專利名稱：分離性輸血－設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離性輸血-設(shè)備，該設(shè)備包含一種可與血流或血漿流相接觸的固體載體。
分離性輸血意指一種治療方法，其治療效果是基于體外清除血液中的病原體蛋白、蛋白結(jié)合的病原體物質(zhì)、游離的病原體物質(zhì)或病原體細(xì)胞。如果僅從無細(xì)胞的血漿中可清除病原體蛋白，則該血漿借助于膜式血漿分離器(血漿分離器)或借助于血液離心機(jī)預(yù)先將血漿從血細(xì)胞中分離。在非選擇性的血漿交換(血漿分離性輸血)中，將該經(jīng)交換的病人血漿進(jìn)行全分離，其中除病原體外還清除所有其它的生活體的蛋白。由此需用電解質(zhì)、人體清蛋白或新鮮血漿取代該取出的血漿。在選擇性的血漿去除方法中，借助于吸附、沉淀或過濾可完全特定的從分離的血漿中去除病原體蛋白，其中，經(jīng)分離后可將該血漿基本上無體積損失地再輸入。這種選擇性方法的優(yōu)點是可不用置換溶液。在選擇性全血分離性輸血方法中，無需預(yù)先的血漿分離而特定地直接從未經(jīng)處理的血液中吸附該病原體蛋白，因而與血漿分離方法相反，可不進(jìn)行血漿分離也不加入置換溶液。該分離性輸血的另一種方式是細(xì)胞分離性輸血，其中從血液中去除細(xì)胞。由此可選擇性地獲得白細(xì)胞、紅細(xì)肥胞、凝血細(xì)胞、粒細(xì)胞或甚至干細(xì)胞。
雖然該分離性輸血(如血漿分離性輸血或細(xì)胞分離性輸血)目前主要用于獲得供體血漿(作為血漿保存，用于分離各種血漿組分或用于獲得血液產(chǎn)品)，分離性輸血方法也在治療領(lǐng)域越來越具重要性。例如下列一系列的病均可用分離性輸血方法治療代謝病(如(家族性)高膽固醇血癥、伴隨隔離LP(a)-增高的進(jìn)育性冠狀心臟病、乳糜微粒綜合癥、肝衰竭、...)；腎病(古德帕斯徹優(yōu)質(zhì)牧草綜合癥、伴隨腎炎的全身紅斑狼瘡、韋格納肉芽腫病、溶血-尿毒綜合癥、自發(fā)性病灶性-硬化的腎小球性腎炎、伴隨病變蛋白血的綜合癥、冷球蛋白血飴紫癜、腎移植時的HLA-過敏、...)；神經(jīng)系統(tǒng)病(重癥肌無力、Guillain-障礙-綜合癥、慢性脫髓鞘多根神經(jīng)炎、病變蛋白血多神經(jīng)病、蘭伯特-伊頓-綜合癥、雷弗素姆-綜合癥、...)；免疫系統(tǒng)病(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、免疫抑制劑血友病、天皰瘡、...)；血液循環(huán)和微循環(huán)病(高血粘滯性綜合癥、抗磷脂抗體-綜合癥、骨髓移植后的血栓性微血管病、與年齡相關(guān)的斑點退化、急性聽力衰退、微循環(huán)末稍障害、自發(fā)性擴(kuò)張心肌炎、心臟移植后的移植血管病、純合予性家族性高膽固醇血癥、病灶性節(jié)段腎小球硬化癥、溶血性-尿毒綜合癥、...)；中毒；急性肝機(jī)能不全；腫瘤；水分過多；甲狀腺中毒等(參見Pschyrembel(257版)詞目“血漿分離性輸血”；www.nephrologie.de/172Apharese.htm)。
阿爾茨海默氏病(AE)是一種進(jìn)行性的神經(jīng)障礙，目前無有效治療。含淀粉狀蛋白-β-肽的大腦噬菌斑和由微管締合的TAU-蛋白組成的線狀神經(jīng)元結(jié)構(gòu)通常適于該病。雖然認(rèn)為淀粉狀蛋白-β和TAU在病理上是相關(guān)的，但實際的研究結(jié)果似乎表明，淀粉狀蛋白-β在病理上是特別重要藥劑。因此治療劑越來越受到發(fā)展，這必須防止淀粉狀蛋白-β-生產(chǎn)、淀粉狀蛋白-β聚集或由該聚集物引發(fā)的神經(jīng)毒性事件。至今對AE有效果的治療對策的綜述參見Wolfe的概述文章(Nature Review Drug Discovery 1(2002)859-866。
該淀粉狀蛋白-β-噬菌斑是由所謂的淀粉狀蛋白-β前體蛋白(APP)形成的，該淀粉狀蛋白-β前體蛋白是一種整合跨膜蛋白(其生理作用也未清楚證明，但最新研究結(jié)果認(rèn)為，APP對驅(qū)動蛋白I起所謂的膜-載荷(cargo)-受體的作用)。APP通過所謂的分泌酶經(jīng)蛋白水解而分裂，其中，在生理上主要形成40-氨基酸長的Aβ-肽(Aβ40)。其它還有形成較短和較長的Aβ形式，特別是42-氨基酸-變體(Aβ42)，其具有高的聚集能力。因此這種Aβ42-形式也是在淀粉狀蛋白噬菌斑中的主要形式。分泌酶(α-分泌酶和主要是β-分泌酶和γ-分泌酶)是導(dǎo)致不同分裂的主要原因，因而也形成可能的AE治療對策的主要目標(biāo)。由此試圖在治療AE中分別使用適于這種酶的調(diào)制劑或阻止劑(如苯并二氮雜、磺酰胺、苯并已內(nèi)酰胺)。
