專利名稱：生物樣品結(jié)構(gòu)氫氘置換的證實及氘百分含量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氫同位素分析的一種方法，特別是用于生物樣品結(jié)構(gòu)氫氘置換及氘百分含量的一種測定方法。
背景技術(shù)：
自1932年Urey等發(fā)現(xiàn)氫同位素氘以來，氘被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。重水對生物的影響也被廣泛研究，如重水對細(xì)菌、真菌、植物及哺乳動物等的生長發(fā)育的影響等。1965年毛江森、黃禎祥等研究發(fā)現(xiàn)對熱極為敏感的日本腦炎病毒(JEV)在重水處理過的細(xì)胞中繁殖其熱穩(wěn)定性增強，近年來，研究發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒及甲肝病毒(HAV)用重水處理后也得到類似的結(jié)果。然而，重水對這些病毒的作用真實機理尚不清楚，而病毒結(jié)構(gòu)中的氫被氘置換是其可能的合理解釋，但是，至今尚無直接方法能證實病毒顆粒中的氫氘置換及測定其氘含量。因而無法優(yōu)化生物樣品的氘化條件和規(guī)范氘化的工藝。
氫同位素分析方法研究發(fā)展至今，已經(jīng)有許多分析技術(shù)，如冰點法、折射率法、電阻率法、熱電導(dǎo)率法、紅外光譜法、中子熱能譜法、氣相色譜法、核磁共振法(NMR)和化學(xué)電離質(zhì)譜法等。穩(wěn)定同位素氘示蹤質(zhì)譜法是廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的分析方法，大量用于代謝產(chǎn)物的測定和鑒定、代謝途徑的機理研究、分析生物體內(nèi)藥物和代謝產(chǎn)物的濃度測定。該法通過測量分子離子或少數(shù)特征碎片離子的強度，能確定待測物質(zhì)的分子組成而了解待測物質(zhì)的性質(zhì)，測定待測物質(zhì)的含量。它不需測出完整的質(zhì)譜圖，即只將感興趣的化合物分離出來，然后使用離子監(jiān)測技術(shù)，取得一部分質(zhì)譜圖，測定標(biāo)記與不標(biāo)記成分的比率。此法測定比值的精確度很低，一般為1～10％，但是此法具有特異性及高靈敏度。最近二十多年發(fā)展起來的分離技術(shù)，如毛細(xì)管分離技術(shù)大幅度地提高了穩(wěn)定同位素氘示蹤質(zhì)譜分析方法準(zhǔn)確度、靈敏度、選擇性及專屬性，使其越來越成為在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中最重要的分析方法。但是該方法也有較大的局限性①使用的測試儀器主要為氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)和液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)，測試儀器價格較貴；②高純度穩(wěn)定氘同位素標(biāo)記藥物的獲得難度大、量小、合成價格較高；③樣本處理和測試分析技術(shù)操作較繁瑣費時。
2H-NMR法因具有深入物質(zhì)內(nèi)部、不破壞樣品、提供生物分子量和分子結(jié)構(gòu)等參數(shù)等優(yōu)點而廣泛地應(yīng)用于生物化學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)上。氘在自然界中的豐度低，氘的天然豐度為150×10-6左右，它的靈敏度約為氫的150×10-6。氘核的核磁矩較小，自旋量子數(shù)為1，氘核的旋磁比較低，所以氘核的共振頻率也低，譜線的分散度也低，因而2H-NMR法的靈敏度很低。因此要得到滿意的信噪比信號及測定精度，需要較多的樣品量和較長的分析時間，樣品在測定前需純化。
