一種耐重金屬根瘤菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐重金屬根瘤菌，所述的根瘤菌為根瘤菌HZ76，所述的根瘤菌應(yīng)用于促進(jìn)植物修復(fù)重金屬污染土壤。其中根瘤菌HZ76菌株的有效菌數(shù)為(108～109)CFU/mL。所述的植物修復(fù)重金屬污染土壤所采用的植物為刺槐。所述的重金屬污染土壤中的重金屬包括Cu、Zn、Pb和Cd中的一種或多種。本發(fā)明所述的HZ76菌株能產(chǎn)吲哚乙酸，有助于促進(jìn)植物生長。具有ACC脫氨酶基因，nod、nif基因，有助于提高植物的結(jié)瘤率和含氮量。產(chǎn)鐵載體，有助于提高植物抗逆性。利用植物促生細(xì)菌促進(jìn)植物生長，提高植物重金屬Zn、Pb、Cu含量，強化植物提取修復(fù)效率。
【專利說明】一種耐重金屬根瘤菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)和環(huán)境污染治理領(lǐng)域，涉及根瘤菌，具體涉及一種耐重金屬根瘤 菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 重金屬在土壤中殘留時間長，危害作用大，且容易經(jīng)作物吸收后進(jìn)入食物鏈進(jìn)而 危害人類健康。因此，隨著土壤重金屬污染問題在全球范圍內(nèi)加劇，如何經(jīng)濟、高效的控制 并治理土壤污染成為國內(nèi)外很多相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注的焦點。植物修復(fù)由于其成本低、簡便易行、 安全可靠、環(huán)境友好等諸多優(yōu)點，近年來已成為修復(fù)重金屬污染環(huán)境的重要手段。然而，由 于礦區(qū)廢棄地存在的諸多限制因素，如土壤貧瘠、殘留重金屬濃度較高、極端酸性、大量營 養(yǎng)元素的極度缺乏等，導(dǎo)致絕大所數(shù)礦山廢棄地缺乏自然植被生長。
[0003] 根瘤菌是一類固氮微生物，對土壤氮循環(huán)有著重要的作用，而豆科植物不僅可以 與根瘤菌共生固氮，從而克服礦區(qū)廢棄地土壤貧瘠、營養(yǎng)元素缺乏帶來的障礙，而且其還有 利于防治礦區(qū)廢棄地風(fēng)蝕及水蝕造成水土流失。此外，越來越多的研宄報道發(fā)現(xiàn)，許多抗重 金屬的根瘤菌除了具有固氮作用外，還具有其它促進(jìn)植物生長的能力，如分泌植物生長素 IAA、ACC脫氨酶及產(chǎn)生鐵載體等。因此，利用豆科植物-根瘤菌共生體系提高植物的修復(fù) 效率，將是一種行之有效、環(huán)境友好的修復(fù)手段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種耐重金屬根瘤菌，用于促 進(jìn)植物修復(fù)重金屬污染，使得重金屬污染能夠盡快去除。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：
[0006] 一種耐重金屬根瘤菌，所述的耐重金屬根瘤菌為根瘤菌HZ76,分類命名為 Mesorhizobium sp.HZ76,保藏編號為：CCTCC NO :M 2014667。
[0007] 所述的根瘤菌HZ76具有ACC脫氨酶基因。
[0008] 如上所述的耐重金屬根瘤菌用于與植物共生修復(fù)重金屬污染的應(yīng)用。
[0009] 如上所述的耐重金屬根瘤菌用于促進(jìn)植物生長的應(yīng)用。
[0010] 如上所述的耐重金屬根瘤菌用于產(chǎn)ACC脫氨酶基因的應(yīng)用。
[0011] 如上所述的耐重金屬根瘤菌用于提高植物抗逆性的應(yīng)用。
[0012] 優(yōu)選的，所述的根瘤菌配制成液體制劑，其中根瘤菌HZ76菌株的有效菌數(shù)為 (108?10 9)CFU/mL〇
[0013] 優(yōu)選的，所述的重金屬污染中的重金屬包括Cu、Zn、Pb和Cd中的一種或多種。
[0014] 更優(yōu)選的，所述的Cu的濃度不高于I. 4mM，所述的Zn的濃度不高于2. 6mM，所述的 Cu的濃度不高于3. OmM，所述的Cu的濃度不高于0. 5mM。
[0015] 優(yōu)選的，所述的植物修復(fù)重金屬污染所采用的植物為豆科植物，所述的豆科植物 為草本豆科植物中的苜蓿、含羞草或苕子，所述的豆科植物或者為木本豆科植物中的刺槐、 多花胡枝子或狼牙刺。
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：
[0017] 本發(fā)明所述的植物內(nèi)生細(xì)菌HZ76菌株能耐受多種重金屬，重金屬Cu、Zn、Pb、Cc^9 最小抑制濃度分別為，I. 4mM、2. 6mM、3. 0mM、0. 5mM。
[0018] 本發(fā)明所述的HZ76菌株能產(chǎn)吲哚乙酸，有助于促進(jìn)植物生長。具有ACC脫氨酶基 因，nod、nif基因，有助于提尚植物的結(jié)瘤率和含氣量。廣鐵載體，有助于提尚植物抗逆性 (抗旱、抗?jié)场⒖果}堿、抗病蟲害）。
[0019] 利用植物促生細(xì)菌促進(jìn)植物生長，提高植物重金屬Zn、Pb、Cu含量，強化植物提取 修復(fù)效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是不同重金屬處理下刺槐地上部和地下部干重（g/盆）。
[0021] 圖2是不同重金屬處理下接種根瘤菌HZ76后刺槐結(jié)瘤數(shù)目（g/plant)。
[0022] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)解釋說明。

【具體實施方式】
[0023] 需要說明的是本發(fā)明涉及的根瘤菌HZ76,分類命名為Mesorhizobium sp. HZ76,該 根瘤菌的菌種于2014年12月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，并登記 入冊，該生物菌種于2014年12月26日起保存30年。根瘤菌HZ76保藏號為：CCTCC NO :M 2014667〇
[0024] 本發(fā)明的根瘤菌的分離鑒定方法如下：
[0025] 根瘤菌ΗΖ76為植物內(nèi)生菌，是從中國陜西省某鉛鋅冶煉廠區(qū)生長的刺槐 (Robinia pseudoacacia)根瘤中分離得到，經(jīng)鑒定為Mesorhizobium sp·。主要生物學(xué)特 性為：G-，幼齡時菌體為桿狀，無芽孢。在YMA培養(yǎng)基上生長良好，單個菌落為圓形，邊緣整 齊，直徑1?2mm，呈透明狀。
[0026] 選取個大、飽滿的根瘤，用剪刀將其剪下（帶部分根），將根瘤放在親水中浸泡 4?5min，洗去雜質(zhì)，再用95%乙醇浸泡5min后用0. 1%的取012表面滅菌5min，然后用無 菌水沖洗10次。在無菌操作的情況下，將單個根瘤菌夾破后在YM平板（甘露醇10. 0g， MgSO4 · 7H20 0· 2g，K2HPO4O. 25g，KH2PO4O. 25g，NaCl 0· lg，酵母粉 3. 0g，蒸餾水 lOOOmL，瓊脂 18?20g)上劃線，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3?5d，挑取單菌落在YMA平板上劃線純化后保 存。
