質(zhì)粒提供能夠產(chǎn)生這些和其他轉(zhuǎn)基因的高的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯的增強(qiáng)的基因表達(dá)構(gòu)建體。
[0122]包括本發(fā)明的螯合劑的細(xì)菌獲得使得它們理想地適合于通過(guò)螯合的生物整治的性質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，它們抵抗高水平的汞，持續(xù)延長(zhǎng)的時(shí)間段。參見(jiàn)圖1和圖2。它們不僅抵抗高水平的汞，而且它們?cè)谶@些水平下繁殖。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在5 μ M汞的存在下顯示減弱的生長(zhǎng)，且在10 μ M汞下不生長(zhǎng)。相反，被表達(dá)Pkk基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在包含10 μ M汞的培養(yǎng)基中顯示很少或沒(méi)有生長(zhǎng)減弱且在高達(dá)約100 μ M汞的濃度下生長(zhǎng)。重要地，細(xì)菌繁殖隨著時(shí)間繼續(xù)。當(dāng)在汞中生長(zhǎng)120h之后測(cè)試相同的構(gòu)建體時(shí)，IacZ構(gòu)建體在高達(dá)約140 μ M汞下顯示隨著時(shí)間的進(jìn)一步生長(zhǎng)，在總生長(zhǎng)水平上與在沒(méi)有汞下生長(zhǎng)的未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不能區(qū)別。mtl構(gòu)建體在高達(dá)160 μ M汞下顯示進(jìn)一步生長(zhǎng)(雖然以稍微降低的生長(zhǎng)速率)，在總生長(zhǎng)水平上與在沒(méi)有汞下生長(zhǎng)的被轉(zhuǎn)化或未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不能區(qū)別，且在包含高達(dá)160 μ M汞的培養(yǎng)基中減弱但顯著生長(zhǎng)。ppk構(gòu)建體在高達(dá)80 μ M汞下顯示進(jìn)一步生長(zhǎng) ，在總生長(zhǎng)水平上與在沒(méi)有汞下生長(zhǎng)的未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌不能區(qū)別。PPk構(gòu)建體在0-80 μ M的任何汞濃度下顯示了小的生長(zhǎng)減弱?？赡艿氖牵姿猁}可用性對(duì)被ppk基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的生長(zhǎng)具有小的影響。
[0123]在包含120 μ M汞的液體通過(guò)暴露于包括本發(fā)明的螯合劑的細(xì)菌來(lái)處理的實(shí)驗(yàn)中顯示了流體的成功的整治。參見(jiàn)圖7。在通過(guò)暴露于轉(zhuǎn)基因細(xì)菌處理包含汞的培養(yǎng)基120h之后，從培養(yǎng)基清除掉剩余的細(xì)菌(導(dǎo)致“經(jīng)處理的培養(yǎng)基”)。將未被轉(zhuǎn)化的(“wt”)細(xì)菌種子加入到經(jīng)處理的培養(yǎng)基、包括O μ M汞的新鮮培養(yǎng)基和包括120 μ M汞的新鮮培養(yǎng)基。細(xì)菌在經(jīng)處理的培養(yǎng)基和沒(méi)有汞的新鮮培養(yǎng)基中同樣地生長(zhǎng)良好。這表明經(jīng)處理的培養(yǎng)基具有低于5 μ M的汞濃度。轉(zhuǎn)基因細(xì)菌不僅在這些高水平的汞下生長(zhǎng)，而且螯合和除去重金屬。
[0124]通過(guò)原子吸收光譜法分析產(chǎn)生的定量數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)基因細(xì)菌的整治功效。參見(jiàn)圖
11。原子吸收光譜法分析顯示在表達(dá)IacZ基因的轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌細(xì)菌中非常高水平的汞累積。表達(dá)LacZ的大腸桿菌細(xì)胞在37°C在具有120 μ M Hg的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)120小時(shí)。制備用于光譜分析的細(xì)胞和培養(yǎng)基的方法基本上是根據(jù)環(huán)境保護(hù)局方法3010Α。將細(xì)胞離心，在新鮮培養(yǎng)基中洗漆，再懸浮在小體積的培養(yǎng)基中，用70% (v/v)硝酸、30% (v/v)過(guò)氧化氫和濃HCl在95°C消化，達(dá)到等于它們生長(zhǎng)的初始體積的體積且然后通過(guò)原子吸收光譜法分析。