近年來，迅速發(fā)展的生命科學(xué)提出了測定生物樣品的氘含量問題。在生命科學(xué)的某些領(lǐng)域，一般只能提供微克量級的生物富氘樣品，如JEV及HAV的研究，要證實整個病毒顆粒發(fā)生氫氘置換并測定病毒顆粒中氘百分含量，現(xiàn)有的氫同位素分析方法均不能直接用于這些生物樣品的氫同位素分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是發(fā)明一種新的氫同位素分析方法來證實所研究生物樣品發(fā)生氫氘置換反應(yīng)并計算其氘百分含量。能確定出生物樣品最優(yōu)含氘百分量和生物樣品的最優(yōu)氘化條件，提高多肽等的穩(wěn)定性。通過該方法檢測生物樣品的氘百分含量，結(jié)果表明生物樣品的氘百分含量增大，其生物性狀發(fā)生明顯改變，主要是其耐熱性發(fā)生明顯改變。
本發(fā)明是選取一種基質(zhì)，將制備得到的生物樣品與適量的基質(zhì)均勻混合再凍干，凍干混合樣品被氧化劑充分燃燒氧化，混合樣品中的氫被氧化為水，生成的水經(jīng)分離后與鋅反應(yīng)生成氫氣。氫氣的2H/1H比值用氣體同位素質(zhì)譜儀測定，樣品2H/1H比值以δDSMOW表示，即相對于國際標(biāo)準(zhǔn)平均海洋水(SMOW)的氫氘比值的變化值，再通過相應(yīng)的計算公式計算出生物樣品中氘的百分含量?？勺C實微生物和生物大分子發(fā)生氫氘置換，確定生物樣品最優(yōu)含氘量或最優(yōu)氘化條件，證實微生物和生物分子的穩(wěn)定性和耐熱性與其氘含量密切相關(guān)。
本發(fā)明包括選取天然已知蛋白質(zhì)作為基質(zhì)。各純化后的生物樣品用PBS(磷酸鹽緩沖液)稀釋至所需濃度，終體積均為0.1ml，然后加入0.5ml含5mg牛血清白蛋白(BSA)溶液。再將該混合樣品放入到GEL-1型凍干機中凍干，凍干后混合樣品水份含量＜3％(Karl Fischer Titrator法測定)。凍干混合樣品與氧化劑CuO(500mg)和V2O5(50mg)在100℃溫度下脫吸附水15min～30min，再于800℃～950℃下燃燒氧化反應(yīng)，15min～30min反應(yīng)完全后樣品被徹底氧化成CO2、H2O以及NO2等物質(zhì)。將產(chǎn)物中的水分離并轉(zhuǎn)移到水樣品反應(yīng)管中，水與鋅于400℃～450℃下反應(yīng)1.5h～2.5h被轉(zhuǎn)化為氫氣，其2H/1H比值用氣體同位素質(zhì)譜儀MAT-251測定。
樣品氫同位素的δD值通常以相對于世界通用的氫同位素標(biāo)準(zhǔn)-標(biāo)準(zhǔn)平均大洋水(Standard Mean Ocean Water，SMOW)表示，定義如下δDSA-SMOW=RSA-RSMOWRSMOW×103,]]>其中RSA表示樣品的2H/1H比值；RSMOW表示國際標(biāo)準(zhǔn)SMOW的2H/1H比值，δD值一般只取整數(shù)。由樣品的δD值可計算出生物樣品的氘百分含量。
本發(fā)明測定方法包括如下步驟1.選取天然已知蛋白質(zhì)作為基質(zhì)，以磷酸緩沖液(PBS)配制濃度為10mg/ml的BSA溶液。
2.各生物樣品純化后以PBS稀釋成一定濃度的樣品溶液，終體積為0.1ml。
3.將0.1ml的生物樣品溶液加入到0.5ml濃度為10mg/ml的BSA溶液中，該混合樣品放入到GEL-1型凍干機中凍干。
4.凍干混合樣品與氧化劑CuO(500mg)和V2O5(50mg)在100℃溫度下脫吸附水15min～30min，再于800℃～950℃下燃燒氧化反應(yīng)，15min～30min反應(yīng)完全后樣品被徹底氧化成CO2、H2O以及NO2等物質(zhì)。將產(chǎn)物中的水分離并轉(zhuǎn)移到水樣品反應(yīng)管中，水與鋅于400℃～450℃下反應(yīng)1.5h～2.5h被轉(zhuǎn)化為氫氣，其2H/1H比值用氣體同位素質(zhì)譜儀MAT-251測定。