另一種與AE有關(guān)的基因是載脂蛋白E，對此存在三種等位基因變體(APOE2、APOE3和APOE4)。已表明，具有APOE4的一種或兩種拷貝的人具對AE有較高的風(fēng)險。由此與全體居民相比，APOE2-攜帶者有較低的風(fēng)險。還表明，使用抑制素(statin)即抑止膽固醇生物合成的藥物的人對于AE有明顯低的風(fēng)險。因此治療AE的另一對策是專注于抑止膽固醇生物合成，例如用抑制素。
用于治療AE的另一種配方涉及抑止在大腦噬菌斑中的淀粉狀蛋白-聚集，這也可通過分泌酶-抑制劑而實現(xiàn)。另外，還可建議降低鋅含量，因為呈生理相關(guān)濃度的鋅可引起Aβ的聚集作用。
最后也描述了免疫對策，例如用Aβ42的免疫法，但在臨床研究范圍內(nèi)由于較嚴(yán)重的副作用而必須停止(Willke，Bild der Wissenschaft，9(2003)，24-28)。
在現(xiàn)有技術(shù)中所建議的另一些AE-治療對策涉及阻止APP-表達(dá)和提高Aβ-清除率，其中為APP-表達(dá)已找到可與APP-啟動子區(qū)域相互作用的物質(zhì)。關(guān)于Aβ-清除率曾違議提高某些蛋白酶如胰島素分解酶和溶腎素的活性或抗-Aβ-抗體的外周應(yīng)用(De Mattos et al.，PNAS 98(15)(2001)，8850-8855)。最后還企圖再溶解已存在的淀粉狀蛋白-噬菌斑，例如通過降低在AE-病人血清中的淀粉狀蛋白-β-量來實現(xiàn)。在這方面還建議通過分離性輸血-方法以減少在腦中β-淀粉狀蛋白-蛋白的噬菌斑-淀積(US6551266，其中建議通過分離性輸血去除分子量大于500kD的大分子)，但事實上未表明這適于AE。但通過分離性輸血方法不可能直接在腦細(xì)胞中進(jìn)行溶解已存在的-噬菌斑(血液/腦-障礙對噬菌斑或大于500kD的分子是不可雜交的)。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種阿爾茨海默氏病的新治療對策和預(yù)防對策。
因此本發(fā)明提供一種分離性輸血-設(shè)備，該設(shè)備包含可與血流或血漿流相接觸的固體載體，該載體是一種連接淀粉狀蛋白-β-前體-蛋白(APP)的受體。在AE-病人或有AE-風(fēng)險的人情況下，用現(xiàn)有的分離性輸血-設(shè)備可通過分離性輸血按需清除APP或APP-分解產(chǎn)物，特別是Aβ40或Aβ42。已知在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(ZNS)和血漿之間存在Aβ42的動態(tài)平衡。鼠模型表明(DeMattos PNAS 2001，見上)，抗-Aβ-抗體的外周應(yīng)用影響ZNS和血漿Aβ42清除，并減少Aβ42在腦中的負(fù)荷，沒有克服血液-腦-障礙的抗-Aβ-抗體。這些結(jié)果由Matsuoka等人(Journal of Neuroscience 200329-33)通過另一些Aβ42連接分子(凝溶膠蛋白和GM1)的外周應(yīng)用所證實。因此在腦中形成噬菌斑的過程也可通過在血液中捕獲Aβ42來阻止。由此在與病人的血液或血漿接觸的分離性輸血-設(shè)備中受體對Aβ42或APP的其它分解形式是否是特異性并不關(guān)鍵，重要的通過該特異性吸附從血液中去除APP和其(蛋白水解)降解產(chǎn)物，特別是Aβ42，以致不會導(dǎo)致“錯誤的”蛋白降解(即降解為Aβ42)。因此本發(fā)明是基于與US 6551266完全不同的分離性輸血的應(yīng)用方法，即基于消除潛在的噬菌斑-結(jié)構(gòu)成分，而不是噬菌斑本身。通常用分離性輸血消除噬菌斑在一開始是因?qū)E-治療無效而排除在外，因為血液-分離性輸血甚至不能達(dá)到腦中形成噬菌斑的區(qū)域。
另一方面，與導(dǎo)致體內(nèi)本身減少Aβ的方法(如在De Mattos et al.，PNAS 98(15)(2001)，8850-8855中采外周抗-Aβ-抗體)相比，本發(fā)明的分離性輸血具有的重大優(yōu)點在于，可不引發(fā)自身免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明也不必給病人施加在體內(nèi)本身可起作用的物質(zhì)(將這些物質(zhì)輸入在某些部位后也許才起作用)，而是將病原劑有目的去除，也就是特異性地體外隔斷病因，同時無需清除體內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物。
