一株好氧降解吲哚的貪銅菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株好氧降解吲哚的貪銅菌及其應(yīng)用，屬于微生物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該菌株分離自大連黑石礁海邊泥土樣品，2014年6月4日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCCNo.9265。菌株IDO為革蘭氏陰性菌，短桿狀，經(jīng)16SrRNA基因序列測定，其與Cupriavidus具有較高的相似性，因此該菌分類命名為Cupriavidussp.IDO，菌株16SrRNA基因序列的GenBank登錄號為KJ875862。該菌株利用多種芳香化合物作為唯一碳源生長，對吲哚具有較高的降解能力，菌株還具有較好的pH和溫度耐受性，顯示了其在含高濃度吲哚廢水處理中的應(yīng)用前景。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株好氧降解吲哚的貪銅菌及其應(yīng)用，屬于微生物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。 一株好氧降解吲哚的貪銅菌及其應(yīng)用

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著工業(yè)的發(fā)展，我國的水污染情況日益嚴峻。焦化廢水、制藥廢水等工業(yè)廢水中 都含有大量的氮雜環(huán)化合物，對環(huán)境危害嚴重。吲哚是工業(yè)廢水中常見的氮雜環(huán)有機污染 物之一，具有較高的流動性和水溶性，因此對自然環(huán)境和人類健康存在潛在的危害。
[0003] 與物理化學(xué)法相比較，生物法具有對人和環(huán)境影響小、條件溫和、成本低等優(yōu)點， 因此在污染物處理中得到廣泛應(yīng)用。目前，國內(nèi)外已有學(xué)者篩選到對吲哚具有降解能力的 菌株，如綠膿假單胞菌aerwgifliosa)、產(chǎn)堿桿菌sp.)等細 菌，黑曲霉菌（^5/76?/^ |77/^/>5/7/1§'6?/')、嗜熱性側(cè)抱霉菌（5)90/'0(/'/<^?7?從6?/--0/7力27(9)和擬 莖點霉菌等真菌都能以n引哚為唯一碳源進行生長。然而，這 些菌株降解吲哚的速率有限，目前為止報道最高的吲哚降解速率為60小時內(nèi)降解100 mg/ L的吲哚。因此挖掘新的吲哚降解菌資源，加速吲哚的生物降解研究顯得尤為重要。
[0004] 貪銅菌屬是近年來受到普遍關(guān)注的可以用于治理環(huán)境污染的細菌，該菌屬可以降 解多數(shù)芳香污染物，且可以應(yīng)用于修復(fù)重金屬污染等領(lǐng)域，但國內(nèi)目前對于該菌屬研究不 多。本發(fā)明采用的貪銅菌sp. ID0不僅能以吲哚為唯一碳源進行生長，而且 吲哚降解速率與已有報道具有明顯的優(yōu)勢，因此該菌在吲哚廢水處理中具有潛在的應(yīng)用前 旦 -5^ 〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一株好氧降解吲哚的貪銅菌及其應(yīng)用，該菌株能利用多種 芳香化合物作為唯一碳源生長，對吲哚具有較高的降解能力，菌株還具有較好的pH和溫度 耐受性，其在含高濃度吲哚廢水處理中的應(yīng)用前景。
[0006] 本發(fā)明所涉及的一株好氧降解吲哚的貪銅菌（拉丁文分類命名為： Opriahi/ttssp. ID0)，所述菌株的登記入冊編號為CGMCCNo. 9265,保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中 國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2014年6月4日。所述菌株屬于貪銅菌屬，是革蘭氏 陰性菌，菌體為短桿狀，其16S rRNA基因序列Genbank登錄號為KJ875862。
[0007] 所述菌株分離自大連黑石礁海邊泥土樣品，其純化分離及生長培養(yǎng)基為無機鹽培 養(yǎng)基，無機鹽培養(yǎng)基的組成為：2. 0 g/L (NH4)2S04、2. 0 g/L KH2P04、3. 28 g/L Na2HP04*12H20 和0.00025 g/L FeCl3，在121 °C高溫高壓滅菌20 min的無機鹽培養(yǎng)基中按要求添加0-250 mg/LD引哚，30°C，150 rpm條件震蕩。
[0008] 所述菌株應(yīng)用于吲哚的降解，在24小時內(nèi)，菌株ID0在pH 5.0-8.0的范圍內(nèi)對 100 mg/L吲哚的降解率保持在85%以上。
[0009] 本發(fā)明的有益效果是：該菌株分離自大連黑石礁海邊泥土樣品，菌株ID0為革蘭 氏陰性菌，短桿狀，經(jīng)16S rRNA基因序列測定，其與Q/priahdfe具有較高的相似性，因 此該菌分類命名為Ci/Ariarii/iAssp· IDO,菌株16S rRNA基因序列的GenBank登錄號為 KJ875862。該菌株利用多種芳香化合物作為唯一碳源生長，包括苯甲酸、色氨酸、苯酚、兒茶 酚、水楊酸、靛紅等，對吲哚具有較高的降解能力，能在18小時內(nèi)完全降解100 mg/L的吲 哚，菌株能耐受200 mg/L吲哚。在24小時內(nèi)，菌株IDO在pH 5.0-8. 0的范圍內(nèi)對100 mg/ L吲哚的降解率保持在85%以上，顯示了其在含高濃度吲哚廢水處理中的應(yīng)用前景及具有 能夠處理實際焦化廢水的應(yīng)用潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是一株貪銅菌株ID0電鏡圖片。
[0011] 圖2是一株貪銅菌株ID0對不同吲哚濃度的降解曲線。
[0012] 圖3是一株貪銅菌株ID0在不同溫度下對吲哚的降解率。
[0013] 圖4是一株貪銅菌株ID0在不同起始pH下對吲哚的降解率。

