專利名稱：聚合物親和基質(zhì)及其生產(chǎn)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于結(jié)合液體中一種或多種物質(zhì)以從該液體除去所述物質(zhì)和/或減少其在所述液體中的量或濃度，意在防止、去除或降低在所述液體中組分或過程所不希望有的活化的聚合物親和基質(zhì)，涉及從該液體去除物質(zhì)和/或減少其在所述液體中的量或濃度的方法，涉及產(chǎn)生所述基質(zhì)的方法，涉及所述基質(zhì)的用途和包含所述基質(zhì)的試劑盒。
本發(fā)明還涉及聚合物基質(zhì)的用途，用于產(chǎn)生從液體除去一種或多種物質(zhì)或減少該物質(zhì)在所述液體中的量或濃度的聚合物親和基質(zhì)。
背景技術(shù)：
體外處理液體如血液或任何其他體液的體外處理，要求該液體接觸如管、線、珠或膜形式的材料。此類材料的采用意味著外來的從而潛在生物不相容的(例如免疫活性的或促凝血的)材料的使用。外來物質(zhì)的使用與宿主免疫系統(tǒng)的活化有關(guān)，例如與血液中組分如淋巴細(xì)胞、血小板或不同類型的血漿蛋白質(zhì)級聯(lián)有關(guān)，例如在補(bǔ)體或凝血級聯(lián)中的蛋白質(zhì)。同時(shí)，對細(xì)胞的破壞如對例如紅血球的機(jī)械的或脅迫-誘導(dǎo)的破壞可導(dǎo)致溶血和隨后的對患者的威脅生命的并發(fā)癥。液體，比如血液或任何體液的處理，因此要求通過利用高度生物相容的材料以避免組分在所述液體例如血液中所不希望有的活化。
細(xì)菌毒素細(xì)菌內(nèi)毒素和外毒素促進(jìn)由于宿主中血細(xì)胞和可溶性蛋白質(zhì)與所述內(nèi)毒素的多重相互作用導(dǎo)致的活化而引起宿主中產(chǎn)生壓倒性的炎性免疫反應(yīng)。該免疫反應(yīng)被描述為臨床綜合征SIRS(全身炎性應(yīng)答綜合征)、敗血癥或膿毒性休克的基本特征。該發(fā)病機(jī)理是嚴(yán)重的并且該狀況導(dǎo)致組織損傷、多器官衰竭和敗血癥誘導(dǎo)的死亡。尋找治療患有敗血病患者的新治療藥物和方法是重要的，因?yàn)樽罱闹委熜愿深A(yù)研究(Dinarello等，EuropeanCytokine Network 1997；8294)不能保護(hù)患有嚴(yán)重?cái)⊙Y或膿毒性休克的患者。并且，當(dāng)產(chǎn)生治療性物質(zhì)或液體時(shí)，必須注意產(chǎn)品是非致熱原的，即無內(nèi)毒素或內(nèi)毒素濃度低于其發(fā)揮作為的允許極限。
內(nèi)毒素來自革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌或普通變形桿菌細(xì)胞膜外層的內(nèi)毒素或“致熱原”在敗血癥、膿毒性休克和全身炎性應(yīng)答綜合征(SIRS)的發(fā)病機(jī)理中起重要作用。內(nèi)毒素，例如來自大腸桿菌的脂多糖(LPS)，由脂質(zhì)A和多糖鏈組成(Zhringer等，Adv.Carb.Chem.Biochem.，1994)。LPS的分子結(jié)構(gòu)在

圖1中顯示。脂質(zhì)A組分是生物學(xué)上最活躍的部分并且介導(dǎo)細(xì)胞上內(nèi)毒素的毒性作用。脂質(zhì)A在革蘭氏陰性細(xì)菌的不同菌株內(nèi)高度保守，而多糖部分更易變。
來自大腸桿菌的脂質(zhì)A由兩個(gè)葡糖胺部分(在2個(gè)葡糖胺的相反末端含有2個(gè)帶負(fù)電的磷酸基)和六個(gè)連接到兩個(gè)葡糖胺環(huán)的長鏈高度疏水性脂肪酸殘基組成。內(nèi)毒素的可變多糖鏈也連接到葡糖胺之一。
內(nèi)毒素的去除內(nèi)毒素的去除是困難的并且經(jīng)常存在包括對有價(jià)值的蛋白質(zhì)，即不想除去的蛋白質(zhì)的回收或破壞的問題，或者是與體液或血液以及去除內(nèi)毒素所用的手段的生物相容性問題。這種生物相容性問題僅僅起因于宿主防御機(jī)制的活化并且包括多重細(xì)胞活化和可溶性蛋白質(zhì)如補(bǔ)體級聯(lián)中的細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)的釋放。所述細(xì)胞活化和蛋白質(zhì)釋放可導(dǎo)致嚴(yán)重炎癥，即全身性敗血癥或膿毒性休克，以致組織損傷和器官衰竭為結(jié)果。凝結(jié)導(dǎo)致的血液凝固是生物不相容性導(dǎo)致的另一個(gè)問題。此外，該致熱原不能完全地被除去。
除去內(nèi)毒素的公知方法包括使用加熱、酸或堿失活(美國專利號3,644,175，3,659,027和4,070,289)。此類方法經(jīng)常損害最終產(chǎn)品的質(zhì)量，即失活解毒的液體，因?yàn)榇祟惙椒ǖ氖褂檬乖撘后w和其有價(jià)值的蛋白質(zhì)可能被變性或失活。欲使用的其他方法包括活性炭吸附，或使用氧化劑例如高錳酸鉀、水性過氧化氫和次氯酸鈉氧化分解。
除去內(nèi)毒素的常規(guī)方法從敗血病患者的血漿或全血體外除去內(nèi)毒素被討論為敗血癥、膿毒性休克和SIRS的潛在治療策略。在人血漿中有幾種在介導(dǎo)和抑制內(nèi)毒素對細(xì)胞的影響中起作用的結(jié)合蛋白，例如脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)、殺菌的滲透性增加蛋白(BPI)、sCD14、CAP18和乳鐵蛋白。肽抗生素多粘菌素B(通過多粘芽胞桿菌產(chǎn)生)抑制內(nèi)毒素對細(xì)胞的作用。馬蹄蟹(美洲鱟)也含有內(nèi)毒素結(jié)合蛋白并且該物種的細(xì)胞裂解物被用于內(nèi)毒素的檢測(鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)，LAL，或鱟試驗(yàn))。此類內(nèi)毒素結(jié)合蛋白的結(jié)合基元可被用于敗血病患者的血漿或全血的體外處理。
許多內(nèi)毒素結(jié)合序列的共同特征是在其結(jié)合部分存在備選的帶正電荷的和疏水的氨基酸。對于來源于馬蹄蟹的一種內(nèi)毒素結(jié)合蛋白已經(jīng)表明該內(nèi)毒素結(jié)合序列形成一種兩親性二級結(jié)構(gòu)，其中帶正電荷的殘基和疏水殘基位于環(huán)狀結(jié)構(gòu)的對立面(Hoess等，EMBO J，1993)。已經(jīng)提出其他的內(nèi)毒素結(jié)合部位具有類似模式。
帶正電荷的聚合物如聚乙烯亞胺(mizner等，Artif.Organs，1993；Weber等，ASAIO J，1995；Petsch等，J Chromatogr.Biomed.Sci.Appl.，1998)或者二乙氨基乙基(DEAE)改性纖維素(Weber等，A.S.A.I.O.J.，1995)對內(nèi)毒素具有一定吸附能力(可能基于正電荷與脂質(zhì)A的帶負(fù)電的磷酸鹽殘基的相互作用)。聚乙烯亞胺的一個(gè)缺點(diǎn)是對肝素的高吸附和已清楚描述的與血小板的相互作用，后者導(dǎo)致生物不相容性問題如體內(nèi)或體外應(yīng)用中的凝結(jié)。
類似地，帶正電荷的膜濾器用于灌輸液體的純化。由于吸附取決于吸引的電荷并且具有較少特異性并因此也可以除去所想要的有價(jià)值的蛋白質(zhì)。
已經(jīng)提出用固定于瓊脂糖凝膠的精氨酸從血漿、血液和藥物溶液除去內(nèi)毒素(EP0 494 848和EP0 333 474)。
WO 92/11847描述了使用一種化合物制備經(jīng)口地、靜脈內(nèi)地、肌內(nèi)地、皮內(nèi)或腹膜內(nèi)使用以治療內(nèi)毒素誘導(dǎo)的效應(yīng)以及治療內(nèi)毒素誘導(dǎo)的效應(yīng)的方法。在WO 92/11847中描述的化合物沒有固定于固體支持物上。
疏水聚合物(例如聚苯乙烯，聚酰胺，聚砜和聚醚砜)也可以吸附含水溶液中的內(nèi)毒素。這個(gè)性質(zhì)被用于超濾膜以純化水和透析/灌輸液體，即具有低的或沒有蛋白質(zhì)含量的溶液(Weber等，Int.J.Artific.Org.，1997)。然而，從血液或血漿除去內(nèi)毒素引起循環(huán)血漿蛋白(LBP、BPI、sCD14)和細(xì)胞受體(例如CD14)對吸附基質(zhì)的競爭問題，因?yàn)楹唵蔚氖杷骄哂械偷奶禺愋浴?br> 利用帶正電荷的或疏水聚合物以除去內(nèi)毒素顯示血漿中內(nèi)毒素的結(jié)合特異性低并因此對血漿中內(nèi)毒素去除的選擇性是低的。實(shí)際上，開發(fā)具有高特異性和高選擇性以及高生物相容性的內(nèi)毒素吸附劑已經(jīng)成為一個(gè)挑戰(zhàn)。
已經(jīng)提出通過利用例如殺細(xì)菌/滲透性增加(BPI)蛋白質(zhì)產(chǎn)品將來自內(nèi)毒素結(jié)合蛋白的肽序列用于治療性應(yīng)用(美國專利號5,639,727和5,643,875)。固定肽的一個(gè)缺點(diǎn)是合成的成本和需要肽被固定而不干擾結(jié)合結(jié)構(gòu)。
親和性配體如組胺、組氨酸和多粘菌素B對于除去內(nèi)毒素是有效的，盡管它們的有效性依賴于液體中其他的蛋白質(zhì)并且存在血清蛋白像血清白蛋白或其他帶負(fù)電的蛋白質(zhì)時(shí)急劇降低(Anspach和Hilbeck，J.Chromatogr.，1995，Petsch等，J.Chromatogr.，1997，EP 0 129 786)。然而，多粘菌素B對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒并且可導(dǎo)致腎損害，其由于有危險(xiǎn)滲漏到患者的血液中而不利于獲得市場化批準(zhǔn)。US 4,771,104描述了含有纖維載體的內(nèi)毒素解毒材料，多粘菌素B被固定到該纖維載體。
Hirayama等(Journal of Chromatography B，271(1999)，187-195)描述了通過利用不溶于水的多聚(ε-賴氨酸)(PL)顆粒從藥物和液體除去內(nèi)毒素，尤其是LPS。
局限性和遠(yuǎn)景從蛋白質(zhì)液體有效去除內(nèi)毒素取決于想要的有價(jià)值蛋白質(zhì)的凈電荷，內(nèi)毒素將從其中除去。內(nèi)毒素和其配體之間的相互作用具有疏水的和離子的特性，盡管它們中每一個(gè)的貢獻(xiàn)取決于液體的離子強(qiáng)度和pH。有效的內(nèi)毒素去除也依賴于除去所述內(nèi)毒素以防止例如細(xì)胞活化或血液凝固的手段的高灌注和生物相容性。
然而，雖然已經(jīng)開發(fā)或提出了從液體，例如血液、其他的體液或治療性液體除去物質(zhì)如內(nèi)毒素的許多方法，所描述的方法沒有一個(gè)是高度生物相容的，對將要除去的物質(zhì)如內(nèi)毒素也沒有高度特異性和選擇性，并且沒有一個(gè)同時(shí)易于灌注，例如易于通過全血或血漿。從而期望開發(fā)高度有效的生物相容的和有效的從液體除去物質(zhì)例如內(nèi)毒素的方法學(xué)和方法，從而使得可能避免與現(xiàn)有技術(shù)設(shè)備相關(guān)的問題。在這方面，本發(fā)明闡述了該需要和利益。
為了防止、除去或減少液體中組分或過程所不希望有的活化，對于減少液體中一種或多種物質(zhì)的濃度或除去該物質(zhì)的新的和有效的方法和手段的需求根據(jù)上述理由，尤其是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中是明顯的。這種方法和手段在敗血癥、膿毒性休克和SIRS的治療(通過體外從敗血病患者的血漿除去致熱原或其他的活性物質(zhì))中也將特別有價(jià)值。
此外，熟知將生物特異性配體例如抗體或肽結(jié)合到基質(zhì)或底物并通過其從體循環(huán)或血液循環(huán)除去病理生理性的關(guān)鍵性物質(zhì)。
所使用的公知材料是例如珠子或顆粒形式的瓊脂糖凝膠(sephadex，pharmacia)、聚丙烯酸酯或環(huán)氧樹脂。
公知的珠子為例如聚甲基-異丁烯酸酯制造的珠子，例如，用于LDL吸附的DALI-系統(tǒng)(Fresenius)；瓊脂糖凝膠例如Plasmaselect的用于纖維蛋白原吸附的Rheosorb系統(tǒng)，其使用了固定肽；使用結(jié)合人免疫球蛋白的經(jīng)固定綿羊抗體以除去自身抗體的Therasorb-免疫吸附系統(tǒng)；Excorim-蛋白質(zhì)A柱(和其他廠商的類似系統(tǒng))，其使用經(jīng)固定的細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)合免疫球蛋白。
公知的膜為例如聚酰胺(MAT/Merck)和通常被描述為親和性膜的其他膜。
公知的織物為例如具有用于LPS結(jié)合的具有多粘菌素B配體的Toray聚苯乙烯/聚乙烯網(wǎng)孔。
在使用生物學(xué)配體(如肽或抗體)的情況下，所有這些基質(zhì)都被通過濕化學(xué)法的常規(guī)方法修飾，即首先相應(yīng)的特異性配體形成或被分離(例如通過肽合成，通過生物技術(shù)方法)，然后被純化并且然后被固定到固體基質(zhì)。