在所有實施形式中已有的和已知的分離性輸血-設(shè)備均易于適用于本發(fā)明。特別是在選擇固體載體(和分離性輸血設(shè)備)時應(yīng)考慮其醫(yī)學(xué)技術(shù)的適用性。這類載體、方法或設(shè)備特別是描述于WO 97/48483A、US 5476715、6036614、5817528或6551266中。相應(yīng)的市售分離性輸血-裝置也可由下列公司銷售Fresenius、Affina、Plasmaselet、ASAHI、Kaneka、Braun等，如LDL-Therasorb、Immunosorba、Prosorba、Globaffin、Ig-Therasorb、Immusorba、Liposorba、HELP、DALI、Bilirubin-Gallensaeure-Absorber BR-350、PrometheusEntgiftung、MARS、ADAsorb-System von Medicap或Plasma FLO-System。所有這些系統(tǒng)盡管在市售形式上不總是針對各個蛋白的特定清除，但可由分離性輸血專業(yè)人員將其順利地適配于本發(fā)明，如作為免疫分離性輸血和/或在分離性輸血-儀器中安裝本發(fā)明的固體載體(如柱)。
術(shù)語“APP-結(jié)合受體”按本發(fā)明也意指所有的對配體APP和其生物副產(chǎn)物特別是Aβ42具有親合力并能從AE-病人或有AE風(fēng)險的病人的血液或血漿中去除這些多肽的物質(zhì)。該APP-受體或Aβ42-受體分別可優(yōu)選是(多克隆或單克隆的)抗體、蛋白、肽、神經(jīng)節(jié)苷脂或核酸。
特別優(yōu)選是抗-APP-抗體、抗-Aβ40-抗體或抗-Aβ42-抗休、APP-結(jié)合蛋白，特別是凝溶膠蛋白、apoJ或apoE、APP-結(jié)合肽、APP-結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂，特別是GM1或APP結(jié)合的核酸，特別是適體(Aptamere)或這些受體的混合物。
例如這類抗體是3D6(Aβ1-5)、2H3(Aβ1-12)、2G3(Aβ33-40)、21F12(Aβ33-42)、12H7(Aβ33-42)(Johnson-Wood等人，PNAS 19971550-1555)、10D5、16C11(Bard等人，Nature Medicine 2000916-919)、De Mattos等人。(2001)所描述的抗體(m266，m243)以及同樣特性的抗體。例如以含APP、Aβ42或片段或其變體的疫苗配劑對哺乳動物進(jìn)行免疫過程中可得到這類抗體，任選地接著進(jìn)行細(xì)胞融合和克隆選擇性方案(在單克隆抗體情況下實現(xiàn))。
凝溶膠蛋白(Matsuoka et al 2003，見上)、apoJ或apoE(De Mattoset al 2001，見上)是APP-結(jié)合蛋白受體的另一些實例。GM1是APP-結(jié)合神經(jīng)節(jié)苷脂-受體的一種實例(Matsuoka et al 2003，見上)。
APP-結(jié)合蛋白的另一些實例是CETP(膽固醇基-酯-轉(zhuǎn)移蛋白)和ERAB-蛋白(261 AS gross；He等人，JBC 273(17)(1998)，10741-10746；Lustbader等人，Science 304(2004)，448-452；特別是AS 1-186或1-158)。APP-結(jié)合肽的實例是是由APP-結(jié)合肽衍生的APP-結(jié)合片段。APP-結(jié)合肽的具體實例是KTYNLKKGQT-C(“肽4077”)、GIAVASKTYNLKKGQTHTLEDFQRVLDV(ERAB 93-120)、SKTYNLKKGQTHT(ERAB98-110)、C-HQKLVFFAED(“肽1323”)、C-EVHHQKLVFFAEDVGS(“肽1324”)、C-HQKIVFFAED(“肽1325”)和FGFPEHLLVDFLQSLS-C(“肽1208”)(也可是所有其它ERAB、CETP或β-斷裂子(breaker)片段，其各含有APP-結(jié)合區(qū)域)(在這類肽情況下，該終端半胱氨酸不是天然蛋白序列的一部分，而是僅僅附上偶合的肽)。