在離心細(xì)菌細(xì)胞之后獲得的上清液培養(yǎng)基也在相似的處理之后被分析。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因細(xì)菌在從培養(yǎng)基除去汞和將高濃度的汞累積在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部上是非常有效的。如所觀察的，大部分有毒的汞見(jiàn)于轉(zhuǎn)基因細(xì)菌，而培養(yǎng)基中的汞被除去至低于5 μ M的無(wú)毒濃度。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因的IacZ大腸桿菌具有通過(guò)螯合作用生物整治被汞高度污染的液體同時(shí)最佳地生長(zhǎng)的能力。
[0125]在將被轉(zhuǎn)化細(xì)菌暴露于重金屬且尤其是汞之后，發(fā)現(xiàn)了關(guān)于這些細(xì)菌的另一個(gè)非常有用的性質(zhì)。細(xì)菌在充分累積包括汞的重金屬之后，變成較深的色調(diào)。此外，其傾向于緊密地聚集和固定。可以從容器挖出這樣的聚集的細(xì)菌，以例如吸移液體的方式抽吸，而不一定需要細(xì)菌可以在其上生長(zhǎng)的專用過(guò)濾器，或離心。聚集的細(xì)菌易于目測(cè)，因?yàn)槠鋵⒅優(yōu)樯畹纳{(diào)。參見(jiàn)圖6;圖8，板II ;和圖9，板Α。
[0126]聚集和深色調(diào)性質(zhì)可以單獨(dú)地或組合地良好地用在生物整治中。因此，本發(fā)明還提供用于從液體生物整治和吸收重金屬或汞的新穎的、簡(jiǎn)單的和低成本的機(jī)制。
[0127]根據(jù)本發(fā)明使用的一個(gè)方法包括將受污染液體放在儲(chǔ)器中的第一步驟。在隨后的步驟中，將包括表達(dá)本發(fā)明的螯合劑(sequestration agent)/螯合劑(chelation agent)的質(zhì)粒的細(xì)菌加入到受污染液體中。允許細(xì)菌生長(zhǎng)并從液體除去重金屬。當(dāng)細(xì)菌除去汞且在細(xì)胞中達(dá)到高濃度的汞時(shí)，它們從溶液沉淀并形成緊密結(jié)合的聚集體。聚集體然后用篩裝置來(lái)回收。根據(jù)需要，加入另外的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌。
[0128]另外一個(gè)例子，深的著色可用于指示過(guò)程已經(jīng)發(fā)展到需要除去細(xì)菌的點(diǎn)，或作為工藝實(shí)際上在進(jìn)行中的質(zhì)量控制，且特定的色調(diào)水平可以通過(guò)將用于汞監(jiān)測(cè)的上述這些與IacZ系統(tǒng)并聯(lián)的方法用于指示或監(jiān)測(cè)受污染環(huán)境中存在的汞的水平。
[0129]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的螯合劑的細(xì)菌形成自持生物膜(self-sustained biofilm )以用作過(guò)濾系統(tǒng)的一部分以從液體和固體基質(zhì)除去重金屬或汞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，如圖4所描述的，提供了生物整治系統(tǒng)，其包括水儲(chǔ)器104 ；多孔固體基質(zhì)108 ;在水儲(chǔ)器和/或在多孔固體基質(zhì)中的細(xì)胞生物膜100，其中包括本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體的抵抗Hg的細(xì)菌組成生物膜100 ;多孔過(guò)濾器112 ;和經(jīng)處理的水出口 116。遺傳工程化的細(xì)菌可以在多孔固體基質(zhì)108上生長(zhǎng)以形成生物膜100。
[0130]因?yàn)榧?xì)菌高度抵抗汞和其他重金屬，所以其有效地從液體除去汞，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)部累積高濃度的汞。高的汞耐受性還允許細(xì)菌細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)，這延長(zhǎng)了生物過(guò)濾器的使用壽命。細(xì)菌在過(guò)濾器上的著色可以指示它們的生物整治活性以及什么時(shí)候需要細(xì)菌替換。
[0131]在根據(jù)本發(fā)明使用的一個(gè)方法中，將受污染水裝載到水儲(chǔ)器104。允許水穿過(guò)多孔固體基質(zhì)208并接觸細(xì)胞生物膜100。生物膜中的細(xì)胞螯合重金屬污染物，例如汞。干凈的水穿過(guò)多孔過(guò)濾器112，在多孔過(guò)濾器112中除去從生物膜100移去(dislodged)的任何細(xì)胞物質(zhì)以及其他雜質(zhì)。干凈的水然后通過(guò)經(jīng)處理水出口 116釋放。