5.由樣品的δD值計算出生物樣品的氘百分含量，具體計算公式如下第一步，δDSA_SMOW=RSA-RSMOWRSMOW×103---(1)]]>式中RSA表示混合樣品的2H/1H比值，RSMOW表示國際標(biāo)準(zhǔn)SMOW的2H/1H比值，且RSMOW＝(155.76±0.05)×10-6。
第二步，RSA＝2H/1H比值，由基質(zhì)BSA及生物樣品兩部分共同構(gòu)成，各參數(shù)分別如表1所示。
表1基質(zhì)BSA和生物樣品參數(shù)物質(zhì) 表示符號物質(zhì)用量氫百分含量 氘百分含量牛血清白蛋白 BSA mBSACBSAHCBSAD生物樣品 bio mbioCbioHCbioD則，RSA=12(mBSA·CBSAD+mbio·CbioD)mBSA·CBSAH+mbio·CbioH≈12·CbioDCBSAH·mbiomBSA+12·CBSADCBSAH]]>=12·CbioDCBSAH·mbiomBSA+RBSA---(2)]]>第三步，δDSA-SMOW=RSA-RSMOWRSMOW×103=12·CbioDCBSAH·mbiomBSA+RBSA-RSMOWRSMOW×103]]>=500·CbioDRSMOW·CBSAH·mbiomBSA+δDBSA-SMOW---(3)]]>RSMOW為(155.76±0.05)×10-6，δDBSA-SMOW可測得，CBSAH可通過計算得出，生物樣品的CbioD為未知定值。第四步，令K=500·CbioDRSMOW·CBSAH,]]>則公式(3)可變形為δDSA-SMOW=K·mbiomBSA+δDBSA-SMOW---(4)]]>則δDSA-SMOW與 呈直線關(guān)系。
基質(zhì)輔助氣體同位素質(zhì)譜分析法具有明顯的優(yōu)點，第一，測定準(zhǔn)確，重復(fù)性好；第二，樣品用量極少；第三，測定簡單易操作，成本低；第四，樣品δDSMOW值和生物樣品加入劑量呈直線關(guān)系，由該直線斜率K或直接由公式(3)可求出CbioD值，即生物樣品的氘百分含量。


圖1不同培養(yǎng)環(huán)境JEV的熱穩(wěn)定性比較實驗將氘化JEV(含36％D2O培養(yǎng))及未氘化JEV(不含D2O培養(yǎng))在50℃加熱滅活，以PFU降低值對時間作圖。在相同滅活時間時，氘化JEV的PFU降低值較未氘化JEV小。
圖2不同培養(yǎng)環(huán)境HAV的穩(wěn)定性比較實驗氘化HAV(HAV顆粒重懸于87％D2O)與未氘化HAV(HAV顆粒重懸于H2O)置于10℃，以CCID50降低值對時間作圖。在放置相同時間時，氘化HAV的CCID50降低值較未氘化HAV小。
圖3氘化HAV制得的VD樣品的δDSMOW-mbio/mBSA×10-34氘化HAV的核糖核酸(RNA)制得的RNA-CD樣品的δDSMOW-mbio/mBSA×10-3圖具體實施方式
實施例1JEV全病毒顆粒氫氘置換的證實原代雞胚細(xì)胞(CEC)用于繁殖JEV。CEC首先在不含重水(D2O)的培養(yǎng)基中生長24h，然后在含有36％重水維持液中于37℃條件下培養(yǎng)2天。棄去含重水維持液，加入JEV到細(xì)胞中并吸附2h。吸附完畢后棄去吸附液，用PBS洗滌細(xì)胞2次，加入新鮮的含重水維持液，三天后收獲(VD代表氘化的JEV，VH代表未氘化的JEV，CD代表氘化的無病毒細(xì)胞對照)。所有病毒及相應(yīng)的對照樣品都經(jīng)過聚乙二醇(PEG)沉淀、0.45mm濾器過濾、40％蔗糖墊底超速離心等方法進(jìn)行純化。病毒樣品經(jīng)甲醛滅活后，用血凝法測定其滴度(以HAU表示)。
研究發(fā)現(xiàn)氘化JEV與未氘化JEV于50℃時不同滅活時間下PFU滴度降低值不同，未氘化JEV在相同滅活時間下的PFU滴度降低值大于氘化JEV，見附圖1。這表明在D2O存在條件下繁殖的JEV其耐熱性增強了。