作為APP-結(jié)合受體的肽可由D-氨基酸或L-氨基酸或D-氨基酸和L-氨基酸的組合組成，并還可任選地通過其它改性、閉環(huán)或衍生而改變。適于如Aβ42的肽受體可由肽-文庫查得，這些文庫可從市售購到。這種肽的氨基酸長度宜至少為5，優(yōu)選為6，特別是至少8個氨基酸，有利的長度可達(dá)11，優(yōu)選達(dá)14或20個氨基酸。但本發(fā)明也可順利地使用更長的肽作為APP-結(jié)合肽。此外低聚物(如聚乙烯亞胺和多賴氨酸)也可作為受體。
為制備這類APP-結(jié)合受體，當(dāng)然也可例如借助于組合化學(xué)產(chǎn)生的噬菌體-文庫、肽-文庫或借助于適于大多數(shù)各種結(jié)構(gòu)的高產(chǎn)率的篩選技術(shù)(見例如在噬菌體展示中Carlos F.Barbas(Editor)等人的A Laboratory Manual；WillateWG，噬菌體展示practicalities and prospects.Plant Mol Biol.2002Dec；50(6)837-54；http//www.microcollections.de/showpublications.php#)。除基于隨機(jī)的噬菌體文庫外，核蛋白體展示或細(xì)菌展示的文庫也是適用的。用于其增殖的相應(yīng)文庫和方法是專業(yè)人員解已知的，并描述于US2004/0110281A、WO 00/72880A和WO 02/059148A中。
此外，也可應(yīng)用基于核酸(“適體”；也是”Decoy”-寡脫氧核苷酸(ds寡核苷酸，其從序列顯示適于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點))，這些也可用大多數(shù)不同的(寡核苷酸-)文庫(如用2-180核酸基)找到(如Burgstaller等人，Curr.Opin.Drug Discov.Dev.5(5)(2002)，690-700；Famulok等人，Acc.Chem.Res.33(2000)，591-599；Mayer等人，PNAS 98(2001)，4961-4965，及許多其它的)。該核酸主鏈例如可通過天然磷二酯-化合物也可通過硫代磷酸酯或組合或化學(xué)變異(如作為PNA)而找到，作為基質(zhì)本發(fā)明首先可應(yīng)用U、T、A、C、G、H和mC。本發(fā)明應(yīng)用的核苷酸的2’-殘基優(yōu)選是H、OH、F、Cl、NH2、O-甲基、O-乙基、O-丙基或O-丁基，該核酸還可另外改性，例如為其提供如通常在寡核苷酸合成中應(yīng)用的保護(hù)基。因此App-結(jié)合的適體也優(yōu)選是在本發(fā)明范圍中的App-結(jié)合親合性分子。
適于APP的適體例如可用下述方法找到。使固定的APP(或上述形式的另一種)與由核酸組成的混合物接觸，使高親合結(jié)合的核酸與低親合結(jié)合的或完全不結(jié)合的核酸分離。在與核酸混合時，通常涉及以組合化學(xué)制備的核酸文庫。核酸文庫包含各種各樣相互不同的核酸，其中至少在部分序列范圍內(nèi)建立無規(guī)化(含天然的和/或-非天然的核酸)。這可能但非必須提供保持的序列范圍。在n個位置中以m個不同核苷酸的無規(guī)化導(dǎo)致有nm個成分的文庫。
APP-特異性親合性核酸的發(fā)現(xiàn)由下列步驟進(jìn)行。a)在柱(里面)加載APP(等)，并將APP(等)固定在柱中，b)將核酸混合物加到該柱的第一端，通過該柱，載體物質(zhì)的確定體積流從柱的第一端流到柱第二端，c)該核酸隨其對APP(等)的親合力的下降以增加離柱第一端的間距進(jìn)行結(jié)合和固定，d)載體物質(zhì)體積的流流經(jīng)柱經(jīng)確定流過時間后結(jié)束，e)該柱經(jīng)多次分配分成柱片段，對每一段均指定流徑配位，f)由至少一片段可非特異地解吸出固定的核酸，并通過有關(guān)各段指定的流徑的配位次序而得到。該柱的內(nèi)側(cè)通常意指腔的內(nèi)部。該柱應(yīng)可包含各類固體載體系統(tǒng)，如也可以是不完全包封的載體系統(tǒng)。