這些基質(zhì)通常不允許直接在該基質(zhì)上進(jìn)行配體的固相合成，是因?yàn)獒槍滔嗪铣芍兴玫幕瘜W(xué)品(用于保護(hù)基團(tuán)的切割的溶劑、酸和堿等)的化學(xué)不相容性。
由于缺乏生物相容性，所以適宜固相合成的基質(zhì)(例如聚苯乙烯)不適于治療的目的。
因此，允許固相合成和與血液組分(例如血漿或全血)接觸的固相基質(zhì)將是有利的，因?yàn)橄铝欣碛?1)發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)呐潴w(例如優(yōu)化的肽結(jié)構(gòu))的開發(fā)步驟可以在相同的固體基質(zhì)上進(jìn)行，該固體基質(zhì)以后可以用于治療性應(yīng)用。這意味著必要的生物學(xué)試驗(yàn)步驟(例如親合性、特異性和結(jié)合能力的測定)可以在非常類似于后面的治療應(yīng)用條件下進(jìn)行。根據(jù)此來自生物檢驗(yàn)步驟的信息對于后面的治療或臨床應(yīng)用是非?？煽康暮陀蓄A(yù)言性。這節(jié)省時(shí)間和錢并且降低失敗或副作用的危險(xiǎn)。
(2)可以以精確定義的方式(以序列和幾何學(xué))通過固相合成形成(肽)配體。這也意味著(肽)配體與固體基質(zhì)的連接(即共價(jià)連接的位置)被精確地定義。
這種基質(zhì)在膨脹或濕潤行為方面有一些多少相抵觸的需求對于固相合成通常使用無水有機(jī)的(極性的如二甲基甲酰胺，或非極性的如二氯甲烷)溶劑或溶劑的混合物。另一方面，治療應(yīng)用必須發(fā)生在水相環(huán)境(例如血漿，血液，治療溶液等)中。在這兩種環(huán)境(即水性和有機(jī)溶劑)中，聚合物基質(zhì)必須可被容易地濕化和膨脹(1)為了能有效地除去或沖洗掉非結(jié)合的(過多)配體或結(jié)構(gòu)單元(例如受保護(hù)的氨基酸)或化學(xué)品(例如偶合劑如碳二亞胺，去保護(hù)劑如有機(jī)酸或堿)，和(2)為了允許分別的毒素被從水相環(huán)境除掉，基質(zhì)必須在該環(huán)境中也是可濕的和可膨脹的。
因此，公知聚合物基質(zhì)的問題是你被限制于使用再生液體類型，以便不洗脫結(jié)合的活性配體而僅僅材料中被捕捉的物質(zhì)被從該液體除掉，并且配體以限定的肽/分子或隨機(jī)聚合的多肽/寡聚物裝配并且然后必須同樣地結(jié)合到支持材料--你不知道你最后以什么結(jié)束。
按照本發(fā)明使用的益處是你可以直接在固體支持物上用接枝的聚乙二醇建造配體并且具有已建造的配體的固體支持物可以直接使用。這提供了使用現(xiàn)有技術(shù)的基質(zhì)不能得到的可靠性。此外，它提供了技術(shù)上的益處，因?yàn)樯飳W(xué)活性/特異性配體是醫(yī)學(xué)設(shè)備的一部分并且顯影時(shí)間被縮短了(這可以允許或促進(jìn)一種個(gè)性化處理)。
在開發(fā)過程中，本發(fā)明的材料不是公知的或者不可預(yù)見其突出的結(jié)果。預(yù)期的缺點(diǎn)是例如聚合物基質(zhì)將膨脹并且堵塞穿過設(shè)備的流體。此外，當(dāng)應(yīng)用像全血的液體時(shí)，預(yù)計(jì)壓力降將太高。最后，作為上面事情的結(jié)果，預(yù)計(jì)液體經(jīng)過固相材料的灌注是不充分的。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案之一的聚合物基質(zhì)已經(jīng)被證明對于蒸汽滅菌和其后的干燥是杰出的。干燥后，殘留的空氣可以通過加入鹽水溶液用于聚合物基質(zhì)再次膨脹而容易地除去并且備用。這導(dǎo)致臨床上短的準(zhǔn)備時(shí)間，其在例如緊急事件中和高工作量時(shí)是重要的。
此外，該材料顯示出瞬間濕潤，而用于不同類型配體的最常用固體支持物不能瞬間濕潤。這是作為活性配體的固相材料的一個(gè)非常重要的特征。甚至該材料能在一定范圍內(nèi)被壓縮和解壓，并且該材料在補(bǔ)體激活、接觸活化、細(xì)胞毒性和粒細(xì)胞活化方面是生物相容的。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的主要目的是通過提供用于除去和/或減少液體中以上所不希望有的物質(zhì)例如內(nèi)毒素的量或濃度的一種高度生物相容的、特異性、可選擇的和容易灌注的聚合物親合性基質(zhì)，即具有現(xiàn)有技術(shù)的全部益處并且沒有不利之處的聚合物親和基質(zhì)，從而消除與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面完成了該目的，即用聚合物親和基質(zhì)結(jié)合液體中一種或多種物質(zhì)用于從該液體除去所述一種或多種物質(zhì)和/或減少所述液體中所述物質(zhì)的量或濃度，意在防止、消除或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化，其中所述基質(zhì)含有a)固體支持物b)至少一種結(jié)合該固體支持物的間隔臂，并且，其偶聯(lián)至每一間隔臂c)含有至少一個(gè)具有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元的配體，所述配體具有定義的三維結(jié)構(gòu)，其在電荷和/或疏水性/親水性方面與所述物質(zhì)的結(jié)合基元的三維結(jié)構(gòu)互補(bǔ)，其中聚合物親和基質(zhì)能夠有選擇地結(jié)合所述一種或多種物質(zhì)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于除去內(nèi)毒素以減少液體中組分或過程所不希望有的活化的聚合物親和基質(zhì)，其中該基質(zhì)提供了具有與所述內(nèi)毒素的結(jié)合基元的三維結(jié)構(gòu)具有互補(bǔ)性的三維結(jié)構(gòu)配體，由此允許該內(nèi)毒素的結(jié)合。
在本發(fā)明聚合物親和基質(zhì)的優(yōu)選實(shí)施方案中，固體支持物為交聯(lián)的聚苯乙烯，間隔臂為聚乙二醇，配體的至少一個(gè)結(jié)合單元為氨基酸，并且每一官能團(tuán)為氨基或胍基。
在用于除去內(nèi)毒素以減少液體活化的優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物親和基質(zhì)中每個(gè)結(jié)合單元含有一個(gè)在或者接近血液生理pH的、帶正電荷的氨基酸，最優(yōu)選地精氨酸、賴氨酸、半胱氨酸或組氨酸，或另一個(gè)具有至少一個(gè)在或者接近血液生理pH的、帶正電荷的官能團(tuán)的二-或三-官能分子。這種聚合物親和基質(zhì)產(chǎn)生約1×102-1×106道爾頓的截流并且能用于結(jié)合疏水和/或親水物質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明涉及用于從液體除去一種或多種物質(zhì)和/或減少其在所述液體中的量或濃度以防止、消除或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化的方法，該方法包括將該液體與本發(fā)明的聚合物親和基質(zhì)接觸，接觸時(shí)間為足夠減少所述目標(biāo)物質(zhì)的量或濃度和/或除去所述目標(biāo)物質(zhì)的時(shí)間，優(yōu)選不超過24小時(shí)，最優(yōu)選1秒到2小時(shí)。然而，該期間取決于流速、柱大小和應(yīng)用模式，即該處置是否在直接體內(nèi)、間接體內(nèi)或體外進(jìn)行。優(yōu)選地，經(jīng)除去或減少后所述物質(zhì)的量或濃度低于血液中活化組分或過程的能力或者可防止血液中組分或過程的活化。
另一方面本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明聚合物親和基質(zhì)的方法，該方法包括下面的步驟a)將間隔臂連接至固體支持物以得到第一復(fù)合體和b)將配體連接至所述第一復(fù)合體，其中所述配體含有至少一個(gè)具有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元，或c)將間隔臂連接至含有至少一個(gè)具有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元的配體，以得到第二復(fù)合體，和d)將固體支持物連接至所述第二復(fù)合體，或e)將間隔臂連接至固體支持物以得到第一復(fù)合體，和f)在結(jié)合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體，或g)在固體支持物上通過接枝直接由單體合成間隔臂，和h)將含有至少一個(gè)具有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元的配體連接至所述第一復(fù)合體，或i)在固體支持物上通過接枝直接從單體合成間隔臂，和k)在結(jié)合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體，其中關(guān)于所要結(jié)合的物質(zhì)中結(jié)合基元的三維結(jié)構(gòu)、電荷和疏水/親水區(qū)的存在的信息收集自X射線晶體學(xué)、蛋白質(zhì)測序、蛋白質(zhì)建?；蚴杷院陀H水性計(jì)算，并且使得含有結(jié)合單元的配體在電荷和/或親水性/疏水性方面與所述物質(zhì)的結(jié)合基元互補(bǔ)。
另一方面，本發(fā)明涉及聚合物親和基質(zhì)的用途，用于從液體除去一種或多種物質(zhì)，優(yōu)選地內(nèi)毒素，或者減少所述液體優(yōu)選體液或治療性液體最優(yōu)選血液中該物質(zhì)的量或濃度。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于從液體除去一種或多種物質(zhì)和/或減少所述液體中該物質(zhì)的量或濃度，意在防止、消除或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化，所述試劑盒含有聚合物親和基質(zhì)，采樣管，和用于所述液體，優(yōu)選地血液或血清的體外和/或體內(nèi)處理的設(shè)備。
本發(fā)明聚合物親和基質(zhì)的使用將優(yōu)化對液體如血液、任何其他體液或治療性液體的處理，用于除去一種或多種物質(zhì)如內(nèi)毒素，和/或減少該物質(zhì)的量或濃度，以防止、消除或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化。
特別地，本發(fā)明的高度生物相容的和可灌注材料的使用對于聚合物親和基質(zhì)使用中防止液體的活化是重要的。這對于從敗血病患者的血漿或血液體外除去內(nèi)毒素尤其重要并且被公開為敗血癥、膿毒性休克和SIRS的潛在治療策略。作為另一益處，本發(fā)明聚合物親和基質(zhì)的使用將減少患者的治療時(shí)間。
當(dāng)與附圖和所附權(quán)利要求一起考慮時(shí)，從下面的詳細(xì)描述可以使得本發(fā)明的其他益處和特點(diǎn)更加明顯。
附圖簡述圖1是LPS分子的脂質(zhì)A部分與其結(jié)構(gòu)成分的示意圖。
圖2A和2B是本發(fā)明聚合物親和基質(zhì)的屬于樹狀結(jié)構(gòu)(2A)和梳狀結(jié)構(gòu)(2B)的配體的實(shí)例示意圖。
圖2C顯示了具有環(huán)狀配體結(jié)構(gòu)的聚合物親和基質(zhì)的實(shí)例。
圖3A-3B顯示怎樣通過使用結(jié)合基元中的結(jié)構(gòu)要求和正電荷、疏水區(qū)和最佳距離產(chǎn)生內(nèi)毒素的互補(bǔ)構(gòu)造的。
圖4描述了產(chǎn)生本發(fā)明聚合物親和基質(zhì)的不同方式。
圖5顯示與PS-PEG-珠子孵育不同時(shí)間點(diǎn)(1、10和120分鐘)后人血漿中內(nèi)毒素的水平。
圖6A-6G顯示與沒有基質(zhì)的珠子，即參照物(PS-PEG參照物)相比，將摻有LPS的血液用PS-PEG-Arg8珠子處理后對單核細(xì)胞中內(nèi)毒素誘導(dǎo)的胞內(nèi)IL6產(chǎn)生的抑制。
圖7A-7D顯示測量白細(xì)胞(WBC)和紅細(xì)胞(RBC)數(shù)、血小板(THR)數(shù)和血細(xì)胞比容(HCT)而顯示的PS-PEG Arg8珠子的生物相容性曲線。
圖8顯示在全血中使用PS-PEG-Arg8珠子后缺乏TCC(最終補(bǔ)體復(fù)合體)形成。
圖9顯示在全血中使用PS-PEG-Arg8珠子后沒有彈性蛋白酶釋放。
圖10顯示在全血中使用PS-PEG-Arg8珠子后沒有TAT(凝血酶-抗凝血酶III復(fù)合體)的形成。