[0132]本申請(qǐng)中所描述的序列的組合可以用作各種體外系統(tǒng)、細(xì)胞系統(tǒng)和包括細(xì)菌、藻類、植物、動(dòng)物和真菌的有機(jī)體中新穎的生物整治系統(tǒng)。細(xì)胞或有機(jī)體可以被遺傳工程化為表達(dá)螯合劑，由此變得抵抗重金屬并通過(guò)螯合作用從培養(yǎng)基清除污染物。有機(jī)體可以被回收且重金屬或汞可以被回收和循環(huán)用于工業(yè)應(yīng)用。表達(dá)或包含被這些序列編碼的蛋白的體外系統(tǒng)、細(xì)胞或有機(jī)體還可以用作生物反應(yīng)器的一部分或用于土壤、水和沉積物的原位整治。[0133]在根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供包括上述重金屬或汞螯合系統(tǒng)和重金屬/汞運(yùn)輸機(jī)制的細(xì)菌細(xì)胞。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒還可以包括mer操縱子的merT和MerC基因的基因序列。質(zhì)粒然后可以被轉(zhuǎn)化到提供了將汞或其他重金屬運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)空間中和然后將汞螯合在細(xì)胞內(nèi)的能力兩者的細(xì)菌細(xì)胞中。預(yù)期mer操縱子的其他基因還可以被利用以便增強(qiáng)重金屬在細(xì)胞內(nèi)的螯合和提供對(duì)有機(jī)汞制劑例如甲基汞、二甲基汞和醋酸苯汞的抗性。可選擇地，其他重金屬運(yùn)輸系統(tǒng)可以以如本發(fā)明中所描述的方式與本發(fā)明的螯合劑組合使用。
[0134]設(shè)想可以產(chǎn)生包括編碼螯合劑的多于一個(gè)基因的細(xì)菌系統(tǒng)或其他有機(jī)體系統(tǒng)。這通過(guò)考慮到以下而更容易地制備:螯合劑的細(xì)胞代謝效應(yīng)(不同于螯合)是不同的且它們作為螯合劑的活性也是不同的(例如，直接螯合或形成多磷酸鹽分子)。因此，多于一種類型的螯合劑的存在預(yù)期被宿主細(xì)胞/有機(jī)體相對(duì)充分地耐受。
[0135]實(shí)施例1.本發(fā)明的螯合劑提供對(duì)高濃度的汞、鎘、鋅和鉛的耐受性并允許細(xì)菌在高濃度的汞、鎘、鋅和鉛的存在下生長(zhǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，將包括以商標(biāo)
pBlueScriptk (Stratagene)銷售的載體的質(zhì)粒構(gòu)建為以高水平表達(dá)轉(zhuǎn)基因。該載體中的 表達(dá)盒包括:質(zhì)體16S rrn基因啟動(dòng)子；5’ UTR翻譯增強(qiáng)子元件來(lái)自噬菌體T7基因10 ;轉(zhuǎn)基因JP3’UTR不依賴P因子的終止子，如圖5所示的。在一個(gè)實(shí)施方式中，3’UTR是葉綠體rpsl6序列。來(lái)自基因10的5’UTR從合成的寡核苷酸產(chǎn)生。其他調(diào)節(jié)序列經(jīng)由聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)構(gòu)建。遺傳元件被產(chǎn)生為包括在每一個(gè)元件的末端附近的方便的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見(jiàn),例如,Sambrook, J.和Rusell, D., Molecularcloning: A laboratory manual (分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)).Cold Spring Harbor Labpress, Cold Spring Harbor, NY (2001)。產(chǎn)生多個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建體，其中轉(zhuǎn)基因編碼lacZ、mtl或
ppko
[0136]包含這些構(gòu)建體的細(xì)菌克隆在包含不同濃度的HgC12的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)16小時(shí)，如圖1所示的。在圖1中，圖1A表示未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株JM109，圖1B表示包括PBSK-P16S-glO-lacZ-3’ UTR載體的轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌，圖1C表示包括pBSK-P16S-glO-mtl-3’ UTR載體的轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌，且圖1D表示攜帶pBSK-P16S-glO-ppk-3’UTR載體的轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌克隆。將種子細(xì)菌接種物加入到細(xì)菌培養(yǎng)物燒瓶中，并將該燒瓶在37°C以用于培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)物的典型方式搖動(dòng)溫育。在16小時(shí)溫育時(shí)間結(jié)束時(shí)，在0D600nm測(cè)量培養(yǎng)基(culture media)的吸光度。