APP(等)固定可按通常的柱色譜法進(jìn)行。作為柱可以是帶有兩端的腔型的各種機(jī)械結(jié)構(gòu)。作為結(jié)構(gòu)材料可使用所有適于柱的材料，如金屬、玻璃和/或塑料。該柱可在其內(nèi)側(cè)裝有與APP(等)相結(jié)合的基質(zhì)和/或該結(jié)構(gòu)材料可適于直接結(jié)合或可制備用于直接結(jié)合目標(biāo)分子。核酸混合物是指，通常有106-1022/Mol，將別是1010-1021/Mol的相互不同的核酸種類的核酸文庫。在施加到柱上的文庫中，每一核酸種類從統(tǒng)計看代表例如存在10-1017，特別是100-1013個分子。載體物質(zhì)通常是核酸在其中是溶解并穩(wěn)定的液體。對此可用所有適于核酸文庫的常用的緩沖劑和類似物。載體物質(zhì)的體積流可在施加核酸文庫前調(diào)節(jié)。然后將該核酸文庫從柱的入口端加到載體物質(zhì)流中。但該核酸文庫也可直接加入。經(jīng)由柱的結(jié)構(gòu)和所調(diào)節(jié)的體積流所確定的流經(jīng)時間后，在柱的出口端再次出現(xiàn)通過核酸文庫產(chǎn)生的“栓塞”(通過有擴(kuò)散的折合而擴(kuò)展)，其中由“栓塞”分離的結(jié)合核酸并固定于柱中。宜將流過柱的體積流調(diào)節(jié)呈少擾動的或非擾動性的層流(經(jīng)柱體積，特別是經(jīng)柱橫截面的載體物質(zhì)的加速矢量的總和是最小，理想為零)。在柱中的APP-分子總數(shù)通常為在施加的核酸文庫中各類核酸分子數(shù)的102-1016倍，特別是103-1015倍。核酸在APP-分子上的結(jié)合優(yōu)選在分離性輸血情況下在較晚使用核酸的條件下進(jìn)行，例如在以溫度、離子強(qiáng)度、pH-值和緩沖條件所相應(yīng)確定的合適的緩沖劑中進(jìn)行。然后依其有關(guān)成分選擇載體物質(zhì)和該核酸文庫的溶劑。例如可通過將柱切割成段而實現(xiàn)將該柱分成多個柱段，該切割宜與體積流矢量成正交進(jìn)行。但該柱也可預(yù)先由多個柱段組成，其中，一個柱段宜以體積流矢量方向緊密聯(lián)接下一個柱段(組裝橫截面正交于體積流矢量)。然后通過解脫預(yù)先由柱段形成的復(fù)合體而實施分離。該非特異性的解吸可通過含足夠強(qiáng)的配位體的淋洗以物化或熱的方式對APP的排擠、絡(luò)合、改性和/或破壞而實現(xiàn)。也可用機(jī)械法如超聲法來解吸或強(qiáng)化解吸。也可應(yīng)用上述各種解吸方法的組合、當(dāng)然，該核酸不可因所用的解吸方法而分解。
上述步驟是基于發(fā)現(xiàn)，核酸文庫類似于蛋白混合物可借助于親合色譜法按對目的分子即這里的APP(等)的親合力的大小在空間分離。本發(fā)明還基于發(fā)現(xiàn)，可通過避免因非特異性解吸產(chǎn)生的不同親合力的解吸的核酸的混合，其中，在非特異性解吸之前將其中含有結(jié)合的核酸的柱按所說的分割成親合性段，并在如此所得的親合性段或柱段中結(jié)合的核酸可在如PCR或RT-PCR范圍內(nèi)容易地和沒有干擾的配位-耦合非特異性地解吸和非特異性擴(kuò)增。其后避免選擇假象。同樣，也不需要用于解吸的配位體，特別是高濃度的配位體。最后實際上使所有結(jié)合的和其后解吸的核酸分子適于擴(kuò)增。這就使其可以以小的核酸濃度進(jìn)行操作。這原則上是足夠的，只要在核酸文庫中每個類型的分子均以統(tǒng)計平均值存在。如果在柱段中該APP-分子的數(shù)目從統(tǒng)計學(xué)看是1，則甚至可按其對目標(biāo)分子的親合力分離各個核酸類型。
該方法的主要優(yōu)點將在下面闡明。按親合力分離核酸導(dǎo)致在柱段中的核酸有不同的特異性(不同的APP區(qū)通過APP親合性核酸而結(jié)合或是適于APP-親合性核酸的結(jié)合位點)情況下具有類似的親合力。
原則上只要分配有所需親合力的段(分離)其是經(jīng)再處理而解吸。但對此有一個先決條件，在所施加的核酸文庫中要有親合力分配除了在最大親合力的情況下其中關(guān)系到體積流矢量再進(jìn)行第一柱段。因此通常優(yōu)選是，由各段的固定的核酸進(jìn)行分別解吸和回收，具有各段對從中回收的核酸的流徑相配位的各個定位。
原則上任何的解吸均是可能的。優(yōu)選是借助于通常的物化或熱方法進(jìn)行該非特異性解吸。熱解吸是通過加熱該柱段或其中所含的溶液來實現(xiàn)。該加熱例如可通過電加熱或微波輻射或IR進(jìn)行。來自PCR工藝的加熱技求是特別適用的、除了藉助于聚合酶的分別擴(kuò)增核酸或適體外，當(dāng)然也可應(yīng)用其它的擴(kuò)增方法如藉助于連接酶。該非特異性解吸可通過APP-的化學(xué)改性增強(qiáng)，如通過高碘酸鈉或類似物的氧化，或通過形成非特異性絡(luò)合物如藉助于硼酸鹽或類似物以在烴中封端順式-反式二醇鍵。