選取BSA為基質(zhì)，將氘化JEV、未氘化JEV及氘化的無病毒細(xì)胞對照經(jīng)純化后用PBS稀釋至所需濃度，終體積均為0.1ml，然后加入0.5ml含5mgBSA的PBS液。再將該混合樣品放入到GEL-1型凍干機中凍干，凍干后混合樣品水份含量＜3％，制得樣品分別用VD、VH及CD表示。凍干混合樣品與氧化劑CuO(500mg)和V2O5(50mg)在100℃溫度下脫吸附水20min，再于850℃下燃燒氧化反應(yīng)，30min反應(yīng)完全后樣品被徹底氧化成二氧化碳(CO2)、水(H2O)以及二氧化氮(NO2)等物質(zhì)。將產(chǎn)物中的水分離并轉(zhuǎn)移到水樣品反應(yīng)管中，水與鋅于420℃下反應(yīng)2h被轉(zhuǎn)化為氫氣，其2H/1H比值用氣體同位素質(zhì)譜儀MAT-251測定。測定VD、VH及CD樣品的δDSMOW值見表2。
表2 VD、VH及CD樣品的δDSMOW值δDSMOW樣品 JEV液加入體積量(μl)7.5 1530VD-35±3-8±4 42±3VH-72±2-54±0-60±0CD-75±3-65±0-70±7基質(zhì)BSA的δDSMOW值為一定值，所以混合樣品的δDSMOW值反應(yīng)了所加入生物樣品的2H/1H比值高低及其加入劑量。在相同加入劑量情況下，混合樣品的δDSMOW值越大表明生物樣品的2H/1H比值越高；所加生物樣品為同一樣本時，混合樣品的δDSMOW值也越大則表明生物樣品加入劑量越多。
由表2可知，JEV加入量相同的條件下，VD樣品的δDSMOW值高于VH樣品；且隨著加入的病毒體積量(蛋白含量)增加，其δDSMOW值相應(yīng)增大。VD樣品的δDSMOW值增大不太可能來自于病毒樣品制備中可能污染的細(xì)胞成份，因為在不同劑量時無病毒的細(xì)胞成份對照樣品CD的δDSMOW值相似，在-65～-75之間，沒有出現(xiàn)劑量正相關(guān)性，且與基質(zhì)BSA的δDSMOW值較為接近，這表明細(xì)胞成份對照樣品CD中的氘處于天然狀態(tài)下。因此，與不含D2O的培養(yǎng)基中獲得的JEV相比，在D2O存在的條件下繁殖JEV的2H/1H比值顯著增大，即氘化JEV的2H/1H比值高于未氘化JEV，表明在D2O存在條件下所繁殖的JEV中富集了氘，其氘含量增大，JEV病毒顆粒中的某些氫被氘所取代。
實施例2HAV全病毒顆粒氫氘置換的證實及其氘百分含量的測定甲型肝炎病毒疫苗株(H2株)在人肺二倍體細(xì)胞中繁殖獲得。感染H2株的細(xì)胞或未感染病毒的細(xì)胞對照收獲后，用PBS重懸，經(jīng)三次凍-化及超聲波處理后，8000g離心30分鐘以去除細(xì)胞碎片。收獲的上清液用氯仿抽提三次，然后超速離心收獲病毒或其細(xì)胞對照。樣品的氘化采用以下方法樣品重懸于含87％重水的最低限度必要成分培養(yǎng)液(MEM)，36℃孵育一星期。氘化樣品經(jīng)超速離心棄去含重水的MEM，沉淀物用蒸餾水充分洗滌后，再次超速離心以收獲氘化樣品。洗滌過程重復(fù)三次以保證氘化樣品中幾乎不含有游離重水。病毒樣品的滴度(半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量，CCID50)用細(xì)胞培養(yǎng)的方法測定。
研究發(fā)現(xiàn)氘化HAV與未氘化HAV于10℃時不同保存時間下CCID50滴度降低值不同，未氘化HAV在相同保存時間下的CCID50滴度降低值大于氘化HAV，見附圖2。這表明D2O存在下孵育的HAV其穩(wěn)定性增強了。