[0137]幾乎相同的構(gòu)建體(但沒(méi)有P16S啟動(dòng)子元件)還被工程化和被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌。在這些P16-構(gòu)建體(P16minus construct)中,P16S啟動(dòng)子從載體中去除，IacZ啟動(dòng)子(thepromoter was off the vector, a IacZ promoter)。包括這些 P16S-構(gòu)建體的工程化的細(xì)菌也顯示出在高水平的汞下增加的抗性和生長(zhǎng)。例如，mtl基因構(gòu)建體經(jīng)受得住高達(dá)約20 μ MHg，且ppk構(gòu)建體經(jīng)受得住高達(dá)約40 μ M Hg。然而，清楚地，通過(guò)比較，包括P16S元件的構(gòu)建體能夠經(jīng)受得住顯著更高水平的汞。
[0138]看來(lái)當(dāng)兩種蛋白被以較低水平表達(dá)時(shí)，例如在pBSK-glO-mtl-rpsT和pBSK-glO-ppk-rpsT載體的情況下，多磷酸鹽激酶比金屬硫蛋白提供了更好的對(duì)Hg的抗性。當(dāng)這些蛋白被過(guò)表達(dá)時(shí)，金屬硫蛋白比多磷酸鹽激酶提供更高的對(duì)抗Hg的有毒影響的保護(hù)。本發(fā)明不受具體的螯合劑的任何作用機(jī)理限制。盡管如此，以相對(duì)較低或較高水平表達(dá)PPk或mtl的細(xì)菌中的對(duì)汞的抗性的差異可以由兩種蛋白的作用機(jī)理來(lái)解釋。在金屬硫蛋白的情況下，因?yàn)槠渲苯域螲g，所以較高的表達(dá)水平等于較高的抗性水平。這不同于多磷酸鹽激酶，多磷酸鹽激酶可以甚至在較低的酶濃度下產(chǎn)生較高水平的多磷酸鹽，這是因?yàn)槠涫敲?。在較高的酶濃度下，Hg抗性的增量可能低于所預(yù)期的，這是因?yàn)槊傅孜镌诩?xì)胞中的可用性可能供應(yīng)不足，由此限制其活性。多磷酸鹽激酶承擔(dān)了從ATP聚合Y磷酸鹽以形成長(zhǎng)的多磷酸鹽鏈。
[0139]圖1中概括的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示未被螯合劑轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(“wt”)可以在包含高達(dá)約5 μ M Hg的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，雖然生長(zhǎng)在暴露于5 μ M汞之后減弱。用指示的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌顯示當(dāng)以在20 μ M至高達(dá)約:40 (pkk) ；80 ( β -gal) ;80 (mtl) μ M萊范圍內(nèi)的萊濃度下生長(zhǎng)時(shí)在16小時(shí)時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)。在相似的實(shí)驗(yàn)中，如圖2所示的，轉(zhuǎn)基因的大腸桿菌可以甚至在較高濃度的汞的存在下繼續(xù)生長(zhǎng)，且培養(yǎng)物在以下LB培養(yǎng)基中溫育120小時(shí)之后實(shí)現(xiàn)較高的密度:包含各種指示的濃度的Hg，高達(dá)約以下的汞濃度:對(duì)于ppk構(gòu)建體的100 μ M ;對(duì)于β -gal構(gòu)建體的140 μ M ;和對(duì)于mtl構(gòu)建體的160 μ Μ。因此，細(xì)菌抵抗這些高濃度的汞并在這些高濃度的汞下繼續(xù)生長(zhǎng)。