[0027] 將菌株接種到5mLTY培養(yǎng)液（酵母粉5. 0g，胰蛋白胨3g，CaCl2O. 7g，蒸餾水 IOOOmL)中，28 °C、150rpm/min 震蕩 48h，8000rpm/min 離心，每次 5min，收集菌體于 I. 5mL Eppendorf管中，按照CTAB法提取細(xì)菌總DNA，PCR擴增細(xì)菌的16S rDNA，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序 后與GenBank中已知16S rDNA序列進(jìn)行比對分析，與Mesorhizobium Ioti的16S rDNA序 列相似性達(dá)到99. 77%，將其鑒定為這個屬。
[0028] 根瘤菌HZ76的16S序列：
[0029] GCGCGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCCATCTCTACGGAACAACTCCGGGAAACT GGAGCTAATACCGTATACGTCCTTTTGGAGAAAGATTTATCGGAGATGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGG TGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGG CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGT GATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAACGGTGAAGATAATGACGGTAACCGTAGAAGAAGCCCCGGCTAAC TTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGG ATACTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGGTATCTCGAGTCCGGAAGA GGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGG TCCGGTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGA TGGAAGCTAGCCGTTGGCAAGTTTACTTGTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGCTTCCCGCCTGGGGAGTACGGTC GCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG CAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGGTCGCGGTTTCCAGAGATGGATACCTTCAGTTCGGCTGGACCGGTGACA GGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTA GTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTC CTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACCGCGAGGTCGAGC TAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCG GATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCG AAGGCGCTGTo
[0030] 以下給出本發(fā)明的根瘤菌HZ76的一些性能研宄結(jié)果：
[0031] 實驗1 :重金屬離子對根瘤菌HZ76的抑制濃度
[0032] 將根瘤菌HZ76菌株劃線接種于含不同重金屬濃度的YM培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)3? 5d，觀察其能否生長及生長情況。結(jié)果見表1。HZ76菌株能耐受多種重金屬（Cu、Zn、Pb、Cd 的最小抑制濃度分別為I. 4、2. 6、3. 0、0. 5mM)。
[0033] 表1菌株在含不同重金屬濃度的YMA培養(yǎng)基上的生長情況
[0034]

【權(quán)利要求】
1. 一種耐重金屬根瘤菌，其特征在于：所述的耐重金屬根瘤菌為根瘤菌HZ76,分類命 名為 Mesorhizobium sp.HZ76,保藏編號為：CCTCC NO :M 2014667。
2. 如權(quán)利要求1所述的耐重金屬根瘤菌，其特征在于：所述的根瘤菌HZ76具有ACC脫 氨酶基因。
3. 權(quán)利要求1所述的耐重金屬根瘤菌用于與植物共生修復(fù)重金屬污染的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述的耐重金屬根瘤菌用于促進(jìn)植物生長的應(yīng)用。
5. 權(quán)利要求1所述的耐重金屬根瘤菌用于產(chǎn)ACC脫氨酶基因的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述的耐重金屬根瘤菌用于提高植物抗逆性的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的根瘤菌配制成液體制劑，其中根瘤菌 HZ76菌株的有效菌數(shù)為（108?109)CFU/mL。
8. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的重金屬污染中的重金屬包括Cu、Zn、 Pb和Cd中的一種或多種。
9. 如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的Cu的濃度不高于1. 4mM，所述的Zn 的濃度不高于2. 6mM，所述的Cu的濃度不高于3. OmM，所述的Cu的濃度不高于0. 5mM。
10. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的植物修復(fù)重金屬污染所采用的植物 為豆科植物，所述的豆科植物為草本豆科植物中的苜蓿、含羞草或苕子，所述的豆科植物或 者為木本豆科植物中的刺槐、多花胡枝子或狼牙刺。
【文檔編號】B09C1/00GK104498410SQ201410850236
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】林雁冰, 樊妙春, 趙亮, 韋革宏 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)