選取牛血清白蛋白(BSA)為基質(zhì)，將氘化HAV、未氘化HAV及氘化細(xì)胞對照用PBS稀釋至所需濃度，終體積均為0.1ml，然后加入0.5ml含5mgBSA的PBS液。再將該混合樣品放入到GEL-1型凍干機中凍干，凍干后混合樣品水份含量＜3％，制得樣品分別用VD、VH及CD表示。凍干混合樣品與氧化劑CuO(500mg)和V2O5(50mg)在100℃溫度下脫吸附水20min，再于850℃下燃燒氧化反應(yīng)，30min反應(yīng)完全后樣品被徹底氧化成二氧化碳(CO2)、水(H2O)以及二氧化氮(NO2)等物質(zhì)。將產(chǎn)物中的水分離并轉(zhuǎn)移到水樣品反應(yīng)管中，水與鋅于420℃下反應(yīng)2h被轉(zhuǎn)化為氫氣，其2H/1H比值用氣體同位素質(zhì)譜儀MAT-251測定。
測定由氘化HAV制得的VD樣品的δDSMOW值。VD樣品的δDSMOW值的顯著升高，這不可能是由于氘化HAV顆粒中的游離水，因為其最后一次洗滌液(SV)和蒸餾水的δDSMOW值相一致；也不可能是病毒樣品中可能污染的氘化細(xì)胞成分，因為CD樣品的δDSMOW值在本底水平。因此，VD樣品的δDSMOW值的顯著升高表明HAV在D2O中孵育后2H/1H比值增大，HAV顆粒發(fā)生氫氘置換富集氘；且隨著氘化HAV的加入量增加，VD樣品的δDSMOW值線性增加，即在一定范圍內(nèi)，氘化HAV量(mbio，μg)基質(zhì)BSA量(mBSA，mR)mbio/mBSA×10-3δDSMOW0 0 -880.2 0.04 -510.5 5 0.10 221 0.20 552 0.40 291VD樣品的δDSMOW值與氘化HAV的加入量呈正比關(guān)系。VD樣品的δDSMOW值與氘化HAV的加入量關(guān)系如表3所示。
表3氘化HAV所制得樣品VD的δDSMOW與氘化HAV加入量的關(guān)系將δDSMOW對mbio/mBSA×10-3作圖，見附圖3。
由附圖3可知，直線的R2＝0.9762，具有良好的線性相關(guān)性。直線斜率為K=500·CbioDRSMOW·CBSAH=917.59×103,]]>截距為-90.004＝δDBSA-SMOW與BSA實測值δDBSA-SMOW＝-88一致。
計算氘化HAV的氘百分含量(a)由公式(1)可計算出BSA的2H/1H比值得RBSA＝142.05×10-6(b)由BSA的氨基酸組成計算出BSA的1H理論百分含量為CBSAH=6.95]]>(c)根據(jù)直線斜率計算得出氘化HAV的氘百分含量為CbioD=917.59×103×RSMOW×CBSAH×1500]]>=917.59×103×155.76×10-6×6.95×1500]]>=1.99]]>實施例3氘化HAV病毒的核糖核酸(RNA)中氫氘置換的證實及其氘百分含量的測定經(jīng)充分洗滌的氘化HAV或細(xì)胞對照用于制備氘化的RNA，方法參照異硫氰酸胍-酚一步抽提法。RNA樣品用分光光度法定量，并計算其OD260/OD280比值用于表征RNA的純度。
選取牛血清白蛋白(BSA)為基質(zhì)，將氘化HAV、未氘化HAV及氘化細(xì)胞對照中提取的RNA用PBS稀釋至所需濃度，終體積均為0.1ml，然后加入0.5ml含5mgBSA的PBS液。再將該混合樣品放入到GEL-1型凍干機中凍干，凍干后混合樣品水份含量＜3％，制得樣品分別用RNA-VD、RNA-VH和RNA-CD表示。凍干混合樣品與氧化劑CuO(500mg)和V2O5(50mg)在100℃溫度下脫吸附水20min，再于850℃下燃燒氧化反應(yīng)，30min反應(yīng)完全后樣品被徹底氧化成二氧化碳(CO2)、水(H2O)以及二氧化氮(NO2)等物質(zhì)。將產(chǎn)物中的水分離并轉(zhuǎn)移到水樣品反應(yīng)管中，水與鋅于420℃下反應(yīng)2h被轉(zhuǎn)化為氫氣，其2H/1H比值用氣體同位素質(zhì)譜儀MAT-251測定。
測定樣品RNA-VD和RNA-VH的δDSMOW值，實驗結(jié)果表明氘化HAV的RNA具有較高水平的氘含量，RNA-VD的δDSMOW值隨著RNA加入量的增加而增大，實驗結(jié)果見表4。而對照病毒RNA-VH或細(xì)胞成份RNA-CD的氘含量極低，這表明樣品RNA-VD的δDSMOW值增加是因為加入的氘化HAV的RNA的2H/1H比值高，氘化HAV的RNA的2H/1H比值增大由于其中的氫被氘置換。