[0140]實(shí)施例2.本發(fā)明的構(gòu)建體(pBSK-P16S_glO-螯合劑_3’ UTR)將螯合劑元件轉(zhuǎn)錄至非常高的水平。mRNA從未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌和表達(dá)mtl和ppk的細(xì)菌克隆收集。總細(xì)胞RNA通過(guò)使用RNeasy微量試劑盒(RNeasy Mini Kit, Qiagen)和方案從在37°C在300rpm攪拌下在Luria Bertani (LB)肉湯中生長(zhǎng)16小時(shí)的Iml細(xì)菌克隆和未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109培養(yǎng)物分離。RNA樣品用100 μ g/ml的濃度的DNA酶I處理。樣品通過(guò)隨機(jī)引物擴(kuò)增使用AccuScript cDNA試劑盒(Stratagene)來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化和逆轉(zhuǎn)錄。cDNA通過(guò)定量實(shí)時(shí)PCR使用具有擴(kuò)增后融化曲線分析的兩步驟實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增程序來(lái)分析。從合成的寡核苷酸產(chǎn)生基因特異性標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量。使用轉(zhuǎn)基因特異性引物的實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)生與mRNA模板成比例的量的cDNA。用作來(lái)自未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的模板mRNA的對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因特異性mRNA的拷貝數(shù)被計(jì)算和歸一化為存在的總mRNA。如圖3中可以見(jiàn)到的，克隆包含約7，000拷貝的每一種轉(zhuǎn)錄物每ng總mRNA。用包括Β-gal元件的構(gòu)建體獲得了相似的數(shù)據(jù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這些數(shù)字表示轉(zhuǎn)基因被轉(zhuǎn)錄至非常高的水平。
[0141]實(shí)施例3.包含本發(fā)明的螯合劑的細(xì)菌當(dāng)它們累積汞時(shí)形成聚集體。當(dāng)細(xì)菌在足夠高的濃度的汞中生長(zhǎng)或在較低濃度下生長(zhǎng)足夠長(zhǎng)的時(shí)間時(shí)觀察到深的著色、聚集和沉淀。例如，如圖 6 所示的，pBSK-P16S-glO(5’ UTR)-mtl_3，UTR( “mtl”)和 pBSK_P16S-glO(5’UTR)-lacZ-3’UTR(“l(fā)acZ”)樣品在包含UOyMHg的LB培養(yǎng)基中溫育之后形成在容器的底部累積的聚集體。用在80 μ M汞的存在下生長(zhǎng)的包括mtl或ppk基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌也觀察到相似的效應(yīng)。在約24小時(shí)之后觀察到變化且它們隨時(shí)間與累積成比例增加。三個(gè)細(xì)菌克隆全部在攪拌(以約280rpm)下在15ml錐形管中生長(zhǎng)。在攪拌期間出現(xiàn)聚集和沉淀，而不需要靜止溫育。所測(cè)試的三種螯合劑中的每一種都出現(xiàn)這些顏色變化和沉淀效應(yīng)。
[0142]這提供細(xì)菌應(yīng)何時(shí)被除去和替換的目視指示劑。該效應(yīng)使得通過(guò)簡(jiǎn)單地從液體篩分細(xì)菌而容易除去已經(jīng)累積大量汞的細(xì)菌。
[0143]已經(jīng)在細(xì)菌克隆pBSK-P16S-glO-mtl_rpsT 和 pBSK-P16S-glO-ppk_rpsT 中觀察到這些聚集和沉淀效應(yīng)。因此，看來(lái)不是基因型的直接功能，而是對(duì)汞的抗性和在細(xì)胞中累積汞的功能。僅在已經(jīng)在等于或高于80 μ M的汞濃度下生長(zhǎng)至少24小時(shí)的時(shí)間段的細(xì)菌中觀察到聚集和沉淀。在較低的汞濃度下，細(xì)胞將可能需要暴露于低濃度的汞較長(zhǎng)的時(shí)間段。盡管如此，在細(xì)菌已經(jīng)累積足夠的汞后，在較低濃度的汞下也出現(xiàn)顏色變化、聚集和沉淀。
[0144]累積汞的轉(zhuǎn)基因細(xì)菌獲得深的顏色，這用作細(xì)胞中高的汞濃度的指示。細(xì)胞的加深可以在40 μ M Hg或更高下察覺(jué)到。聚集、沉淀和著色效應(yīng)是在細(xì)菌細(xì)胞累積高的汞濃度之后識(shí)別和回收細(xì)菌細(xì)胞的非常有用的特征；它們可以是有用的標(biāo)記物以確定細(xì)胞何時(shí)即將從正被清潔的環(huán)境收獲，且還可以幫助降低將這些細(xì)菌系統(tǒng)應(yīng)用于汞生物整治的成本。這是由于累積高濃度的汞而在細(xì)菌細(xì)胞中觸發(fā)的形態(tài)學(xué)變化的第一報(bào)告。