【具體實施方式】
[0014] 實驗材料和試劑 1.菌株：菌株ID0由本發(fā)明人2014年從大連黑石礁海邊泥土樣品中分離獲得，菌種以 吲哚為唯一碳源培養(yǎng)，經(jīng)過反復(fù)平板涂布分離純化，得到純培養(yǎng)物。
[0015] 2.培養(yǎng)基 無機鹽培養(yǎng)基：2.0 g/L (NH4)2S04, 2.0 g/L ΚΗ2Ρ04, 3.28 g/L Na2HP04*12H20,0.00025 g/L FeCl3。
[0016] 無機鹽固體培養(yǎng)基：無機鹽培養(yǎng)基+ 2%瓊脂。
[0017] 實施例1 :貪銅菌菌株的獲得 將來源于大連黑石礁海邊泥土樣品經(jīng)過稀釋平板涂布后，將樣品涂布在1/10 LB (NaCl 1 g/L、蛋白胨1 g/L、酵母粉0.5 g/L，pH=7,吲哚100 mg/L)平板上，30°C培養(yǎng)，挑 取單菌落用無機鹽培養(yǎng)基（(NH4)2S0 4 2.0 g/L、KH2P04 2.0 g/L、Na2HP04*12H20 3.28 g/L、 FeCl3 0.00025 g/L、吲哚 100 mg/L)培養(yǎng)，30°C，pH 7.0,150 rpm 下獲得菌液。IDO 的細胞 形態(tài)為短桿狀，大小為0.5 μπι左右，如圖1。
[0018] 實施例2 :菌株的16S rRNA分子鑒定 挑取無機鹽固體培養(yǎng)基平板上生長的單菌落溶于10 μ?滅菌水中，99°C變性后離心取 上清液作為 PCR 擴增反應(yīng)的模板。使用 TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit,以Forward primer/Reverse primer 2為引物，擴增目的片斷。PCR反應(yīng)體系總體積 為 50 KL:PCR Premix 25 KL，F(xiàn)orward Primer 0.5 KL，Reverse Primer 20.5 KL，模板DNA 5 μ?，無菌超純水19 μ?。PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5 min，經(jīng)過30個循環(huán)，其中，94°C 變性1 min，55°C退火1 min，72°C延伸1.5 min，30個循環(huán)后，再于72°C延伸5 min，取5 μ? PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測。使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0 (大連寶生物公司TaKaRa)切膠回收PCR產(chǎn)物。16S rRNA序 列的測序工作上海生工生物工程有限公司完成。測序結(jié)果在Genbank中進行Blast比對， 結(jié)果顯示與其序列相似性達到99%的均為貪銅菌識riahdkssp.)，因此將菌株ID0歸屬 于貪銅菌屬。
[0019] >ID0 16S rRNA gene sequence TGCAGTCGAACGGCAGCACGGGGGCAACCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTG CCCTGTTGTGGGGGATAACTAGTCGAAAGATTAGCTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGACCGTAA GGCCTCGCGCAATAGGAGCGGCCGATGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGGCGACGATCAGTA GCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAAT TTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGT CCGGAAAGAAATGGCCTGGGTTAATACCTCGGGTCGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAA GACAGGCGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATGGCGCTTGTGACTGCAAGGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTA GAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGACGTCAC TGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACT AGTTGTTGGGGATTCATTTCTTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATT AAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTT ACCTACCCTTGACATGCCACTAACGAAGCAGAGATGCATTAGGTGCCCGAAAGGGAAAGTGGACACAGGTGCTGCAT GGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCTAGTTGCTACGA AAGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGG GTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTGCGTACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACGC ATCGTAGTCCGGATCGTAGTCTGCAACTCGACTACGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCG GTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAA CCGCAAGGAG 實施例3 :貪銅菌IDO的底物廣譜性測定 利用實施例1中的菌液，采用無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)，5%接菌量，具體考察了菌株IDO以多 種化合物為唯一碳源生長，包括苯甲酸、色氨酸、苯酚、兒茶酚、水楊酸、龍膽酸、吲哚、靛紅、 喹啉、吡啶、萘、菲、聯(lián)苯等，各種化合物濃度為50 mg/L。表1為貪銅菌ID0在不同化合物為 唯一碳源的培養(yǎng)基中的作用情況。
[0020] 表1貪銅菌ID0的底物廣譜性考察

【權(quán)利要求】
1. 一株好氧降解n引哚的貪銅菌（CopriariiAAssp. IDO)，其特征在于：所述菌株的登記 入冊編號為CGMCC No. 9265,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保 藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為 2014年6月4日。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株好氧降解吲哚的貪銅菌，其特征在于：所述菌株的培養(yǎng) 條件：無機鹽培養(yǎng)基的組分為 2.0 g/L (NH4)2S04、2. 0 g/L KH2P04、3. 28 g/L Na2HP04*12H20 和0.00025 g/L FeCl3，在121 °C高溫高壓滅菌20 min的無機鹽培養(yǎng)基中按要求添加0-250 mg/LD引哚，30°C，150 rpm條件震蕩。
3. 權(quán)利要求1所述的一株好氧降解吲哚的貪銅菌應(yīng)用于吲哚的降解。
【文檔編號】C02F3/02GK104099274SQ201410335175
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】曲媛媛, 馬橋, 張照婧, 沈娥, 王經(jīng)偉, 沈文麗, 李端行, 李會杰, 劉紫嫣, 周集體 申請人:大連理工大學(xué)