圖11A-11B顯示含有經(jīng)優(yōu)化用于LPS結(jié)合的-Arg8和-Arg4結(jié)合單元的配體的三維結(jié)構(gòu)。
圖12a顯示PS-PEG-Arg8和PS-PEG-Arg4相對珠子質(zhì)量(克)的曲線擬合朗繆爾等溫線。
圖12B顯示PS-PEG-Arg8和PS-PEG-Arg4相對于精氨酸摩爾數(shù)的曲線擬合朗繆爾等溫線。
發(fā)明詳述如上所指出，本發(fā)明涉及用于從液體如血液、任何其他的體液或治療液體除去物質(zhì)以降低液體中組分或過程的活性，同時(shí)具有充分特異性以避免其他有價(jià)值的物質(zhì)例如血液的生理學(xué)組分被吸附的聚合物親和基質(zhì)。所述基質(zhì)提供了具有某一結(jié)構(gòu)的配體，該結(jié)構(gòu)與要去除或減少其量或濃度的物質(zhì)例如內(nèi)毒素的結(jié)合基元的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)。
定義在本發(fā)明上下文中，術(shù)語”除去...物質(zhì)”旨在表示防止、減少、降低、中和、失活、分解、修飾、清除、結(jié)合或掩蔽一種物質(zhì)，而不總是指該物質(zhì)的零量或零濃度。此外，術(shù)語“減少物質(zhì)的量或濃度”旨在指減少或降低液體中物質(zhì)的量或濃度足以防止或抑制液體中組分和/或液體中細(xì)胞和/或非細(xì)胞生物學(xué)的機(jī)制的活化。
術(shù)語“防止、消除或減少組分或過程的所不希望有的活化”指以直接或間接方法失活、抑制、降低、減少、縮小、減緩或防止液體中例如血液或組織細(xì)胞中某一化學(xué)物質(zhì)、生物學(xué)或生化過程，例如血漿蛋白質(zhì)級聯(lián)如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、補(bǔ)體或凝血過程和/或這些過程中所涉及組分的活化。物質(zhì)的“直接”除去反映該方法沒有任何中間步驟，而”間接”除去意味著除去長鏈反應(yīng)或級聯(lián)反應(yīng)一部分的物質(zhì)，而除去較早期的某一物質(zhì)將防止、減慢或抑制下游目標(biāo)事件。這意味著從例如血液除去一種物質(zhì)可得到失活的或者較少活化的血液。而且，此處意味著液體如血液活化的防止。
術(shù)語“液體”旨在包括任何液體，如任何氣體或液體，如懸浮液或溶液，包括常規(guī)的溶液，例如水性或有機(jī)溶液，或血液，任何體液或治療液體，用于生命科學(xué)應(yīng)用的液體如生物學(xué)的、診斷的或生物技術(shù)應(yīng)用中的液體，例如緩沖液、輸注液、或透析液，用于營養(yǎng)的液體和用于工業(yè)用途的液體。
該術(shù)語“體液”旨在包括血液、血漿、腦脊髓液、腹水和再輸注液體(例如血濃縮以后)、從健康供體得到的用于輸液的血液制品，如血漿、血小板濃縮物、紅血球濃縮物。
術(shù)語“治療液體”旨在包括手術(shù)環(huán)境中的腹膜透析液、血液透析濃縮物和透析用水、替換液/在線制備的液體、輸注液體、靜脈營養(yǎng)液體、灌洗液體和用于血液組分制備、血液代用品(例如氧氣載體，改性的血紅蛋白溶液，人工的血紅蛋白溶液)的液體。
術(shù)語“用于生命科學(xué)應(yīng)用的液體”旨在包括用于細(xì)胞培養(yǎng)組織工程、分子生物學(xué)(例如用于PCR技術(shù)的蛋白質(zhì)和酶溶液)、細(xì)菌學(xué)、分析學(xué)和藥物制劑的液體和/或介質(zhì)。
術(shù)語“用于營養(yǎng)的液體”旨在包括飲用水、戶外使用的液體和用于飲食濃縮物或粉末重構(gòu)的液體。
術(shù)語“固體支持物”旨在指固相或支持物或不溶基質(zhì)，在其上面可以用或不用銜接物或間隔臂合成或者偶聯(lián)分子，所述分子例如多肽形式的配體。
術(shù)語“官能團(tuán)”旨在指特定原子，或原子團(tuán)，其給予分子即本發(fā)明基質(zhì)中的結(jié)合單元例如氨基酸、脂肪酸、糖類、凝集素、核苷酸和它們的衍生物或它們的組合一種特定化學(xué)特性或結(jié)構(gòu)，例如正電荷或負(fù)電荷、疏水性或親水性、和/或其他的理化力，例如范德華力和芳基間的π-π-相互作用或形成其他鍵，如氫鍵或共價(jià)鍵的能力。氨基酸上官能團(tuán)的實(shí)例為-COOH，OH，-SH，胍基和-NH2，但是也可以是被取代的氨基或者帶正電荷的基團(tuán)或其混合物。
術(shù)語“結(jié)合單元”旨在指術(shù)語“官能團(tuán)”定義中如上所述的分子，其中所述分子負(fù)責(zé)結(jié)合將要除去和/或減少的物質(zhì)，含有至少一個(gè)官能團(tuán)并且被包括在本發(fā)明聚合物親和基質(zhì)中結(jié)合間隔臂的配體中。
術(shù)語“結(jié)合基元”旨在指將要除去的物質(zhì)上單一的或重復(fù)的三維結(jié)構(gòu)的和化學(xué)的基元。
術(shù)語“配體”指通過間隔臂結(jié)合到基質(zhì)的完整三維分子，即含有至少一個(gè)具有一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元。配體與將要除去的物質(zhì)上的結(jié)合基元形成三維互補(bǔ)結(jié)構(gòu)并結(jié)合到該結(jié)合基元。這里，“互補(bǔ)”旨在指三維和幾何上限定義的結(jié)構(gòu)，其特征是能夠與將要除去的物質(zhì)的結(jié)合基元以三維互補(bǔ)結(jié)構(gòu)精確配對。
與某一化合物相關(guān)的術(shù)語“其衍生物”指一種或多種這樣的化合物，它們被以這種方式衍生使得它們具有和原來的化合物具有相同的或基本相同的功能。
此外，構(gòu)成配體的化合物的異構(gòu)體也旨在包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它們顯示出和原來的化合物相同或基本相同的功能。在結(jié)構(gòu)式中，α和ε，根據(jù)用于氨基酸的命名法，定義用于共價(jià)偶聯(lián)其他分子的氨基。
術(shù)語“物質(zhì)”旨在指至少一種可溶或不可溶的組分或目標(biāo)分子，其旨在結(jié)合結(jié)合單元。物質(zhì)的實(shí)例為可活化血細(xì)胞的有毒物質(zhì)，如來自病毒和細(xì)菌的物質(zhì)，例如內(nèi)毒素、血細(xì)胞群體，如淋巴細(xì)胞、血小板、粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞；或者來自代謝活動的血液組分或產(chǎn)物，如葡萄糖衍生的分子或其降解產(chǎn)物、血液凝固蛋白質(zhì)、促凝血蛋白質(zhì)、炎性或促炎性蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、生長因素、激素、細(xì)胞因子、尿毒癥毒素，和巨噬細(xì)胞移行抑制因子。血液組分的實(shí)例為導(dǎo)致例如傳染性疾病的傳染性物質(zhì)，包括病毒顆粒、朊病毒，或寄生蟲、真菌、含有病原的血細(xì)胞，以及超過劑量的藥物、病原性食品添加劑或不是來自身體的其他組分。還包括致熱原，尤其是細(xì)菌性致熱原、細(xì)菌外毒素、革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)物，如脂胞壁酸(lipoteichonic acid)、來自慢性的急性的代謝障礙，作為例如糖尿病、肝病、尿毒癥或腎疾病或炎癥，以及粘連級聯(lián)(例如可溶性粘連分子)的產(chǎn)物。將要除去的優(yōu)選物質(zhì)為例如來自革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素，如LPS，以及細(xì)菌的DNA或片段或其降解產(chǎn)物，和寡核苷酸、肝素、磷酸鹽、血細(xì)胞、可溶的或細(xì)胞表面結(jié)合蛋白質(zhì)。
術(shù)語“間隔臂”旨在指形成鏈的分子，例如聚合物，其通過成為固體支持物的一部分并使具有至少一個(gè)含有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元的配體遠(yuǎn)離固體支持物并使得其較少受到來自固體支持物的位阻并且更容易被物質(zhì)，例如內(nèi)毒素、細(xì)胞群體或血液組分結(jié)合而修飾固體支持物。間隔臂分子可以是線性的和/或分支的和/或環(huán)狀形式。間隔臂長度在此處需要根據(jù)從將要除去的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)而預(yù)先確定。
術(shù)語“距離分子”旨在指配體內(nèi)的雙官能分子，其具有(如果想要)在結(jié)合單元和下面的通式I和II中定義的三官能分支分子之間和/或間隔臂和所述三官能分支分子之間產(chǎn)生結(jié)構(gòu)距離的功能。該距離分子也可以是環(huán)狀形式。
術(shù)語“致熱原”和尤其是“細(xì)菌性致熱原”定義了產(chǎn)生發(fā)燒，更通常為細(xì)菌來源的物質(zhì)，例如內(nèi)毒素。
這里，術(shù)語“生物相容性”旨在指缺乏或沒有活化例如細(xì)胞、凝結(jié)、補(bǔ)體級聯(lián)或類似的過程的活化能力，意思是基質(zhì)的使用不導(dǎo)致患者免疫系統(tǒng)的活化，或者至少如果這種活化發(fā)生，其也僅僅是微小的程度。這意味著生物相容化合物或物質(zhì)的使用不會導(dǎo)致例如血液或其他體液中組分或過程的任何不需要的或所不希望有的活化以及機(jī)械或脅迫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡或細(xì)胞裂解。
聚合物親和基質(zhì)為了在足夠結(jié)合和吸附各種物質(zhì)的本發(fā)明聚合物親和基質(zhì)中產(chǎn)生多樣性，配體可含有1-100個(gè)官能團(tuán)，優(yōu)選1-32個(gè)官能團(tuán)。
本發(fā)明的聚合物親和基質(zhì)可以是珠子、凝膠狀結(jié)構(gòu)、膜或膜的部分、薄膜或網(wǎng)或它們的組合形式。
特別地，當(dāng)基質(zhì)根據(jù)本發(fā)明組成時(shí)，其將產(chǎn)生約1×102到1×106道爾頓的限定截留并且沒有任何限制地結(jié)合疏水和親水物質(zhì)。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，聚合物親和基質(zhì)為PS-PEG珠子(例如TentaGel，可從Rapp Polymere Tubingen得到)的形式，使用PEG作為間隔臂。用作間隔臂的PEG的優(yōu)點(diǎn)為在有機(jī)和水性溶劑中珠子的良好膨脹性，并由于其半流體性質(zhì)，其允許如在液體中類似的擴(kuò)散過程，所述液體優(yōu)選地?cái)U(kuò)散系數(shù)接近于水，即40％。
生物相容性根據(jù)本發(fā)明，聚合物親和基質(zhì)當(dāng)被用于專門應(yīng)用，如全血的體外處理時(shí)顯示出高生物相容性的優(yōu)選形式。高生物相容性意味著某些特征將比其他的特征更重要。例如，無補(bǔ)體激活是重要的，補(bǔ)體激活通過測定早期復(fù)合體形成和根據(jù)Deppisch等(Kidney Int.37696-706)進(jìn)行終末補(bǔ)體復(fù)合體定量。此外，患者期望低的血栓形成。血栓形成的程度根據(jù)Deppisch等(Neuphrol.Dial.Transplant Suppl.317-23，1994)通過凝血酶-抗凝血酶III復(fù)合體(TAT)的定量來測量，并且在血液或血漿處理中不應(yīng)該增加。此外，還包括處理前后白細(xì)胞和紅細(xì)胞穩(wěn)定的血細(xì)胞數(shù)以及沒有由于接觸而引起的細(xì)胞活化。穩(wěn)定的血細(xì)胞數(shù)指低程度的或基本上沒有由于脅迫、活化或機(jī)械損傷導(dǎo)致的對血細(xì)胞的傷害。
蛋白酶如通過例如粒細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞活化時(shí)產(chǎn)生的彈性蛋白酶在患有細(xì)菌性敗血癥和膿毒性休克的患者中不斷增加((Heiden等，Thromb.Hemost.1996)。嗜中性彈性蛋白酶也被建議作為感染的早期和有效的標(biāo)志物(Jensen等，Scand.J Clin.Lab.Invest，1996；Groenenveld等，Cytokine，1995)。彈性蛋白酶的測量可給出關(guān)于生物相容性的額外信息，并且因此其水平不應(yīng)該在血液處理過程中變化。
