一種銅綠假單胞菌熒光鐵載體的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境微生物領(lǐng)域，尤其涉及一種銅綠假單胞菌熒光鐵載體的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著近年來集約化海水養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，相應(yīng)的養(yǎng)殖問題也日益突出。集約化 的海水養(yǎng)殖容易導(dǎo)致養(yǎng)殖生物病害的發(fā)生。細(xì)菌性病害對海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損 失。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計表明，每年病害造成的海水養(yǎng)殖業(yè)損失高達(dá)12. 5億美元，損失嚴(yán)重。燦爛 弧菌是廣泛存在于海水環(huán)境中的條件致病菌，燦爛弧菌的致病性受宿主生理狀況及環(huán)境條 件等多種因素的影響。正常狀態(tài)下燦爛弧菌不引發(fā)生物體疾病，但是當(dāng)養(yǎng)殖環(huán)境處于水質(zhì) 不良因素的強烈刺激、機械損傷、寄生蟲感染等應(yīng)激狀態(tài)時，可以導(dǎo)致大菱鲆幼魚、大西洋 鮭、鱒魚、鱸魚和海參等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物發(fā)病。實際水產(chǎn)養(yǎng)殖中多采用抗生素的方法，對于燦 爛弧菌的抑制，以前有報道用氟甲喹拌入飼料中投喂，每千克魚每天投喂30mg，可以有效 地降低由燦爛弧菌引起的死亡。但是眾所周知，抗生素等藥物的使用能夠引起病原的抗藥 性。病原抗藥性的產(chǎn)生不僅能夠降低疾病治療的效果，而且還會對養(yǎng)殖環(huán)境中其他的非病 原微生物或益生菌群產(chǎn)生很大的破壞作用，打破了養(yǎng)殖環(huán)境中微生物菌群的競爭和平衡， 為疾病的再次爆發(fā)或其他疾病的爆發(fā)埋下了很大的隱患。同時，抗生素會在養(yǎng)殖生物體內(nèi) 蓄積，通過食物鏈進(jìn)入人體，最終危害人類的健康。
[0003] 鐵離子是所有活細(xì)胞的必須元素，因此細(xì)菌利用鐵離子是一個非常重要的生存機 制。鐵離子在宿主體內(nèi)被高親和性蛋白結(jié)合，而在外界環(huán)境中以不溶性氧化物形式存在，因 此病原菌必須有一個有效的鐵吸收系統(tǒng)，使其具感染性或在外界環(huán)境中生存。細(xì)菌的鐵吸 收系統(tǒng)主要通過兩種普遍機制行使功能：一是通過細(xì)胞膜上的受體直接結(jié)合外源鐵或血紅 素；二是合成和釋放血紅素載體、鐵載體等可高效鰲合鐵的分子到外界環(huán)境中攝取鐵并轉(zhuǎn) 運至細(xì)胞膜上的受體。銅綠假單胞菌在外界鐵離子濃度較低的條件下可分泌大量的熒光鐵 載體，該熒光鐵載體的結(jié)構(gòu)分為三部分：（1)保守的二羥基喹啉熒光環(huán)；（2)與發(fā)色團的氨 基相結(jié)合的?；鶄?cè)鏈；（3)與發(fā)色團C1通過氨基結(jié)合的可變的多肽。目前，國內(nèi)外還沒有 公開任何關(guān)于利用銅綠假單胞菌熒光鐵載體抑制燦爛弧菌的相關(guān)研宄報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種銅綠假單胞菌熒光鐵載體的新用途，該銅 綠假單胞菌熒光鐵載體可有效抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖病原燦爛弧菌。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種銅綠假單胞菌熒光鐵載體的 新用途，所述的熒光鐵載體在抑制燦爛弧菌生長方面的用途。
[0006] 所述的焚光鐵載體來源于一株銅綠假單胞菌aerygifliosaPA1，該菌 株由申請人于2011年04月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 保藏編號為CGMCCNo. 4799。
[0007] 所述的熒光鐵載體純化方法具體步驟如下： (1) 銅NTA瓊脂糖的制備：將鎳NTA瓊脂糖用緩沖液A洗下螯合的鎳離子，再用5倍體 積的蒸餾水洗滌殘存的緩沖液A，加入0.5ml的濃度為0. 1M的硫酸銅進(jìn)行銅離子的螯合， 用5倍體積的蒸餾水沖洗掉多余的銅離子，所得即為銅NTA瓊脂糖； (2) 銅綠假單胞菌PA1培養(yǎng)：活化-80 °C保存的銅綠假單胞菌種子，按10%的接種量將 過夜培養(yǎng)的種子液接入以丁二酸為碳源的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，搖瓶裝液量30 %，體積為 100mL，培養(yǎng)溫度為28~30 °C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速100~120rpm/min，培養(yǎng)48小時； (3) 熒光鐵載體的純化：將步驟（2)中的銅綠假單胞菌培養(yǎng)物在10,000rpm的轉(zhuǎn)速下 離心，收集上清，將上清液與結(jié)合緩沖液按體積為1 :2的比例進(jìn)行混合得到混合液，將混合 液加入到銅NTA瓊脂糖柱上，再用5倍體積的結(jié)合緩沖液進(jìn)行清洗，然后用5mL洗脫緩沖 液洗脫，收集洗脫液即為純化的熒光鐵載體。