因此如果該非特異性解吸以熱解吸進(jìn)行則優(yōu)選在延長的PCR或RT-PCR的高溫期中進(jìn)行是有利的。這時可達(dá)到協(xié)同效應(yīng)，因為通常，特別是在用含低濃度核酸種類的核酸文庫工作時擴(kuò)增總是需要的。為提高產(chǎn)率，例如可使用5-60，優(yōu)選20-60，最優(yōu)選45-55個循環(huán)。在該擴(kuò)增范圍內(nèi)，可使用至少一個標(biāo)記的引物。該引可具有至少一個內(nèi)切核酸酶切割位點。這種切割點例如用于排除引物序列的較大范圍的放大物質(zhì)。核苷酸結(jié)構(gòu)組，如是在引物中或在待選擇的核酸情況下例如可通過熒光顏料進(jìn)行標(biāo)記。作為熒光顏料例如可提及Alexa TM氟488、氟532、氟546、氟568、氟594、俄勒崗綠488、熒光黃、若丹明6G、四甲基若丹明、若丹明B和得克薩斯紅。該擴(kuò)增材料也可通過在不同端部的不同化學(xué)改性來標(biāo)記，只要在改性時引入的基團(tuán)合適作為配位體結(jié)合在不同的親合性基體上。
為可靠的分離非-親合的或低親合的核酸，建議在適用的工藝階段之間引入洗滌工藝步驟。如果在方法步驟d)和e)之間進(jìn)行至少一次洗滌工藝步驟是特別有利的。用于洗滌例如溶劑或該核酸文庫的介質(zhì)或該載體物質(zhì)都是適用的。
優(yōu)選的是，該柱子內(nèi)側(cè)用APP(等)涂層并且其固定是通過共價鍵，優(yōu)選在用化學(xué)高反應(yīng)性基(如Tresylchlorid、溴化氰和/或高碘酸鹽)活化后或以化學(xué)小反應(yīng)基(如氨基、羥基、酮基和/或羧基)改性后通過雙官能的間隔基鍵進(jìn)行。例如適于間隔基鍵的間隔主鏈?zhǔn)侨〈暮臀慈〈腃2-C10烷基、取代的和未取代的C2-C10鏈烯基、取代的和未取代的C2-C10炔基、取代的和未取代的C4-C7碳環(huán)烷基、取代的和未取代的C4-C7碳環(huán)鏈烯基、取代的和未取代的C7-C14芳烷基、含選自氮、氧、硫的雜原子的雜環(huán)分子，其中上述的取代可由下列組成烷基、鏈烯基、炔基、烷氧基、硫醇基、硫烷氧基、羥基、芳基、芐基、苯基、硝基、鹵素、含2-10碳原子和1-4氧原子或硫原子的醚基、聚烷基二醇、鹵素、羥基、硫醇基、酮基、羧基、酰胺、醚化合物、硫醚、Arnidine衍生物、胍衍生物、谷氨酰衍生物、硝酸根(ONO2)、硝基(NO2)、腈、三氟甲基(-CF3)、三氟甲氧基(-OCF3)、O-烷基、S-烷基、NH-烷基、N-二烷基、O-芳烷基、S-芳烷基、NH-芳烷基、氨基、疊氮基(N3)、肼基(NHNH2)、羥氨基(ONH2)、亞砜(SO)、砜(SO2)、硫化物(S-)、二硫化物(S-S)、甲硅烷基。通常間隔基鍵是二官能的，其中官能度可相同或不同，并且例如可選自由“N-羥基琥珀酰亞胺和酰肼”構(gòu)成的基。
為減少從柱段所得核酸內(nèi)的可變性，優(yōu)選每個柱段按統(tǒng)計平均值計含0.1-103，優(yōu)選1-102，最優(yōu)選1-10個APP(等)-分子。與此相關(guān)，如施加的核酸文庫按統(tǒng)計平均值計可含0.1-103，優(yōu)選1-102，最優(yōu)選1-10個的一種種類的核酸分子。
對柱的結(jié)構(gòu)材料，可使用基本上所有例如由親合性色譜術(shù)已知的材料。其中，硅膠或聚合物制成的柱，如經(jīng)化學(xué)衍生化而活化或等離子體活化后的聚乙烯。柱段的長度宜為0.1μm-1mm，優(yōu)選0.1-100μm，最優(yōu)選0.5-10μm。這種段片如用顯微切片機(jī)(Mikrotoms)易于制備。柱內(nèi)徑宜為0.05-1mm，優(yōu)選0.1-0.5mm，最優(yōu)選0.2-0.4mm。
在核酸實際分離(結(jié)合或機(jī)械分離)前清除不希望的核酸是適宜的。不希望的核酸例如是結(jié)合在不含APP的柱內(nèi)表面上的核酸。然后不含APP的柱可進(jìn)行預(yù)接，并且該核酸文庫預(yù)先通過該柱。
在前述的工藝方式中，可連續(xù)地即如通過連續(xù)連接的柱子運行，或間斷地即如通過間歇收集來自前柱的洗脫液來運行。