配體為了能夠產(chǎn)生與所要除去的物質(zhì)如內(nèi)毒素的結(jié)合基元互補(bǔ)的配體，必須形成三維結(jié)構(gòu)。這可通過使用例如彈性的或剛性多肽結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)可以以最佳方法容易地合成所要求的三維結(jié)構(gòu)。這種聚合物可以是線性的或分支的，例如為樹-或梳狀結(jié)構(gòu)或環(huán)狀結(jié)構(gòu)。對這種三維結(jié)構(gòu)的形成有益的是使用氨基酸，因?yàn)樗鼈兲峁┝吮拘陨系膹椥?。偶?lián)這種聚合物例如多肽的化學(xué)過程是本領(lǐng)域中熟知的。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這種聚合物指含有一個(gè)以上，通常多達(dá)約一百個(gè)氨基酸的聚合物，即通過肽鍵相互連接的寡聚體。線性聚合物的實(shí)例為通過相鄰殘基的α-羧基和α-氨基之間的酰胺鍵形成的多肽或寡肽，分支聚合物的實(shí)例為通過包括一種或多種非α氨基的酰胺鍵形成的多肽或寡肽。
如上所述，該配體分子可以是環(huán)狀形式。通過配體結(jié)構(gòu)內(nèi)兩個(gè)適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)之間的共價(jià)偶聯(lián)，例如通過氧化在兩個(gè)SH基團(tuán)之間的二硫鍵(-SS-)(也在天然的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中發(fā)生的環(huán)化反應(yīng))形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
圖2A和2B顯示與結(jié)合到固體支持物的間隔臂相偶聯(lián)的配體的分別為不同分支的、樹狀的和梳狀結(jié)構(gòu)的實(shí)例。在這些結(jié)構(gòu)中，配體基本上由賴氨酸殘基建成，并且每個(gè)配體中結(jié)合單元為精氨酸殘基。本發(fā)明的聚合物親和基質(zhì)中包括的配體可以兩個(gè)下面的式子代表通式I-X1n-Ym[X2i-Z1；X3j-Z2]1/2(m+1)在代表樹狀結(jié)構(gòu)的通式I中，不同符號具有下面的意義n＝0或1；m＝2k-1；k＝0到10，其中如果k＝0，那么X2＝X3并且Z1＝Z2；i＝0或1；并且j＝0或1，通式II-(X1n-Y1[Y2m[X2i-Z1；X3j-Z2]1/2(m+1))r-X4p-Z3]在代表梳狀結(jié)構(gòu)的通式II中，不同的符號具有下面的意義
n＝0或1；m＝2k-1；k＝0到10，其中如果k＝0那么X2＝X3并且Z1＝Z2；r＝1-100；i＝0或1；j＝0或1；且p＝0或1。
Z1，Z2和Z3每一代表結(jié)合單元，并且每一為有機(jī)分子，所述有機(jī)分子選自氨基酸、肽、脂肪酸、糖類、凝集素、核苷酸及它們的衍生物或它們的組合，其中Y，Y1和Y2每一代表三官能分支分子，其中含有的官能團(tuán)選自氨基、羥基、醛、異氰酸根、異硫氰酸根、硫醇、馬來酰亞胺、環(huán)氧及它們的衍生物或它們的組合，并且其中X1，X2和X3每一為任選的雙官能距離分子，其含有的兩個(gè)官能團(tuán)選自氨基、羧基、羥基、醛、異氰酸根、異硫氰酸根、硫醇、馬來酰亞胺、環(huán)氧及它們的衍生物或它們的組合。
圖2C中顯示了具有環(huán)狀配體結(jié)構(gòu)的聚合物親和基質(zhì)的實(shí)例。在該結(jié)構(gòu)式中R指-Lysm[Arg](m+1)，其中m＝2k-1，并且顯示了其中k＝0，1，和2的實(shí)例。
從而，本發(fā)明聚合物親和基質(zhì)中配體的至少一個(gè)結(jié)合單元含有至少一個(gè)官能團(tuán)，優(yōu)選地氨基或胍基或取代的氨基或至少一個(gè)所述官能團(tuán)。
優(yōu)選地，選擇的氨基酸所具特征是在或接近生理pH特別是血液pH≥7.2時(shí)帶正電荷的，即pK約≥6.0的氨基酸。這些優(yōu)選的氨基酸的實(shí)例為精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His)。所述氨基酸的混合物也可用于基質(zhì)的配體以產(chǎn)生進(jìn)一步的可變性。
最優(yōu)選地，配體含有作為結(jié)合單元的精氨酸并且組成≤3毫摩爾/g基質(zhì)。通常，氨基酸的量至少約為0.01-5毫摩爾/g基質(zhì)。
在實(shí)施方案中，當(dāng)分支配體的結(jié)合單元含有精氨酸時(shí)，每個(gè)配體的精氨酸數(shù)目為2-100個(gè)精氨酸分子，優(yōu)選地4-8個(gè)分子，稱為Arg4-8。此外，通過使用三官能即含有三個(gè)官能團(tuán)(這里為兩個(gè)氨基和一個(gè)羧基)的氨基酸，如賴氨酸，可以產(chǎn)生分支結(jié)構(gòu)。這種使用所謂的多重抗原性肽MAP的方法已經(jīng)被Tam等介紹并且在美國專利號5,229,490中描述。通過改變分支的數(shù)目，可以改變末端基團(tuán)例如含有末端正電荷官能團(tuán)的帶正電荷精氨酸的簇和距離，如以上及圖2中所討論的。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，其中內(nèi)毒素為將要通過聚合物親和基質(zhì)除去的物質(zhì)，氨基酸官能團(tuán)的正電荷保持一定距離，該距離通過如圖3中所示的內(nèi)毒素中單個(gè)帶負(fù)電的磷酸基之間的距離定義。
如上面所討論的，氨基酸的量和構(gòu)型產(chǎn)生聚合物親和基質(zhì)中互補(bǔ)配體的可變性，并因此可變以產(chǎn)生足夠的可變性用于吸附多種物質(zhì)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸的量為至少約0.01、0.1、1、2、3、4或5毫摩爾/g基質(zhì)。
設(shè)計(jì)含有結(jié)合單元的配體為了獲得物質(zhì)的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，從本領(lǐng)域公知的方法收集信息用于研究關(guān)于結(jié)構(gòu)、保持一定距離的正電荷的存在以及與帶電基團(tuán)接近的疏水區(qū)存在的關(guān)系，例如通過如在實(shí)施例1中所描述的及圖3和11中所示的X射線晶體學(xué)、蛋白質(zhì)測序、蛋白質(zhì)建?；蚴杷院陀H水性計(jì)算。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，所要除去的物質(zhì)為內(nèi)毒素，如含有脂質(zhì)A的LPS，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的關(guān)于例如分子內(nèi)帶電磷酸基之間的結(jié)構(gòu)和距離的信息被用于形成聚合物親和基質(zhì)中具有至少一個(gè)結(jié)合單元的配體。該實(shí)施方案中形成配體的聚合物通過氨基酸例如精氨酸和/或賴氨酸合成。然而，也可使用其他的氨基酸，如組氨酸或半胱氨酸。
在作為與將要除去的物質(zhì)例如內(nèi)毒素的結(jié)合基元互補(bǔ)部分的本發(fā)明Arg4-8實(shí)施方案中，作為結(jié)合單元的所述精氨酸具有下列性質(zhì)以除去內(nèi)毒素，如圖3所示a)存在保持一定距離的正電荷，該距離最佳地符合脂質(zhì)A中帶負(fù)電的磷酸基的距離，b)接近帶電基團(tuán)的疏水區(qū)允許與脂質(zhì)A的脂肪酸部分進(jìn)行疏水性相互作用，和
c)a)和b)中所述性質(zhì)的組合產(chǎn)生允許最佳結(jié)合的脂質(zhì)A的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。
間隔臂本發(fā)明的聚合物親和基質(zhì)含有間隔臂，其基本上為疏水的或親水的，通過成為固體支持物的一部分而修飾固體支持物，并且具有配體的錨定部分的功能，所述配體含有至少一個(gè)具有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元。
優(yōu)選地，聚乙二醇(PEG)被用作間隔臂分子，其為線性的或分支構(gòu)型，優(yōu)選的平均分子量為400-10 000道爾頓并且通過式H-(OCH2CH2)n-OH代表，其中n為約2-250。PEG鏈的靈活性使得毒素分子容易接近配體聚合物的三維結(jié)構(gòu)中。
此外，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以為固體支持物提供相同或不同種類的兩個(gè)或更多間隔臂，例如聚乙二醇、聚環(huán)氧丙烷、聚乙烯醇、聚乙烯胺、聚縮水甘油(polyglycidoles)或聚乙烯亞胺和其衍生物。
備選地，例如當(dāng)所要結(jié)合的物質(zhì)的互補(bǔ)結(jié)合基元的三維結(jié)構(gòu)允許沒有間隔臂而發(fā)生結(jié)合時(shí)，不要求在聚合物親和基質(zhì)中存在間隔臂。從而，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，結(jié)合單元直接結(jié)合固體支持物。
固體支持物固體支持物應(yīng)該在多孔性和大小排阻特征中提供可變性。并且，它應(yīng)該提供固相合成中的支持用于優(yōu)選實(shí)施方案中的多肽合成?？捎糜诒景l(fā)明的不同固體支持物即聚合物在EP 0 187 391，WO 99/17120和美國專利號4,908,405中描述。這里，固體支持物為線性的和/或分支的生物相容的具有0.05-10％交聯(lián)度的接枝共聚物，并且選自聚乙烯醇、聚羥基苯乙烯、從氯甲基化聚苯乙烯和乙二醇產(chǎn)生的聚合物；式H-(OCH2CH2)nOH的聚-或寡乙二醇，其中n代表2到250，用羥基官能化的聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯；和其衍生物。本發(fā)明中，上面提到的交聯(lián)度可以高達(dá)50％。
固體支持物材料除上面提到的之外還選自聚苯乙烯，羥基烷基-聚苯乙烯，羥基芳基-聚苯乙烯，羥基烷基芳基聚苯乙烯，多羥基烷基化聚苯乙烯，多羥基芳基化聚苯乙烯，異氰酸根合烷基-聚苯乙烯，異氰酸根合芳基-聚苯乙烯，羧基烷基-聚苯乙烯，羧基芳基-聚苯乙烯，氨基烷基-聚苯乙烯，氨基芳基-聚苯乙烯，交聯(lián)的聚乙二醇，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，纖維素，硅石，糖類，乳膠，環(huán)烯共聚物，玻璃，其他適宜的聚合物或它們的組合。固體支持物的形式可以是珠子，膜，顆粒，例如納顆粒，網(wǎng)，織造織物和非織造織物，纖維簇，管，薄膜，薄片或它們的組合，或交聯(lián)的互穿網(wǎng)絡(luò)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，如上所述的親和基質(zhì)由交聯(lián)的聚苯乙烯組成，PEG作為間隔臂接枝到交聯(lián)的聚苯乙烯上。
本發(fā)明中優(yōu)選的固體支持物材料為珠子，其大小足夠提供高度可灌注和生物相容的支持體，例如聚苯乙烯，優(yōu)選地與作為間隔臂的PEG組合，賴氨酸和/或精氨酸連接于間隔臂上，該珠子應(yīng)該對親水或疏水物質(zhì)沒有限制。適宜的可通過商業(yè)途徑得到的珠子的列表如表1所示。
表1商業(yè)途徑可得到的活化的珠子aToyo Pearl HW70EC(TosoHaas)Toyo Pearl HW65EC(TosoHaas)Toyo Pearl AF650M(TosoHaas)TentaGel(Rapp Polymer)Eupergit C250L(Rohm)Eupergit 250(Rhm)Fractogel EMD Epoxy(M)(Merck)Fractogel EMD Azlactone(S)(Merck)Poros EP(Perkin Elmer-Biosystems)a可調(diào)節(jié)上面商業(yè)途徑可得到的活化的珠子用于配體的固定聚合物親和基質(zhì)的可灌注性當(dāng)聚合物親和基質(zhì)被水合，并且由于水合膨脹時(shí)形成水凝膠樣結(jié)構(gòu)。膨脹量定義為由于聚合物的水合從干燥狀態(tài)形成水合和膠狀基質(zhì)的膨脹。這種膨脹可被定義為當(dāng)水合時(shí)每體積單位重量增加，并且當(dāng)比較干燥和水合形式的聚合物親和基質(zhì)時(shí)，其可根據(jù)本發(fā)明為約1.5-10倍，優(yōu)選3-5倍。該溶脹度允許全血完全地灌注穿過基質(zhì)，仍然保持血細(xì)胞和數(shù)目完整。
如上所述，在優(yōu)選實(shí)施方案中，這種聚合物親和基質(zhì)產(chǎn)生具有允許血細(xì)胞灌注的約1×102-1×106道爾頓的限定的截留并且對親水和/或疏水物質(zhì)幾乎沒有限制的基質(zhì)。