[0008] 步驟（1)中所述的緩沖液A的成分為0. 02M的磷酸鈉，0. 5M的氯化鈉，0. 05M 的EDTA，pH7. 2 ;步驟（2)中所述的以丁二酸為碳源的無機鹽培養(yǎng)基的配方為：磷酸氫二鉀 6. 0g/L，磷酸二氫鉀3. 0g/L，硫酸銨1.0g/L，七水硫酸鎂0. 1g/L，丁二酸4. 0g/L;步 驟（3)中所述的結(jié)合緩沖液的成分為0. 02M磷酸鈉，1M氯化鈉，pH7. 2 ;所述的洗脫緩沖 液的成分為0. 02M的磷酸鈉，0. 5M氯化鈉，pH3. 5。
[0009] 所述的熒光鐵載體抑制燦爛弧菌生長的方法為：在含有燦爛弧菌的2216E培養(yǎng)基 中，加入2216E培養(yǎng)基體積3%的純化的熒光鐵載體，30 °C培養(yǎng)24小時，對燦爛弧菌的抑制 率達(dá)到50%。
[0010] 所述的2216E培養(yǎng)基的配方為：胰蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，磷酸鐵0.01g/ L，海水1L，滅菌備用。
[0011] 所述的熒光鐵載體抑制海水中燦爛弧菌的方法為：在含有燦爛弧菌的海水中，加 入海水體積1%的純化的熒光鐵載體，30 °C培養(yǎng)24小時，可完全抑制海水中燦爛弧菌的生 長。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明一種銅綠假單胞菌熒光鐵載體的新 用途，該銅綠假單胞菌在外界鐵離子濃度較低的條件下可分泌大量的熒光鐵載體，通過銅 NTA瓊脂糖的親和層析可得到高純度的熒光鐵載體，利用該熒光鐵載體可螯合環(huán)境中的鐵 離子，通過與病原體燦爛弧菌競爭鐵離子，使得病原體燦爛弧菌的生長因缺乏鐵離子而受 到抑制。而對相同條件下的其他細(xì)菌包括嗜水氣單胞菌、科氏葡萄球菌和希瓦氏菌等均無 抑制效果。因此，該熒光鐵載體可作燦爛弧菌的抑制劑，以期在實際的疾病防治中發(fā)揮重要 作用。
[0013] 銅綠假單胞菌aer收"ifliosaPA1，該菌株于2011年04月28日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 4799,保藏地址 為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研宄所。
【附圖說明】
[0014] 圖1為不同量的銅綠假單胞菌上清液對燦爛弧菌濃度的抑制效應(yīng)；燦爛弧菌菌液 的起始濃度為1.0X107CFU/mL，平均分成7份，每份5mL的菌液，分別加入0、100、200、 400、800和1600yL的上清液，30 °C培養(yǎng)24小時，測定各菌液的吸光度； 圖2為不同量的純化熒光鐵載體對2216E培養(yǎng)基中燦爛弧菌濃度的抑制效應(yīng)；燦爛弧 菌菌液的起始濃度為1.ox107CFU/mL，平均分成8份，每份5mL的菌液，分別加入0、1、 5、10、20、40、80和160yL的熒光鐵載體，30°C培養(yǎng)24小時，測定各菌液的吸光度； 圖3熒光鐵載體在相同條件下對嗜水氣單胞菌、科氏葡萄球菌、希瓦氏菌和燦爛弧菌 等的抑制效用。菌體的起始濃度為1. 〇X107CFU/mL，160yL的熒光鐵載體分別加入到5mL 的菌液中，30 °C培養(yǎng)24小時，測定各菌液的吸光度。
【具體實施方式】
[0015] 以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0016] 實施例1 銅綠假單胞菌的上清液對燦爛弧菌生長的抑制 銅綠假單胞菌在以丁二酸作為碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，可以大量分泌熒光鐵載體。其 中以丁二酸作為碳源的無機鹽培養(yǎng)基的配方為：磷酸氫二鉀6.0g/L，磷酸二氫鉀3.0g/ L，硫酸銨1.0g/L，七水硫酸鎂0. 1g/L，丁二酸4.0g/L?；罨?80°C保存的銅綠假單 胞菌種子，按10%的接種量將過夜培養(yǎng)的種子液接入以丁二酸為碳源的無機鹽培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，搖瓶裝液量30%，培養(yǎng)溫度為28~30°C，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速100~120rpm/min，培養(yǎng)48小時。 將細(xì)菌培養(yǎng)物在10,〇〇〇rpm的轉(zhuǎn)速下離心，收集上清。上清在100°C的水浴中加熱，并用 0.45ym的濾膜過濾除菌。
[0017] 活化-80 °C保存的燦爛弧菌種子，按10%的接種量將過夜培養(yǎng)的種子液接入 2216E培養(yǎng)基中，其中，2216E培養(yǎng)基的配方為胰蛋白胨5g/L，酵母浸粉1g/L，磷酸鐵0.01 g/L，海水1L，滅菌備用。燦爛弧菌在2216E培養(yǎng)基中的起始濃度為1.0X107CFU/mL，在5 mL的培養(yǎng)液中分別加入0、100、200、400、800和1600yL的銅綠假單胞菌的上清液，30°C 培養(yǎng)24小時，在紫外分光光度計600nm波長處測定菌液吸光度。以不同的上清液體積為橫 坐標(biāo)，以菌液的吸光值為縱坐標(biāo)，作圖1，并計算不同濃度的上清液對燦爛弧菌的抑制效率。 由圖1可見，隨著加入上清液的體積的增加，燦爛弧菌的生物量明顯受到抑制。加入7%體 積的上清液，可對燦爛弧菌達(dá)到75%的抑制。
[0018] 鑒于熒光鐵載體在上清中的存在量大，且具有螯合鐵載體的功能，我們接下來驗 證了熒光鐵載體對燦爛弧菌的抑制效應(yīng)。
[0019] 實施例2 熒光鐵載體的純化 ① 銅NTA瓊脂糖的制備：鎳NTA瓊脂糖購自上海生物科技工程有限公司，采用緩沖液A 洗下瓊脂上螯合