表4 RNA-VD樣品的δDSMOW與氘化RNA加入量的關(guān)系氘化RNA量(mbio，μg) 基質(zhì)BSA量(mBSA，mg)mbio/mBSA×10-3δDSMOW0 0 -851 0.2-602 0.4-5253 0.6-364 0.8-1710 2 86將δDSMOW對mbio/mBSA×10-3作圖，見附圖4。
由附圖4可知，直線的R2＝0.9965，具有良好的線性相關(guān)性，直線斜率為K=500·CbioDRSMOW·CBSAH=84.211×103,]]>截距為-83.474＝δDBSA-SMOW與BSA實測值δDBSA-SMOW＝-85一致。
計算氘化HAV的RNA的氘百分含量(a)由公式(1)可計算出BSA的2H/1H比值得RBSA＝142.52×10-6(b)由BSA的氨基酸組成計算出BSA的1H理論百分含量為CBSAH=6.95]]>(c)根據(jù)直線斜率計算得出氘化HAV的RNA的氘百分含量為CbioD=84.211×103×RSMOW×CBSAH×1500]]>=84.211×103×155.76×10-6×6.95×1500]]>=0.18]]>
權(quán)利要求
1.本發(fā)明是一種生物樣品結(jié)構(gòu)氫氘置換的證實及氘百分含量的測定方法，其特征在于選取一種基質(zhì)，將制備得到的生物樣品與適量的基質(zhì)均勻混合后凍干，凍干混合樣品被氧化劑充分燃燒氧化，混合樣品中的氫被氧化為水，生成的水經(jīng)分離后與鋅反應(yīng)生成氫氣，氫氣的2H/1H比值用氣體同位素質(zhì)譜儀測定，再通過公式計算出生物樣品中氘的百分含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物樣品結(jié)構(gòu)氫氘置換的證實及氘百分含量的測定方法，其特征在于生物樣品為微生物或蛋白質(zhì)或核酸的氘百分含量的測定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物樣品結(jié)構(gòu)氫氘置換的證實及氘百分含量的測定方法，其特征在于采用天然已知蛋白質(zhì)作為基質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物樣品結(jié)構(gòu)氫氘置換的證實及氘百分含量的測定方法，其特征在于證實微生物和生物大分子發(fā)生氫氘置換。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物樣品結(jié)構(gòu)氫氘置換的證實及氘百分含量的測定方法，其特征在于確定生物樣品最優(yōu)含氘量或最優(yōu)氘化條件。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物樣品結(jié)構(gòu)氫氘置換的證實及氘百分含量的測定方法，其特征在于證實微生物和生物分子的穩(wěn)定性和耐熱性與其氘含量密切相關(guān)。
全文摘要
本發(fā)明是一種氫同位素分析方法，特別是用于生物樣品結(jié)構(gòu)氫氘置換及氘百分含量的一種測定方法。它選取一種基質(zhì)，將制備得到的生物樣品與適量的基質(zhì)均勻混合再凍干，凍干混合樣品被氧化劑充分燃燒氧化，混合樣品中的氫被氧化為水，生成的水經(jīng)分離后與鋅反應(yīng)生成氫氣，氫氣的
文檔編號B01D59/44GK1580779SQ03142290
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者毛江森, 劉子陽, 唐彩華, 賀義惠, 朱家鴻, 陳悅青, 毛子旭, 柴少愛 申請人:浙江普康生物技術(shù)股份有限公司, 浙江大學(xué), 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院