除去物質(zhì)的方法本發(fā)明還涉及從液體除去一種或多種物質(zhì)和/或減少所述液體中該物質(zhì)的量或濃度以防止、消除或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化的方法，其包括將液體與本發(fā)明的聚合物親和基質(zhì)接觸足以減少所述物質(zhì)的量或濃度和/或除去所述物質(zhì)的時(shí)間。在使用該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，從血液或任何其他的體液除去物質(zhì)例如內(nèi)毒素，將因此直接或間接地防止例如血細(xì)胞通過結(jié)合上面對“物質(zhì)”定義下所列的所不希望有的物質(zhì)的活化。優(yōu)選地，這可通過將液體與上面定義的聚合物親和基質(zhì)接觸不超過24小時(shí)，最優(yōu)選1秒到2小時(shí)的時(shí)期，得到較少活化的血液和組分或防止它們的活化。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明中公開的方法除去的物質(zhì)為內(nèi)毒素。本發(fā)明還涉及定義的血細(xì)胞類型或群體的除去，這些血細(xì)胞類型或群體選自白細(xì)胞例如T細(xì)胞和B細(xì)胞單核細(xì)胞、血小板、粒細(xì)胞和/或嗜中性粒細(xì)胞。通過提供含有至少一個(gè)結(jié)合單元和具有與物質(zhì)的結(jié)合基元的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)的配體，還打算通過上述聚合物基質(zhì)除去的為胞外或胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的組分，它們選自葡萄糖和其降解產(chǎn)物、羰基化合物、炎性和促炎性蛋白質(zhì)和/或參與血栓形成或補(bǔ)體級聯(lián)中的蛋白質(zhì)、來自細(xì)菌的成分、內(nèi)毒素、細(xì)胞、血細(xì)胞、細(xì)菌和病毒、或含有病原的血細(xì)胞、或其至少部分或降解產(chǎn)物、DNA或其片段、或磷酸鹽。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，內(nèi)毒素，例如LPS，在例如靜態(tài)孵育或固相柱灌注期間在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)被除去而小于50％。
在該優(yōu)選實(shí)施方案中，內(nèi)毒素約1秒到約且包括2小時(shí)的限定時(shí)間期間被除去至使血液失活或防止血液的活化的量，如根據(jù)LAL測定法所測量的，該測定法如下所述。使用LAL測定法是本領(lǐng)域中公知的并且將提供關(guān)于內(nèi)毒素水平的信息。根據(jù)本發(fā)明的方法(該方法是快速且有效的)在1秒-2小時(shí)的上述時(shí)間期限內(nèi)將產(chǎn)生根據(jù)LAL測定法的內(nèi)毒素水平，該內(nèi)毒素水平低于活化血液的能力，或者僅僅輕微地活化血細(xì)胞和組分。
產(chǎn)生聚合物親和基質(zhì)的方法產(chǎn)生本發(fā)明的聚合物親和基質(zhì)的方法包括以下步驟a)將間隔臂連接至固體支持物以得到第一復(fù)合體和b)將配體連接至所述第一復(fù)合體，其中所述配體含有至少一個(gè)具有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元，或c)將間隔臂連接至含有至少一個(gè)具有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元的配體，以得到第二復(fù)合體，和d)將固體支持物連接至所述第二復(fù)合體，或e)將間隔臂連接至固體支持物以得到第一復(fù)合體，和f)在結(jié)合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體，或g)在固體支持物上通過接枝直接由單體合成間隔臂，和h)將含有至少一個(gè)具有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元的配體連接至所述第一復(fù)合體，或i)在固體支持物上通過接枝直接從單體合成間隔臂，和k)在結(jié)合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體，其中關(guān)于所要結(jié)合的物質(zhì)中結(jié)合基元的三維結(jié)構(gòu)、電荷和疏水/親水區(qū)的存在的信息收集自X射線晶體學(xué)、蛋白質(zhì)測序、蛋白質(zhì)建?；蚴杷院陀H水性計(jì)算，并且使得含有結(jié)合單元的配體在電荷和/或親水性/疏水性方面與所述物質(zhì)的結(jié)合基元互補(bǔ)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，上述方法還包括根據(jù)下面的方法產(chǎn)生含有具有固定于固體支持物上的配體的間隔臂分子的基質(zhì)，如在圖4中詳細(xì)顯示的那樣；對于上面的a)和b)活化固體支持物，將間隔臂分子偶聯(lián)至固體支持物，合成含有結(jié)合單元的配體，和將配體定點(diǎn)偶聯(lián)至間隔臂分子，或?qū)τ谏厦娴腸)和d)合成含有結(jié)合單元的配體，將間隔臂分子偶聯(lián)至配體，活化固體支持物，和將間隔臂配體復(fù)合體定點(diǎn)偶聯(lián)至活化的固體支持物，或，對于上面的e和f)活化固體支持物，將間隔臂分子偶聯(lián)至活化的固體支持物，和在該支持體上固相合成含有結(jié)合單元的配體。
上述含有步驟a)-f)的方法還在第二個(gè)實(shí)施方案中包括以下特定步驟，對于a)和b)，活化間隔臂，將活化的間隔臂偶聯(lián)至固體支持物，和將配體偶聯(lián)至所述活化的間隔臂，或，對于c)和d)，合成配體，活化間隔臂，將配體定點(diǎn)偶聯(lián)至活化的間隔臂分子，和將間隔臂-配體復(fù)合體偶聯(lián)至固體支持物，或者，對于e)和f)，活化間隔臂，將活化的間隔臂偶聯(lián)至固體支持物，和在結(jié)合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體。
如上所述，通過本發(fā)明優(yōu)選的為上面的方法，其中通過活化固體支持物、偶聯(lián)間隔臂分子和在固體支持物上直接固相合成含有結(jié)合單元的配體來固定固體支持物、間隔臂和配體。
聚合物親和基質(zhì)的用途本發(fā)明還涉及使用本發(fā)明的聚合物親和基質(zhì)，優(yōu)選地用于從液體除去一種或多種物質(zhì)，優(yōu)選地內(nèi)毒素，或減少所述液體中的量或濃度，優(yōu)選地體液或治療性液體，最優(yōu)選地血液，尤其用于產(chǎn)生較少活化的血液或防止血液中組分或過程的所不希望有的活化。聚合物親和基質(zhì)優(yōu)選地用作體外血液凈化過程或與血液或血流接觸的部分，例如作為接觸血液或體液，例如血管系統(tǒng)，血管或腹膜腔的身體植入物。
含有聚合物親和基質(zhì)的試劑盒在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及從液體除去一種或多種物質(zhì)和/或減少所述液體中該物質(zhì)的量或濃度意在防止、消除或減少所述液體中組分的所不希望有的活化的試劑盒，所述試劑盒含有根據(jù)本發(fā)明的聚合物親和基質(zhì)采樣管和用于所述液體，優(yōu)選地血液或血漿的體外和/或體內(nèi)處理的設(shè)備。
結(jié)論本發(fā)明提供了以高效且省時(shí)的方法從液體除去物質(zhì)的方法。這通過利用高度生物相容的且由于好的溶脹度而允許全血流過本發(fā)明的聚合物親和基質(zhì)而實(shí)現(xiàn)。該有效方法也歸因于產(chǎn)生含有與所要除去的物質(zhì)的結(jié)合基元互補(bǔ)的結(jié)合單元的配體。因此，本發(fā)明可應(yīng)用于例如體外血液處理如治療性應(yīng)用的透析和輸液醫(yī)學(xué)，干細(xì)胞治療和/或治療性細(xì)胞療法，診斷應(yīng)用以及用于生物技術(shù)，生物工程，基因技術(shù)，食品化學(xué)和水制備和/或純化。
本發(fā)明還涉及聚合物基質(zhì)的用途，用于產(chǎn)生從液體除去一種或多種物質(zhì)或者減少所述液體中該物質(zhì)的量或濃度的聚合物親和基質(zhì)，其中特異親和性取決于應(yīng)用于聚合物基質(zhì)上的配體，其中聚合物基質(zhì)包括固體支持物和間隔臂，其中固體支持物由選自聚苯乙烯，聚乙烯醇，聚羥基苯乙烯，由氯甲基化聚苯乙烯或聚丙烯酸酯產(chǎn)生的聚合物，用羥基官能化的聚甲基丙烯酸酯，羥烷基聚苯乙烯，羥基芳基-聚苯乙烯，羥烷基-芳基-聚苯乙烯，多羥基烷基化聚苯乙烯，多羥基芳基化聚苯乙烯，異氰酸根合烷基-聚苯乙烯，異氰酸根合芳基-聚苯乙烯，羧基烷基-聚苯乙烯，羧基芳基-聚苯乙烯，氨基烷基-聚苯乙烯，氨基芳基-聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，交聯(lián)的聚乙二醇，纖維素，硅石，糖類，乳膠，環(huán)烯共聚物，玻璃或它們的組合，優(yōu)選交聯(lián)的聚苯乙烯，并且其中間隔臂選自式H-(OCH2CH2)n-OH的聚-或寡乙二醇，其中n代表2-250。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，固體支持物具有珠子，凝膠，膜，顆粒，網(wǎng)，織造的和非織造織物，纖維簇，管，薄膜，薄片或它們的組合，或交聯(lián)的互穿網(wǎng)絡(luò)的形式。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，間隔臂是線性和/或分支構(gòu)型的聚乙二醇(PEG)并且具有400-10 000道爾頓的平均分子量或其衍生物。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)具有充足的溶脹度以允許血漿或全血的灌注。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)的溶脹度約1.5-20倍，優(yōu)選地2-6倍，從干燥狀態(tài)到水合形式。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)具有凝膠類型珠子的形式。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述液體為水性或有機(jī)溶液、體液優(yōu)選血液、治療性液體、用于生命科學(xué)應(yīng)用的液體優(yōu)選為生物學(xué)的、診斷的或生物技術(shù)應(yīng)用中的緩沖液、輸注液或透析液、從健康供體得到的血液制品比如用于輸注的血漿、血小板濃縮物、紅血球濃縮物、血液替代物優(yōu)選地載氧體、經(jīng)修飾的血紅蛋白溶液和人造血紅蛋白溶液、用于營養(yǎng)的液體和工業(yè)用途的液體。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)約1×102到約1×106道爾頓的截留值(cut off value)并且結(jié)合疏水和/或親水物質(zhì)。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，固體支持物為交聯(lián)的聚苯乙烯，間隔臂為聚乙二醇。
體外血液處理中可適用的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)的合理開發(fā)需要(i)合成配體的靈活技術(shù)和(ii)對生物相容性、毒理學(xué)和加工性能的基本要求。應(yīng)用固相肽合成得到在生物相容的聚合物物質(zhì)上裝配的充分定義的配體結(jié)構(gòu)，其根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案為對生物學(xué)物質(zhì)特異的聚苯乙烯-聚乙二醇的接枝共聚物。
通過系統(tǒng)地改變配體基元的幾何結(jié)構(gòu)，我們可以證明相對于結(jié)構(gòu)單元的摩爾濃度，配體親和性增加10到100倍。這些研究在人血清中即存在競爭性蛋白質(zhì)時(shí)進(jìn)行。
通過在人血漿和/或全血中體外測定法進(jìn)行血液相容性的評定。有或者沒有配體的PS-PEG基材在補(bǔ)體激活、接觸活化、細(xì)胞毒性和粒細(xì)胞活化方面是生物相容的。
基礎(chǔ)聚合物結(jié)構(gòu)尤其對于體外應(yīng)用顯示出有利的生物相容性特征。用于配體合成的技術(shù)允許處理特異性聚合物材料而不產(chǎn)生有毒殘留物。
實(shí)施例實(shí)施例1 含有LPS結(jié)合單元的配體的設(shè)計(jì)該實(shí)施例描述了(不限制本發(fā)明)用于除去LPS的含有結(jié)合單元的配體的設(shè)計(jì)。