[0145]實(shí)施例4.在通過(guò)暴露于包括本發(fā)明的構(gòu)建體的細(xì)菌來(lái)處理培養(yǎng)基之后，經(jīng)處理的培養(yǎng)基基本上不含重金屬；萊被螯合。如圖7所不的,將未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109在沒(méi)有汞(O μ Μ)的LB培養(yǎng)基中、在經(jīng)處理的培養(yǎng)基中和在具有120 μ M HgCl2濃度的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0146]經(jīng)處理的培養(yǎng)基是初始包含UOyMHgCl2且細(xì)菌克隆pBSK-Prrn-5’UTR-lacZ-3’UTR 或 pBSK-Prrn-5’UTR-mtl-3’UTR 在其中生長(zhǎng) 120 小時(shí)的 LB培養(yǎng)基。通過(guò)以13，OOOrpm離心2分鐘從液體培養(yǎng)基除去細(xì)菌細(xì)胞，且通過(guò)使液體培養(yǎng)基穿過(guò)0.22 μ M過(guò)濾器以除去從離心過(guò)程留下的任何轉(zhuǎn)基因細(xì)菌細(xì)胞而使液體培養(yǎng)基滅菌。
[0147]經(jīng)處理的培養(yǎng)基用未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109再接種。在圖7Α示出的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)處理的培養(yǎng)基是用包括pBSK-Prrn-5’UTR-lacZ-3’UTR(“l(fā)acZ”)構(gòu)建體的細(xì)菌處理的培養(yǎng)基。在圖7B示出的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)處理的培養(yǎng)基是用包括pBSK-Prrn-5 ’ UTR-mt 1_3 ’ UTR (“mt I ”)構(gòu)建體的細(xì)菌處理的培養(yǎng)基。允許未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在相應(yīng)的經(jīng)處理的培養(yǎng)基中在37°C在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)16小時(shí)，且然后測(cè)量培養(yǎng)物的OD6tltl吸光度。結(jié)果顯示未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在通過(guò)轉(zhuǎn)基因細(xì)菌處理的培養(yǎng)基中的正常生長(zhǎng)速率。作為對(duì)照，包含120 μ M Hg的新鮮培養(yǎng)基也被過(guò)濾滅菌并加入大腸桿菌JM109細(xì)菌。未被轉(zhuǎn)化的JM109細(xì)菌不能夠在包含UOyMHgCl2的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。參見(jiàn)圖7Α和圖7Β。這表明本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因克隆可以用于整治處理包含非常高濃度的汞的液體。該處理將Hg降低至無(wú)毒水平(小于約5μΜ)并允許大腸桿菌JM109的正常生長(zhǎng)。
[0148]實(shí)施例5.汞被螯合在細(xì)菌內(nèi)；轉(zhuǎn)基因細(xì)菌將汞降低至亞細(xì)菌抑制劑量。為了證實(shí)β -半乳糖苷酶可以作為螯合劑，我們對(duì)從在具有120 μ M Hg的LB培養(yǎng)基中的5ml培養(yǎng)物在120小時(shí)之后獲得的pBSK-P16S-glO-lacZ-rpsT細(xì)菌小球(pellet)進(jìn)行冷蒸汽原子吸收光譜法(CVAAS)分析。將細(xì)胞通過(guò)離心從培養(yǎng)物除去，洗滌并再懸浮在Iml LB培養(yǎng)基中。遵循 EPA 方法 30IOA (EPA 方法 3010A.Methods for Chemical Analysis of Water andWastes (用于化學(xué)分析水和廢物的方法)；美國(guó)環(huán)境保護(hù)局:Washington, DC, 1992)將細(xì)胞和上清液?jiǎn)为?dú)地酸消化，使得達(dá)到5ml體積以維持初始的Hg比例，且然后通過(guò)CVAAS來(lái)分析。結(jié)果表明IacZ細(xì)菌克隆對(duì)于從培養(yǎng)基除去Hg是非常有效的，累積等于116 μ M的濃度的Hg(圖11)。在120小時(shí)處理之后留在培養(yǎng)基中的濃度是2.7 μ M(圖11)。這些結(jié)果證實(shí)了顯示未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在用pBSK-P16S-glO-lacZ-rpsT細(xì)菌克隆事先處理的培養(yǎng)基中非常好地生長(zhǎng)的結(jié)果。從兩個(gè)研究明白的是，轉(zhuǎn)基因細(xì)菌能夠從液體培養(yǎng)物除去Hg至低于5μ M的水平。