為進(jìn)一步改進(jìn)親合性分離，原則上可以不同的方式操作。如對從一個柱段或多個柱段解吸的核酸，需要時經(jīng)擴(kuò)增后重復(fù)進(jìn)行本發(fā)明方法，和/或可提高在解吸時的洗脫條件(溫度、離子強(qiáng)度、pH-值、緩沖條件)、另外可減少柱段中APP的體密度和由比該結(jié)合的核酸的體密度，即APP-分子的數(shù)目。
APP-結(jié)合的適體(按本發(fā)明上述定義的也包括Aβ42結(jié)合的適體)也是本發(fā)明中優(yōu)選的APP結(jié)合受體。
因此本發(fā)明中將優(yōu)選由肽、抗體或核酸組成的APP-結(jié)合受體在合適的載體材料上以用于體外清除阿爾茨海默氏-(風(fēng)險)病人的APP和其蛋白水解的降解產(chǎn)物。
在醫(yī)學(xué)例行實踐中應(yīng)用本發(fā)明時，必要的是該載體是無菌的和不致熱的，以致滿足這些必要特征的任何載體物質(zhì)或任何受體-/載體-組合物按本發(fā)明都是優(yōu)選的(參見如US 6030614或US 5476715)。該合適的實例有多孔均聚物、含乙烯單體的共聚物或三聚物(例如丙烯酸，如TSK Toyopearl、Fractogel TSK)、用含環(huán)氧乙烷化合物(如表氯醇)和需要時含其它與NH3、氨基或羧基反應(yīng)的化合物改性的載體，或CNBr-吸附劑或CNCL-吸附劑，如在EP 110409A和DE 3617672A中所述。適用于治療目的特別優(yōu)選的吸附材料是適宜的以防止血細(xì)胞損失、不活化或僅稍微活化該輔助系統(tǒng)和盡可能阻止體外循環(huán)中的聚集形成。此外，所用的載體材料優(yōu)選是在耦合到受體時的材料對消毒措施應(yīng)是足夠穩(wěn)定的，特別是耐環(huán)氧乙烷-飽和、耐戊二醛-飽和、耐γ-輻照、耐蒸汽處理、耐UV-處理、耐溶劑處理和/或耐洗滌劑處理等。例如也可應(yīng)用基于瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、丙烯?；?、乙烯基、葡聚糖等的產(chǎn)品，其優(yōu)選具有用于結(jié)合市售可得的APP-結(jié)合受體的合適的官能基。其它合適的載體還包括整塊料(基于橫向交聯(lián)的甲基丙烯酸縮水甘油酯-共-乙二醇二甲基丙烯酸酯-聚合物的載體)(Poschalko et al.，J AmChem Soc.2003 Nov 5；125(44)13415-26)。
為在合適的載體上耦合受體，本專業(yè)人員可利用已知的化學(xué)資料(如Bioconjugate Techniques，Greg T Hermanson，Ed.，Academic Press，Inc，San Diege，CA，1995，758pp)。
另一方面，本發(fā)明還涉及本發(fā)明設(shè)備的應(yīng)用其提供阿爾茨海默氏病的治療或治療設(shè)備或在用于預(yù)防這類病中，其中安排適合針對各個病人治療的設(shè)備。在進(jìn)行治療時，使病人與分離性輸血-裝置相連以足夠長的時間以有效清除APP-多肽，這時病人的血液流或血漿流與含APP-結(jié)合受體的固體載體相接觸，APP和/或APP蛋白水解降解產(chǎn)物，特別是Aβ42被結(jié)合在該受體上。在分離性輸血-治療過程中當(dāng)然要確保外周的或中樞靜脈的靜脈入口或動靜脈的瘺管，如足夠的抗凝作用，以及記錄下所需的定量數(shù)據(jù)和測量數(shù)據(jù)。此外，在大部分分離性輸血-方法中在實際血漿處理之前需要血漿和血液細(xì)胞的主-分離。需要預(yù)防措施的特殊人是有家族病史的人、老年人(＞50、＞60或＞70歲)或具有對AE有另外風(fēng)險因子，特別是遺傳因子的人。
依下列實施例和附圖對本發(fā)明作詳細(xì)闡明，當(dāng)然本發(fā)明并不受限于這些實施例。
附圖簡介

圖1表示Aβ42在肽1208上的結(jié)合(耦合在BSA上和涂于ELISA板上)；圖2表示肽1208(和1208-BSA)在Aβ42上的結(jié)合(涂在ELISA板上)；圖3表示Aβ42在肽1208-BSA上的競爭性結(jié)合。
實施例1.載帶APP-受體的載體的制備1.1整柱按制造商的說明，將CIMEpoxy整柱(BIA分離，ST)用pH-值為8.0的0.5M的Na-磷酸鹽-緩沖液平衡，并也按按制造商的說明活化抗Aβ肽的單克隆抗體和將其耦合到CIM-柱上。用磷酸鹽-緩沖液洗滌該柱多次(+1MNaCl)，并需要時中斷多余的環(huán)氧-基。
通過檢測洗滌流出液和平衡流出液來保證質(zhì)量；只有在流出液中無活性環(huán)氧-基和無抗體-泄漏的柱子才可繼續(xù)應(yīng)用，并安裝到分離性輸血-裝置中。