原理毒素(例如LPS)的有效除去需要具有與所要除去的物質(zhì)的結(jié)合基元互補(bǔ)的結(jié)合單元的配體。這包括所要除去的物質(zhì)的三維方面和分子的精確安排以優(yōu)化對特征像互補(bǔ)電荷、疏水性和親水性的生物特定識別。這與前面提到的特征的適當(dāng)距離一起，將完成配體及其結(jié)合單元。而且，聚合物基質(zhì)內(nèi)這種配體的總的三維展示應(yīng)該對于高灌注、配體展示和配體的柔韌性在空間上是最佳的。高生物相容性仍然是患者體內(nèi)和體外血液純化的先決條件。在所描述的基質(zhì)中，可及性比得上乃至和非固相水性溶液相同。LPS的結(jié)構(gòu)在圖1中顯示。所提出的與LPS的互補(bǔ)結(jié)合在圖3A-D顯示，其中認(rèn)為LPS的磷酸基和疏水尾部形成互補(bǔ)的結(jié)合基元。建議的結(jié)構(gòu)顯示的是圖2中的Arg4和Arg8并在圖11中以三維形式顯示。Arg8在圖11B的左邊圖中顯示了一半的精氨酸位置并在右邊圖中顯示了另一半的位置。此外，顯示了間隔臂(這里為PEG)的連接。
分子模擬進(jìn)一步應(yīng)用分子模擬以檢驗(yàn)該描述的結(jié)合部位的三維幾何和化學(xué)結(jié)構(gòu)。在Silicon Graphics Octane2工作站上進(jìn)行模擬，使用InsightII-Package Molecular Simulations Inc.(MSI)，圣地亞哥，CA)和其中包括的優(yōu)化算法，例如AMBER-力場。分別在圖11A和B中顯示關(guān)于Arg4和Arg8的樹狀空間排列的結(jié)果。這里，插圖顯示基質(zhì)的三維終末部分的原理，該基質(zhì)沒有PEG間隔臂或固體支持物。
配體的合成根據(jù)圖4合成配體及其結(jié)合單元，其中圖解了三個(gè)不同路線。三種方法中優(yōu)選的方法是直接在連接至固體支持物的PEG間隔臂上固相合成。在其他實(shí)施例中使用此處的結(jié)合單元。
實(shí)施例2 分支和線性配體的比較該實(shí)施例描述對來自人血漿的內(nèi)毒素的吸附。該實(shí)施例還顯示用于吸附內(nèi)毒素的線性的和分支配體之間的比較。
原理將珠子與肝素化人血漿孵育兩個(gè)小時(shí)。孵育兩個(gè)小時(shí)后使用LAL測定法確定內(nèi)毒素水平。
材料使用下面的珠子

步驟在37℃于肝素化血漿中進(jìn)行珠子的孵育。緩慢攪拌樣品并在孵育2小時(shí)后通過離心除去珠子。
分析進(jìn)行LAL測定法以測定用珠子孵育后內(nèi)毒素水平。通過LAL誘導(dǎo)的生色物質(zhì)反應(yīng)進(jìn)行測定(Chromogenics，Mlndal，瑞典)。根據(jù)在肝素化人血漿中用指定濃度的內(nèi)毒素得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算水平。
結(jié)果使用LAL測定法在2小時(shí)的孵育后發(fā)現(xiàn)下面的內(nèi)毒素濃度。
內(nèi)毒素(IU)/mlPS-PEG-LBP 94-108 10PS-PEG-BPI 85-99 9PS-PEG-Arg82PS-PEG-NH-Ac 10無珠子8起始值10討論該實(shí)驗(yàn)表明通過在PS-PEG-珠子上使用分支的三維基質(zhì)，內(nèi)毒素水平可以減少5倍。具有線性配體的珠子沒有那么有效并且在這些樣品中內(nèi)毒素水平仍然在或接近內(nèi)毒素的起始水平。
實(shí)施例3 內(nèi)毒素結(jié)合的動力學(xué)該實(shí)施例顯示當(dāng)具有三維基質(zhì)，優(yōu)選用于LPS結(jié)合的珠子與血漿孵育并在不同時(shí)間點(diǎn)分析時(shí)內(nèi)毒素結(jié)合的動力學(xué)。
原理吸附動力學(xué)取決于聚合物基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和交聯(lián)程度。珠子與肝素化人血漿孵育。1、10和120分鐘后取出樣品。使用LAL測定法確定內(nèi)毒素水平。
材料使用下面的珠子

步驟在37℃于肝素化血漿中進(jìn)行珠子的孵育。緩慢攪拌樣品并在孵育1，10，120分鐘后去除樣品。通過離心去除珠子。
分析如實(shí)施例2中進(jìn)行LAL測定法以定量內(nèi)毒素水平。
結(jié)果圖5顯示在不同時(shí)間點(diǎn)測量的內(nèi)毒素水平的結(jié)果。該圖顯示需要2小時(shí)以有效除去，即產(chǎn)生樣品起始水平的20-30％內(nèi)毒素剩余。含有精氨酸(PS-PEG-Arg)的線性配體僅僅除去內(nèi)毒素量的一半，即120分鐘后處于60％剩余水平上。類似地，當(dāng)加入?yún)⒖贾樽?PS-PEG-NH-Ac)時(shí)，與珠子孵育120分鐘后內(nèi)毒素的量仍然未變，即處于起始值。
實(shí)施例4 聚合物的末端氨基酸和分支的影響該實(shí)驗(yàn)顯示配體的末端氨基酸和(精氨酸與賴氨酸相比較)的影響和分支、非分支的與4-倍對8-倍分支相比較的影響。
原理珠子與有或者沒有內(nèi)毒素的肝素化人血漿孵育。兩個(gè)小時(shí)后使用LAL測定法確定內(nèi)毒素水平。
材料使用下面的珠子

分析如實(shí)施例2中所示進(jìn)行LAL測定法。
結(jié)果內(nèi)毒素(IU/ml)PS-PEG-Arg80.4PS-PEG-Lys81.8PS-PEG-Arg40.01PS-PEG-Lys42.7PS-PEG-NH-Ac 7.8PS-PEG-Arg 3.5無珠子 11孵育前，即起始值 13討論該結(jié)果表明分支配體比線性配體更有效，并且在內(nèi)毒素的去除中精氨酸比賴氨酸有效幾倍(對于Arg8和Arg4分別為4倍和200倍)。而且，在孵育2小時(shí)后除去內(nèi)毒素方面PS-PEG-Arg4最有效。
實(shí)施例5 在CD14+單核細(xì)胞中內(nèi)毒素依賴的IL6誘生的減少該實(shí)施例描述通過使用PS-PE-Arg8減少人單核細(xì)胞中依賴內(nèi)毒素進(jìn)行的IL6誘導(dǎo)。
原理單核細(xì)胞應(yīng)答LPS導(dǎo)致開始轉(zhuǎn)錄和表達(dá)IL6。上調(diào)的IL6水平可以在4小時(shí)后通過胞內(nèi)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法分析(FACS)測量。
材料使用來自全血的人單核細(xì)胞。PS-PEG-Arg8用于除去內(nèi)毒素并且PS-PEG-NH-Ac被包括作為對照物。脂多糖(大腸桿菌菌株055B5，來自Biowittaker Co.)用于體外刺激MNC。使用FACSCAN Calibur(BecktonDickinson)進(jìn)行FACS分析。
步驟用10或30 IU/ml LPS在37℃(5％CO2)孵育全血30分鐘。樣品平行地用和不用PS-PEG-Arg8珠子以及對照珠子PS-PEG-NH-Ac進(jìn)行孵育。細(xì)胞在PermFix(Beckton Dickinson)中固定并用抗-CD14-FITC和抗-IL6-PE進(jìn)行復(fù)染色。每個(gè)細(xì)胞樣品計(jì)數(shù)20 000個(gè)細(xì)胞，用于FACS分析。單核細(xì)胞定義為正常地組成總細(xì)胞群體的約5％的CD14+細(xì)胞。
分析單核細(xì)胞定義為細(xì)胞懸浮液中的CD14+細(xì)胞。胞內(nèi)IL6(icIL6)根據(jù)內(nèi)標(biāo)校正，并在細(xì)胞與10或30IU/ml LPS孵育30分鐘后使用FACS分析在CD14+細(xì)胞群體中定量。使用CellQuest軟件包(Beckton Dickinson)進(jìn)行計(jì)算。
結(jié)果使用FACS數(shù)據(jù)和對其進(jìn)行的計(jì)算，由本領(lǐng)域技術(shù)人員對CD14+單核細(xì)胞群體的分析產(chǎn)生下面在圖6中顯示的數(shù)據(jù)。該圖所示為當(dāng)使用PS-PEG-Arg8珠子時(shí)與對照珠子(PS-PEG-NH-Ac)和不包含珠子的樣品相比，內(nèi)毒素水平減少70％。IL6的胞內(nèi)水平在直方圖中顯示。在右手側(cè)，可以看到用PS-PEG-Arg8珠子孵育后IL6水平降低。左下排顯示新鮮細(xì)胞中缺乏胞內(nèi)IL6。
討論該實(shí)驗(yàn)顯示在人CD14+單核細(xì)胞群體中對LPS刺激的快速和完全的抑制，該抑制通過單核細(xì)胞中依賴LPS的IL6上調(diào)的抑制來測量的。
實(shí)施例6 全血灌注后細(xì)胞計(jì)數(shù)該實(shí)施例描述了(不限制本發(fā)明)穿過珠子上聚合物親和基質(zhì)灌注后血細(xì)胞的可滲透性。
原理血液純化需要不對細(xì)胞產(chǎn)生破壞或引起細(xì)胞活化。機(jī)械損傷，尤其是紅血球的機(jī)械損傷，可以導(dǎo)致溶血和隨后的威脅生命的并發(fā)癥。根據(jù)本發(fā)明的水凝膠樣聚合物基質(zhì)可以令人驚奇地通過全血細(xì)胞灌注。
材料使用高度可膨脹的聚合物基質(zhì)-PS-PEG-Arg8珠子。將柱子(ID20mm)裝滿1g基質(zhì)，吸收4-5ml水，隨后用生理鹽水溶液預(yù)漂洗備用。然后柱子用于全血的灌注。
步驟使用層流中無菌設(shè)備穿過柱子灌注新鮮的具有檸檬酸鹽和LPS(30IU/ml)的全血。以5ml/分鐘在37℃灌注摻有LPS的全血。灌注前后取出血樣并分析。所分析的細(xì)胞為紅細(xì)胞(RBC)，血細(xì)胞比容(HTC)和游離血紅蛋白，白細(xì)胞(WBC)，血小板，和血小板數(shù)目(TRC)。
通過庫爾特計(jì)數(shù)器(Becton Dickinson)在珠子灌注之前和之后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。
游離血紅蛋白被測量為紅血球全溶解后通過在405納米處用光度計(jì)定量總的血紅蛋白水平。通過在405納米處用光度計(jì)定量測量血漿中游離血紅蛋白顯示全血灌注后紅血球的完整性。
結(jié)果和討論測定細(xì)胞數(shù)和HCT并且結(jié)果在圖7A(血小板)，7B(HCT)，7C(RBC)和7D(WBC)中顯示。另外，沒有發(fā)現(xiàn)游離血紅蛋白增加，即沒有誘導(dǎo)溶血(數(shù)據(jù)未顯示)。來自該實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，由于最初的稀釋效應(yīng)，在最初的短暫停留時(shí)間后，細(xì)胞數(shù)目穩(wěn)定到柱前值。數(shù)據(jù)表明基材具有約100％的可滲透性，因?yàn)橹凹?xì)胞計(jì)數(shù)和柱后細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。而且，細(xì)胞保持完整，如通過活細(xì)胞計(jì)數(shù)和紅細(xì)胞裂解所測量的。
實(shí)施例7 生物相容性特征該實(shí)施例描述了PS-PEG-Arg8基質(zhì)的部分生物相容性特征。
原理生物相容性或非相容性在這里通過補(bǔ)體激活、彈性蛋白酶釋放和凝血酶抗凝血酶III復(fù)合體形成血栓而測定。
材料如實(shí)施例6，纖維素材料被用作參照物。
方法使用特異性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA；Diagnostic Product Co.)測量來自全血灌注的血漿中的彈性蛋白酶。
根據(jù)Deppisch等(Kidney Int.37696-706)通過終末補(bǔ)體復(fù)合體(TCC蛋白質(zhì))的定量測量補(bǔ)體激活。根據(jù)Deppisch等(Neuphrol.Dial.TransplantSuppl.317-23，1994)測量TAT-血栓形成的程度。
結(jié)果在圖8中，隨時(shí)間顯示TCC的形成。
參照珠子PS-PEG-NH-Ac(TG基材或參照材料)顯示TCC形成增加4-5倍。對于PS-PEG-Arg8，在10-15分鐘的最初上升后，TCC形成穩(wěn)定在灌注前水平。
在圖9中，隨時(shí)間測量彈性蛋白酶的水平。與柱前值相比水平?jīng)]有變化。顯示了35分鐘內(nèi)的測量。對于參考材料，彈性蛋白酶水平在35分鐘內(nèi)增加8-9倍。
在圖10中，隨時(shí)間顯示TAT的形成。沒有檢測到TAT形成的增加。
討論生物相容性特征在體外和體內(nèi)血液處理，例如透析中是重要的。所描述的基質(zhì)與所包括的參考材料相比沒有顯示補(bǔ)體系統(tǒng)的活化，沒有凝血體系的活化并且沒有彈性蛋白酶釋放，即高的生物相容性。這以及如在實(shí)施例6中所示全血的高灌注能力，表明本發(fā)明的聚合物親和基質(zhì)高度適合于血液，包括全血的體外治療。
實(shí)施例8 其他內(nèi)毒素吸附實(shí)驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)行了內(nèi)毒素吸附實(shí)驗(yàn)以便表明發(fā)現(xiàn)裝配用于內(nèi)毒素結(jié)合的配體的官能團(tuán)(即精氨酸殘基)的特異性幾何學(xué)定義的排列的重要性。可以表明內(nèi)毒素結(jié)合不僅僅取決于精氨酸的量(即正電荷)而且定義的幾何排列更重要。