[0149] 實(shí)施例6.半乳糖苷酶生物測(cè)定.汞降低β-gal裂解X-gal的能力.如圖8所示的，包括pBSK-P16S-glO-lacZ-rpsl6質(zhì)粒的細(xì)菌克隆在所指示的Hg+2濃度下生長(zhǎng)。板I示出在O至20 μΜ Hg+2范圍內(nèi)的Hg+2濃度下16小時(shí)之后的細(xì)菌生長(zhǎng)測(cè)量結(jié)果(OD_J。然后對(duì)在所指示的Hg濃度下生長(zhǎng)的每一種細(xì)菌制備雙份比色皿。參見(jiàn)板II和板III。將100 μ g/ml X-gal加入到板III的比色皿。觀察到X-Gal至藍(lán)色顏色的轉(zhuǎn)化的降低與汞濃度的增加成比例，一直到20 μ M Hg+2。如板I和板II中觀察到的，轉(zhuǎn)基因克隆的細(xì)菌生長(zhǎng)不受在該濃度范圍內(nèi)的增加的汞濃度影響。這表明藍(lán)色顏色的降低是β-gal酶促活性的降低的因素而不是由于缺乏細(xì)菌生長(zhǎng)。
[0150]為了更易于目測(cè)，圖8在板II和板III中呈現(xiàn)了包含樣品的實(shí)際比色皿的照片的圖。圖中的明暗是根據(jù)照片的明暗，并保存包含暴露于不同濃度的Hg的細(xì)菌的比色皿的相對(duì)暗度。板II是示出在O至20 μ M Hg+2中16小時(shí)之后的細(xì)菌生長(zhǎng)的比色皿的照片的精確圖再現(xiàn)。板III是示出β_半乳糖苷酶對(duì)Hg+2的增加的暴露和螯合作用降低了該酶將X-gal底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色顏色代謝物的能力的比色皿的照片的精確圖再現(xiàn)。Α:0 μ M ;Β:5 μ M ;C: 10 μ M ;D:20 μ Μ。板II和板III中的比色皿“D”的色調(diào)在視覺(jué)上是相同的。
[0151]圖9板A示出相似實(shí)驗(yàn)的實(shí)際照片，其中表達(dá)β-gal的細(xì)菌克隆在37°C在100 μ g/ml x-gal和所指示的濃度的汞的存在下生長(zhǎng)16小時(shí)。如可以見(jiàn)到的，在40 μ M汞下生長(zhǎng)的培養(yǎng)物開(kāi)始發(fā)展較深的顏色。該顏色變深是細(xì)胞中被螯合的汞累積的效應(yīng)。在每一個(gè)小瓶底部的有色棒是被開(kāi)發(fā)為模擬/捕獲培養(yǎng)物當(dāng)暴露于所指示的濃度的汞時(shí)的色調(diào)的顏色編碼條。
[0152]圖9板B示出用于檢測(cè)重金屬污染的原型試劑盒。提供容器，其中加入測(cè)試液體以及濃的X-gal和表達(dá)β-gal的構(gòu)建體或純化的β-gal。附接于培養(yǎng)管或在附近的是顏色代碼圖，以允許目測(cè)比較測(cè)試結(jié)果與顏色圖。圖A是圖9B中的試劑盒的示意圖。在標(biāo)準(zhǔn)化條件下溫育一段時(shí)間之后，將培養(yǎng)物的顏色與顏色圖表進(jìn)行比較。
[0153]實(shí)施例7.螯 合劑提供對(duì)鋅、鎘和鉛的抗性。未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109( “wt”)和表達(dá)lacZ、mtl和ppk基因的細(xì)菌培養(yǎng)物中的每一種用0.01OD600的細(xì)菌接種并在補(bǔ)充有1,000 μ M ZnCl2 (圖 10 板 Α) ;250 μ M CdCl2 (板 B);和 3，000 μ M Pb (C2H3) 2) 2.3Η20 (板 C)的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24h。如圖10中可以見(jiàn)到的，wt細(xì)菌顯示對(duì)這些毒素的某一水平的抗性。然而，轉(zhuǎn)基因細(xì)菌的抗性顯著更大。很可能，這些細(xì)菌克隆可以在還更高水平的鋅、鎘和鉛的存在下繼續(xù)生長(zhǎng)良好。包含ppk的克隆對(duì)鎘示出僅有限的抗性?？寺≡阢U補(bǔ)充的培養(yǎng)基中顯示減弱的但顯著的生長(zhǎng)。所有三種被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在鋅中的生長(zhǎng)以及mt和β-gal克隆在鎘中的生長(zhǎng)基本上不受阻礙。作為對(duì)照，wt和所有三種被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌株在沒(méi)有補(bǔ)充重金屬的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)同樣良好(數(shù)據(jù)未示出)。