步驟將人血清(作為人體液如血液、血漿等的代表)摻入限定量(即3IU/ml和10EU/ml)的內(nèi)毒素并與含有作為配體的Arg8排列或者Arg4排列的40mg PS-PEG-珠子孵育。兩種珠子/配體排列含有不同量的精氨酸Arg4含有0.72mmol/g，Arg8含有1.89mmol/g。Arg8珠子較高的精氨酸含量是賴氨酸分叉導(dǎo)致的額外分支的結(jié)果。孵育30分鐘后，測量上清液血清中內(nèi)毒素的游離(即未結(jié)合表面或基質(zhì))濃度。
分析表2 使用人血清進(jìn)行孵育實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

這些數(shù)據(jù)通過使用描述配體-受體相互作用和在固體表面平衡(例如蛋白質(zhì)吸附)(參考JD Andrade蛋白質(zhì)吸附原理JD Andrade(編輯)生物醫(yī)學(xué)聚合物的表面和界面.卷2，蛋白質(zhì)吸附，Plenum Press，紐約1985，1-80頁)的朗繆爾法分析。通過結(jié)合到配體-基質(zhì)的毒素(即內(nèi)毒素)量(從加入的量和孵育后上清液中剩余的量的差計(jì)算)除以基質(zhì)中存在的配體總數(shù)目對上清液中毒素的平衡濃度(即孵育后內(nèi)毒素濃度)作圖進(jìn)行分析。然后將圖與朗繆爾等溫線的數(shù)學(xué)表達(dá)式擬合，朗繆爾等溫線給出不同基質(zhì)結(jié)合配體對毒素的親和性或結(jié)合常數(shù)。在圖12A和12B中顯示了朗繆爾法的實(shí)例。
進(jìn)行了兩種朗繆爾作圖，它們在定義基質(zhì)中存在的配體總數(shù)的方法不同(1)忽視珠子的不同精氨酸含量，即通過僅僅用珠子的質(zhì)量(克)測量配體總數(shù)(圖12A)；在配體-聚合物-基質(zhì)的實(shí)際應(yīng)用中，例如在將要用人體液如體外循環(huán)中的血液或血漿灌注的吸附設(shè)備中，使用該方法證明是合理的，配體-聚合物-基質(zhì)在一定程度上受到將要裝入設(shè)備中以實(shí)現(xiàn)患者毒素濃度治療性地有效減少的珠子的總質(zhì)量或體積的限制。該限制例如涉及設(shè)備內(nèi)的壓降、對血液組分(蛋白質(zhì)和細(xì)胞)的非特異性作用或甚至對該設(shè)備的存儲空間。
(2)考慮珠子的不同精氨酸含量，將珠子的質(zhì)量(g)除以精氨酸負(fù)荷(mmol/克)作為對配體總數(shù)目的量度(圖12B)；由于精氨酸含量是產(chǎn)生配體-聚合物基質(zhì)中主要的成本因素，該方法被證明是有道理的。結(jié)果描述了從經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)的配體效率。
在表3中顯示了不同朗繆爾繪圖的平衡參數(shù)。
表3從擬合曲線得到的平衡參數(shù)

結(jié)果和討論親和常數(shù)描述并表征了配體能夠多強(qiáng)烈地結(jié)合毒素，而與所存在的配體的量無關(guān)。令人驚奇地，Arg8配體的親和常數(shù)比Arg4配體的親和常數(shù)大10倍以上(即為12.3倍)。
飽和濃度描述各自的配體-基質(zhì)可以結(jié)合毒素的最大量，假定可以得到無限量的毒素。令人驚奇地，Arg8配體-基質(zhì)的飽和濃度比Arg4配體-基質(zhì)的飽和濃度大2倍以上(即為2.8倍)。因?yàn)楦鶕?jù)朗繆爾吸附模型，飽和濃度完全與親和常數(shù)無關(guān)，這可以一種方式解釋為Arg8配體的特異性幾何排列影響配體-基質(zhì)對毒素的可接近性(例如，通過影響配體-基質(zhì)的PEG-部分的形態(tài)學(xué)(例如晶體樣相對于液體))。
下面的例子闡明基質(zhì)的量對提高Arg8配體-基質(zhì)內(nèi)毒素的親和性的重要性和相關(guān)性，該基質(zhì)的量是實(shí)現(xiàn)毒素濃度的治療性相應(yīng)減少所必需的。在敗血病患者中發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素濃度為0.1到1EU/ml(例如Nakamura等，Renal Failure 2000；22225-234)。假定處理開始時(shí)血漿濃度為0.3EU/ml，處理后血漿濃度為0.03EU/ml并且血漿體積為4000ml，這表示處理過程中1080EU內(nèi)毒素必須結(jié)合到配體-基質(zhì)。使用各自配體的親合常數(shù)和飽和濃度從朗繆爾表達(dá)式計(jì)算需要結(jié)合該內(nèi)毒素量的基質(zhì)量。處理末的濃度為平衡濃度。使用表3的平衡數(shù)據(jù)，該計(jì)算表明對于Arg8配體-基質(zhì)，僅僅需要83g，而對于Arg4配體-基質(zhì)，需要1201g以實(shí)現(xiàn)治療目標(biāo)。因?yàn)閮煞N配體-基質(zhì)具有類似的密度(質(zhì)量/體積)，這意味著吸附設(shè)備的體積和大小對于Arg8配體將小得多，其有利于血漿或血液的灌注。
權(quán)利要求
1.聚合物親和基質(zhì)，其用于結(jié)合液體中一種或多種物質(zhì)以從該液體除去所述物質(zhì)和/或減少所述液體中所述物質(zhì)的量或濃度，意在防止、除去或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化，其中所述基質(zhì)包含a)固體支持物；b)至少一種結(jié)合該固體支持物的間隔臂，并且，其偶聯(lián)至每一間隔臂；c)含有至少一個(gè)具有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元的配體，其中聚合物親和基質(zhì)能夠有選擇地結(jié)合所述物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的聚合物親和基質(zhì)，其中所述配體具有定義的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在電荷和/或疏水性/親水性方面與所述物質(zhì)的結(jié)合基元的三維結(jié)構(gòu)互補(bǔ)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的聚合物親和基質(zhì)，其中配體以下式表示-X1n-Ym[X2i-Z1；X3j-Z2]1/2(m+1)(通式I)，其中n＝0或1；m＝2k-1；k＝0到10，其中如果k＝0，那么X2＝X3并且Z1＝Z2；i＝0或1；并且j＝0或1，或-(X1n-Y1[Y2m[X2i-Z1；X3j-Z2]1/2(m+1)]r-X4p-Z3)(通式II)，其中n＝0或1；m＝2k-1；k＝0到10，其中如果k＝0那么X2＝X3并且Z1＝Z2；r＝1-100；i＝0或1；j＝0或1；且p＝0或1；其中Z1，Z2和Z3每一代表結(jié)合單元，并且每一為有機(jī)分子，所述有機(jī)分子選自氨基酸、肽、脂肪酸、糖類、凝集素、核苷酸及它們的衍生物或它們的組合，其中Y，Y1和Y2每一代表三官能分支分子，其中含有的官能團(tuán)選自氨基、羥基、醛、異氰酸根、異硫氰酸根、硫醇、馬來酰亞胺、環(huán)氧及它們的衍生物或它們的組合，并且其中X1，X2和X3每一為任選的雙官能距離分子，其含有的兩個(gè)官能團(tuán)選自氨基、羧基、羥基、醛、異氰酸根、異硫氰酸根、硫醇、馬來酰亞胺、環(huán)氧及它們的衍生物或它們的組合；和/或其中配體為環(huán)狀的。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中配體包含1-100個(gè)官能團(tuán)，優(yōu)選1-32個(gè)官能團(tuán)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中每一結(jié)合單元為氨基酸，其至少一部分在約血液的生理pH時(shí)帶正電荷。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的聚合物親和基質(zhì)，其中氨基酸的pKA≥6.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的聚合物親和基質(zhì)，其中氨基酸為精氨酸、賴氨酸、組氨酸或半胱氨酸，優(yōu)選精氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的聚合物親和基質(zhì)，其中氨基酸的量或濃度為0.01-5mmol/g基質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的聚合物親和基質(zhì)，其中氨基酸的量或濃度為約0.01、0.1、1、2、3、4或5mmol/g基質(zhì)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中每一配體的氨基酸分子數(shù)目為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，優(yōu)選地為4-8。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中氨基酸為精氨酸，并且精氨酸的量或濃度≤3mmol/g基質(zhì)。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中所述至少一種官能團(tuán)為氨基或取代的氨基、羧基、羥基、硫醇基、胍基或它們的組合，優(yōu)選地為氨基或胍基。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中所述配體具有如下式所示的樹狀或梳狀結(jié)構(gòu)具有通式I即-X1n-Ym[X2i-Z1；X3j-Z2]1/2(m+1)的配體的例子，其中其在此處為-Lysm[Arg](m+1)，即n＝i＝j(luò)＝0；m＝2k-1Z1＝Z2＝Arg；所有的Y＝Lys；且沒有X1、X2和X3 (k＝0) 具有通式II即-(X1n-Y1[Y2m[X2i-Z1；X3j-Z2]1/2(m+1)]r-X4p-Z3)的配體的例子，其中其在此處為-(Lys[Lysm[Arg](m+1)r-H，即n＝i＝j(luò)＝p＝0；m＝2k-1Z1＝Z2＝Arg；Z3＝H；所有的Y＝Lys；沒有X1、X2、X3和X4 (r＝2，k＝0) 和/或包括環(huán)狀結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地如下式所示 (k＝1) (k＝2)
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中至少兩個(gè)官能團(tuán)的正電荷以一定的距離相互分開，所述距離由所要結(jié)合的物質(zhì)的結(jié)合基元中分別帶負(fù)電的基團(tuán)之間的距離確定，所述帶負(fù)電的基團(tuán)優(yōu)選地為內(nèi)毒素中的磷酸基團(tuán)。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中間隔臂實(shí)質(zhì)上疏水或親水，并且具有用于配體的錨定部分的功能。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的聚合物親和基質(zhì)，其中間隔臂選自式H-(OCH2CH2)n-OH的聚乙二醇或寡乙二醇，其中n代表2到250，或聚乙烯醇、聚乙烯胺、聚縮水甘油、聚乙烯亞胺或聚環(huán)氧丙烷，或?yàn)樗鼈兊难苌铩?br> 17.根據(jù)權(quán)利要求16的聚合物親和基質(zhì)，其中間隔臂為線性和/或分支構(gòu)型并且平均分子量為400-10000道爾頓的聚乙二醇(PEG)，或?yàn)槠溲苌铩?br> 18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中固體支持物由這樣的材料制造，所述材料選自聚苯乙烯、聚乙烯醇、聚羥基苯乙烯、從氯甲基化聚苯乙烯或聚丙烯酸酯產(chǎn)生的聚合物、用羥基官能化的聚甲基丙烯酸酯、羥基烷基-聚苯乙烯、羥基芳基-聚苯乙烯、羥基烷基-芳基-聚苯乙烯、多羥基烷基化聚苯乙烯、多羥基芳基化聚苯乙烯、異氰酸根合烷基-聚苯乙烯、異氰酸根合芳基-聚苯乙烯、羧基烷基-聚苯乙烯、羧基芳基-聚苯乙烯、氨基烷基-聚苯乙烯、氨基芳基-聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、交聯(lián)的聚乙烯醇、纖維素、硅土、糖類、乳膠、環(huán)烯共聚物、玻璃或它們的組合，優(yōu)選交聯(lián)的聚苯乙烯。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的聚合物親和基質(zhì)，其中固體支持物具有珠子、凝膠、膜、顆粒、網(wǎng)、織造織物和非織造織物、纖維簇、管、薄膜、薄片或它們的組合、或交聯(lián)的互穿網(wǎng)絡(luò)的形式，優(yōu)選地具有聚苯乙烯-PEG珠子的形式。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物基質(zhì)，其中所述基質(zhì)是生物相容的并且具有足以允許全血灌注的溶脹度。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的聚合物親和基質(zhì)，其中從干燥狀態(tài)到水合形式的溶脹度為約1.5-20倍，優(yōu)選2-6倍。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中所述基質(zhì)提供了三維互補(bǔ)結(jié)構(gòu)以結(jié)合至少一種這樣的物質(zhì)，所述物質(zhì)選自病毒和細(xì)菌來源的組分、內(nèi)毒素、外毒素、細(xì)菌DNA或片段、寡核苷酸；細(xì)胞，尤其是內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞；血細(xì)胞，尤其是淋巴細(xì)胞、血小板、粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞；朊病毒、寄生蟲、真菌；超過劑量的藥物、致病的食品添加劑；糖尿病、肝病、尿毒癥或腎病或炎癥導(dǎo)致的急性或慢性代謝障礙的產(chǎn)物、肝素、細(xì)菌和病毒、載有病原的血細(xì)胞、或者至少其部分或降解產(chǎn)物、DNA、磷酸鹽、細(xì)胞因子、生長因素、激素、趨化因子、尿毒癥性毒素、血液凝固蛋白、促凝血蛋白、炎性蛋白或促炎性蛋白、巨噬細(xì)胞移動抑制因子、可溶的或細(xì)胞表面結(jié)合蛋白、可溶的粘附分子、以及葡萄糖或其降解產(chǎn)物、致熱原、細(xì)菌外毒素、革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)物，優(yōu)選地脂胞壁酸，尤其是細(xì)菌性致熱原，優(yōu)選內(nèi)毒素，尤其是脂多糖(LPS)的脂質(zhì)A組分。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中所述基質(zhì)具有約1×102到約1×106道爾頓的截留值并且結(jié)合疏水和/或親水物質(zhì)。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中一種或多種物質(zhì)將要從中除去或減少的液體為水性或有機(jī)溶液、體液優(yōu)選血液、治療性液體、用于生命科學(xué)應(yīng)用的液體優(yōu)選為生物學(xué)的、診斷的或生物技術(shù)應(yīng)用中的緩沖液、輸注液或透析液、從健康供體得到的血液制品比如用于輸注的血漿、血小板濃縮物、紅血球濃縮物、血液替代物優(yōu)選地載氧體、經(jīng)修飾的血紅蛋白溶液和人造血紅蛋白溶液、用于營養(yǎng)的液體和工業(yè)用途的液體。
25.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的聚合物親和基質(zhì)，其中固體支持物為交聯(lián)的聚苯乙烯，間隔臂為聚乙二醇并且每一結(jié)合單元為精氨酸。
26.用于結(jié)合液體中一種或多種物質(zhì)以從該液體除去所述物質(zhì)和/或減少所述液體中所述物質(zhì)的量或濃度意在防止、除去或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化的方法，該方法包括將液體與如權(quán)利要求1-24任一項(xiàng)所定義的聚合物親和基質(zhì)接觸，接觸時(shí)間為足以減少所述物質(zhì)的量或濃度和/或除去所述物質(zhì)的時(shí)間期間，優(yōu)選不超過24小時(shí)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中時(shí)間期間為1秒到2小時(shí)。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27的方法，其中物質(zhì)為內(nèi)毒素并且液體為血液，其中內(nèi)毒素被除去或減少后的量或濃度低于活化血液中組分的能力或者防止血液中組分或過程的活化。
29.產(chǎn)生如在權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)所定義的聚合物親和基質(zhì)的方法，其包括a)將間隔臂連接至固體支持物以得到第一復(fù)合體和b)將配體連接至所述第一復(fù)合體，其中所述配體含有至少一個(gè)具有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元，或c)將間隔臂連接至含有至少一個(gè)具有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元的配體，以得到第二復(fù)合體，和d)將固體支持物連接至所述第二復(fù)合體，或e)將間隔臂連接至固體支持物以得到第一復(fù)合體，和f)在結(jié)合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體，或g)在固體支持物上通過接枝直接由單體合成間隔臂，和h)將含有至少一個(gè)具有至少一個(gè)官能團(tuán)的結(jié)合單元的配體連接至所述第一復(fù)合體，或i)在固體支持物上通過接枝直接從單體合成間隔臂，和k)在結(jié)合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體，其中關(guān)于所要結(jié)合的物質(zhì)中結(jié)合基元的三維結(jié)構(gòu)、電荷和疏水/親水區(qū)的存在的信息收集自X射線晶體學(xué)、蛋白質(zhì)測序、蛋白質(zhì)建?；蚴杷院陀H水性計(jì)算，并且使得含有結(jié)合單元的配體在電荷和/或親水性/疏水性方面與所述物質(zhì)的結(jié)合基元互補(bǔ)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其包括以下步驟對于a)和b)活化固體支持物，將間隔臂分子偶聯(lián)至固體支持物，合成含有結(jié)合單元的配體，和將配體定點(diǎn)偶聯(lián)至間隔臂分子，或?qū)τ赾)和d)合成含有結(jié)合單元的配體，將間隔臂分子偶聯(lián)至配體，活化固體支持物，和將間隔臂配體復(fù)合體定點(diǎn)偶聯(lián)至固體支持物，或，對于e和f)活化固體支持物，將間隔臂分子偶聯(lián)至活化的固體支持物，和在該支持體的間隔臂上固相合成配體。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其包括以下步驟對于a)和b)，活化間隔臂，將活化的間隔臂偶聯(lián)至固體支持物，和將配體偶聯(lián)至所述活化的間隔臂，或，對于c)和d)，合成配體，活化間隔臂，將配體定點(diǎn)偶聯(lián)至活化的間隔臂分子，和將間隔臂-配體復(fù)合體偶聯(lián)至固體支持物，或者，對于e)和f)，活化間隔臂，將活化的間隔臂偶聯(lián)至固體支持物，和在結(jié)合至固體支持物的間隔臂上固相合成配體。
32.如權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)所定義的聚合物親和基質(zhì)的用途，用于從液體，優(yōu)選地從體液或治療性液體，最優(yōu)選地從血液或血清中，除去一種或多種物質(zhì)，優(yōu)選地除去內(nèi)毒素，或者減少所述液體中該物質(zhì)的量或濃度。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的用途，用于產(chǎn)生較輕活化的血液或防止血液中組分或過程所不希望有的活化。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的用途，用作體外血液純化過程的一部分或作為體內(nèi)植入物以接觸血液或任意體液，優(yōu)選地為在血管系統(tǒng)、血管或腹膜腔中的血液或任意體液。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的用途，用于產(chǎn)生較輕活化的血液或防止血液中組分或過程所不希望有的活化。
36.用于從液體除去一種或多種物質(zhì)和/或減少所述液體中所述物質(zhì)的量或濃度意在防止、除去或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化的試劑盒，所述試劑盒包含如權(quán)利要求1-25任一項(xiàng)所定義的聚合物親和基質(zhì)。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的試劑盒，其中還包含樣品管和對所述液體，優(yōu)選地對血液或血清進(jìn)行體外和/或體內(nèi)處理的設(shè)備。
38.聚合物基質(zhì)的用途，用于產(chǎn)生從液體除去一種或多種物質(zhì)和/或減少所述液體中所述物質(zhì)的量或濃度的聚合物親和基質(zhì)，其中特異親和性取決于應(yīng)用于聚合物基質(zhì)的配體，其中聚合物基質(zhì)包括固體支持物和間隔臂，其中固體支持物由這樣的材料制造，所述材料選自聚苯乙烯、聚乙烯醇、聚羥基苯乙烯、從氯甲基化聚苯乙烯或聚丙烯酸酯產(chǎn)生的聚合物、用羥基官能化的聚甲基丙烯酸酯、羥基烷基-聚苯乙烯、羥基芳基-聚苯乙烯、羥基烷基-芳基-聚苯乙烯、多羥基烷基化聚苯乙烯、多羥基芳基化聚苯乙烯、異氰酸根合烷基-聚苯乙烯、異氰酸根合芳基-聚苯乙烯、羧基烷基-聚苯乙烯、羧基芳基-聚苯乙烯、氨基烷基-聚苯乙烯、氨基芳基-聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、交聯(lián)的聚乙烯醇、纖維素、硅土、糖類、乳膠、環(huán)烯共聚物、玻璃或它們的組合，優(yōu)選交聯(lián)的聚苯乙烯，并且其中間隔臂選自式H-(OCH2CH2)n-OH的聚乙二醇或寡乙二醇，其中n代表2到250。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的用途，其中固體支持物具有珠子、凝膠、膜、顆粒、網(wǎng)、織造織物和非織造織物、纖維簇、管、薄膜、薄片或它們的組合、或交聯(lián)的互穿網(wǎng)絡(luò)的形式。
40.根據(jù)權(quán)利要求38或39的用途，其中間隔臂為線性和/或分支構(gòu)型并且平均分子量為400-10000道爾頓的聚乙二醇(PEG)，或?yàn)槠溲苌铩?br> 41.根據(jù)權(quán)利要求38-40任一項(xiàng)的用途，其中聚合物基質(zhì)具有足以允許血漿或全血灌注的溶脹度。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的用途，其中從干燥狀態(tài)到水合形式的溶脹度為約1.5-20倍，優(yōu)選2-6倍。
43.根據(jù)權(quán)利要求38-42任一項(xiàng)的用途，其中聚合物基質(zhì)具有凝膠型珠子的形式。
44.根據(jù)權(quán)利要求38-43任一項(xiàng)的用途，其中所述液體為水性或有機(jī)溶液、體液優(yōu)選血液、治療性液體、用于生命科學(xué)應(yīng)用的液體優(yōu)選為生物學(xué)的、診斷的或生物技術(shù)應(yīng)用中的緩沖液、輸注液或透析液、從健康供體得到的血液制品比如用于輸注的血漿、血小板濃縮物、紅血球濃縮物、血液替代物優(yōu)選地載氧體、經(jīng)修飾的血紅蛋白溶液和人造血紅蛋白溶液、用于營養(yǎng)的液體和工業(yè)用途。
45.根據(jù)權(quán)利要求38-44任一項(xiàng)的用途，其中所述聚合物基質(zhì)具有約1×102到約1×106道爾頓的截留值并且結(jié)合疏水和/或親水物質(zhì)。
46.根據(jù)權(quán)利要求38-45任一項(xiàng)的用途，其中固體支持物為交聯(lián)的聚苯乙烯，并且間隔臂為聚乙二醇。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于結(jié)合液體中一種或多種物質(zhì)以從該液體除去所述物質(zhì)和/或減少所述液體中所述物質(zhì)的量或濃度意在防止、除去或減少所述液體中組分或過程所不希望有的活化的聚合物親和基質(zhì)，以及從該液體除去所述物質(zhì)和/或減少其在所述液體中的量或濃度的方法，產(chǎn)生所述基質(zhì)的方法，所述基質(zhì)的用途和含有所述基質(zhì)的試劑盒。該聚合物親和基質(zhì)含有固體支持物、間隔臂和配體，其中所述配體包含作為結(jié)合單元的精氨酸。
文檔編號B01J20/26GK1665494SQ03816142
公開日2005年9月7日 申請日期2003年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月8日
發(fā)明者沃夫?qū)だ? R·德皮施, H·戈?duì)? B·維特納, W·貝克 申請人:甘布羅倫迪亞股份有限公司, 沃夫?qū)だ?