[0154]上述本發(fā)明應(yīng)結(jié)合所附的權(quán)利要求和附圖來(lái)閱讀。實(shí)施方式和實(shí)施例的描述使得人們能夠?qū)嵺`本發(fā)明的各種實(shí)現(xiàn)，且它們并不意圖將本發(fā)明限制于優(yōu)選的實(shí)施方式，而是作為本發(fā)明的特定的實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，他們可以容易地將所公開(kāi)的概念和具體的實(shí)施方式用作用于修改或設(shè)計(jì)用于進(jìn)行本發(fā)明的相同的目的的其他方法和系統(tǒng)的基礎(chǔ)。
[0155]本文引用的包括出版物、專利申請(qǐng)、專利和網(wǎng)站內(nèi)容的所有參考文獻(xiàn)據(jù)此通過(guò)引用并入，達(dá)到如同每一個(gè)參考文獻(xiàn)單獨(dú)地和明確地被表明通過(guò)引用并入且在本文中以其整體提出的相同程度。
[0156]在描述本發(fā)明的上下文中的術(shù)語(yǔ)“一(a)”和“一(an)”以及“該(the) ”和相似的指示物的使用被解釋為覆蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)兩者，除非本文另外表明或明顯地同上下文相矛盾。
[0157]除非本文另外表明，本文的值的范圍的列舉僅意圖用作單獨(dú)地指代落入該范圍的每一個(gè)單獨(dú)的值的速記方法，且每一個(gè)單獨(dú)的值被并入說(shuō)明書中，如同其單獨(dú)地在本文被列舉。詞語(yǔ)“約”當(dāng)伴隨數(shù)值時(shí)應(yīng)被解釋為表示達(dá)到所陳述的數(shù)值的10%且包括所陳述的數(shù)值的10%的偏差。除非另外要求，本文提供的任何和所有的實(shí)例或示例性的語(yǔ)言(“例如”或“諸如”)的使用，僅意圖更好地闡明本發(fā)明且并不造成對(duì)本發(fā)明的范圍的限制。說(shuō)明書中的語(yǔ)言不應(yīng)被解釋 為表示對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐必要的任何非要求保護(hù)的要素。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)菌，所述細(xì)菌包括選自以下的轉(zhuǎn)基因螯合劑:mt、ppk和β-半乳糖苷酶(IacZ), 其中所述螯合劑不是融合蛋白，且 其中所述細(xì)菌抵抗20 μ M和100 μ M之間的Hg。
2.—種細(xì)菌，所述細(xì)菌包括選自以下的轉(zhuǎn)基因螯合劑:mt、ppk和β-半乳糖苷酶(IacZ), 其中所述細(xì)菌不包括用于重金屬運(yùn)輸功能的轉(zhuǎn)基因mer操縱子劑，且 其中所述細(xì)菌抵抗20 μ M和100 μ M之間的Hg。
3.如權(quán)利要求2所述的細(xì)菌，所述細(xì)菌包括選自以下的轉(zhuǎn)基因螯合劑:mt、ppk和β -半乳糖苷酶(IacZ)， 其中所述螯合劑不是融合蛋白。
4.一種細(xì)菌，所述細(xì)菌包括選自以下的轉(zhuǎn)基因螯合劑:mt、ppk和β-半乳糖苷酶(IacZ), 其中所述螯合劑基因被工程化用于在所述細(xì)菌借以抵抗20 μ M和100 μ M之間的Hg的水平表達(dá)。
5.一種用于從液 體清除汞、鎘、鋅或鉛污染的方法，所述方法包括: 將表達(dá)轉(zhuǎn)基因mt、ppk或β -半乳糖苷酶螯合劑的細(xì)菌培養(yǎng)物加入所述液體中， 其中所述細(xì)菌培養(yǎng)物中的細(xì)菌抵抗20 μ M直至約100 μ M汞之間的汞濃度、約200 μ M之上直至約250 μ M的鎘濃度、約500 μ M之上直至約1000 μ M的鋅濃度或約250 μ M之上直至約3，000 μ M的鉛濃度，和 在足以允許所述汞的螯合的一段時(shí)間之后從所述液體除去所述細(xì)菌。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)菌不包含用于重金屬運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)基因mer操縱子基因。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述螯合劑不是融合蛋白。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述螯合劑不是融合蛋白。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述螯合劑基因被工程化用于在細(xì)菌借以抵抗.20 μ M和100 μ M之間的汞、約200 μ M之上直至約250 μ M的鎘濃度、約500 μ M之上直至約.1000 μ M的鋅濃度或約250 μ M之上直至約3，000 μ M的鉛濃度的水平表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C02F101/20GK103992980SQ201410165439
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2009年8月20日
【發(fā)明者】奧斯卡·魯伊斯 申請(qǐng)人:泛美波多黎各大學(xué)