1.2瓊脂糖凝膠-柱將瓊脂糖疏松材料(瓊脂糖CL4B)以無菌方式裝入無菌和無致熱的容器中，并以無菌方式洗滌該材料，在每次洗滌步驟間于真空下完全干燥該凝膠材料。接著在壓熱釜中于115℃蒸汽消毒瓊脂糖凝膠30分鐘。
消毒后，將該瓊脂糖凝膠放入60％丙酮/水的消毒容器中，并用CNBr和三乙胺活化(14g CNBr/96ml丙酮；30ml三乙胺于66.2ml的87％的丙酮中)。然后加入丙酮/HCl-溶液(392ml消毒的無致熱的水；16.3ml的5N HCl，408ml丙酮)。洗滌經(jīng)活化的瓊脂糖凝膠，并在2小時內(nèi)進(jìn)行耦合反應(yīng)，以阻止經(jīng)活化基團(tuán)的水解。
將經(jīng)消毒過濾的抗體-溶液分別為(m226或m243)引入反應(yīng)容器，并攪拌至少90分鐘。最后對該反應(yīng)溶液進(jìn)行充分洗滌(用等滲磷酸鹽-緩沖液)，直到在流出液中沒有反應(yīng)產(chǎn)物可檢出，并將經(jīng)抗體耦合的瓊脂糖凝膠充填入消毒的和無致熱的以玻璃燒結(jié)制的玻璃柱中和經(jīng)受最終的質(zhì)量檢測(有關(guān)反應(yīng)產(chǎn)物的洗出液、重金屬等的分析；顆粒分析；致熱性；無菌性)。
2.適于阿爾茨海默氏-病人的分離性輸血-治療的動物模型“Gerhardt Katsch”糖尿病研究所研制了一種用于對小動物摸型鼠進(jìn)行分離性輸血-治療的微型體外系統(tǒng)。這種分離性輸血-試驗系統(tǒng)在世界上僅在有非常有限的范圍內(nèi)可以得到。在相同實驗動物中的重復(fù)分離性輸血-治療和接著在后續(xù)觀察期中用于判斷治療結(jié)果的檢查具有十分新穎性，并在國際文獻(xiàn)上至今未描述過。
該分離性輸血是一種替代治療方法，其中，致病物質(zhì)是在體外從血中去除。在人類醫(yī)學(xué)中，該分離性輸血至今是用于治療多于100種的病。藉助于分離性輸血，相關(guān)疾病的物質(zhì)可從血液中完全或至少部分去除，特別是自身免疫病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、內(nèi)分泌眼病、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、僵硬-人綜合癥和I型糖尿病。但至今該分離性輸血僅作為替代方法用于治療一種涉及感染病人有強(qiáng)烈負(fù)擔(dān)和明顯降低生活質(zhì)量的慢性的耐藥性病癥。其主要原因是至今對有成效的分離性輸血-治療的作用機(jī)理還缺乏詳細(xì)了解。
通過應(yīng)用已知的如適于1型糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動物模型可進(jìn)一步闡明分離性輸血-方法作用的機(jī)理以及以臨床前檢驗該分離性輸血-治療的新型適應(yīng)癥。為實施分離性輸血-治療，首先要提供配有慢性血管導(dǎo)管的實驗動物。接著在體外循環(huán)中，該血液的血漿和細(xì)胞成分經(jīng)血漿過濾器分離。該細(xì)胞成分立即返回到動物體中，而該血漿在返回前可通過各種吸附方法(免疫吸附等)進(jìn)行凈化。這種重復(fù)性的分離性輸血-治療的良好耐受性在不同鼠的種系已取得證實(體重、血細(xì)胞比容、一般狀態(tài))。該分離性輸血-試驗系統(tǒng)用最小重量為250g的動物體已進(jìn)行試驗，并在鼠-模型上用于自身免疫病(1型糖尿病、膠原蛋白II型誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎)。
用于小型動物模型的血漿分離性輸血的體外系統(tǒng)可適用于各類吸附。這種試驗系統(tǒng)在慢性病摸型上的應(yīng)用可用于(A)新型的治療對策和預(yù)防對策的試驗，(B)說明各種分離性輸血-技術(shù)的作用機(jī)理和(C)確定各分離性輸血-治療方法的適應(yīng)癥。在新研制的分離性輸血-方法的臨床前試驗中，該IDK是其競爭對手，其非常有利于該新型治療方法從研發(fā)階段經(jīng)動物試驗驗證到病人臨床應(yīng)用的過渡和進(jìn)入市場(http//www.praeklinik.de/)。
在實驗性分離性輸血-治療開始之前給該動物插接動脈導(dǎo)管和靜脈導(dǎo)管，或使用帶慢性插有導(dǎo)管的鼠(適用于施加試驗物質(zhì)和適用于取血樣以及適用于在動物模型中實施分離性輸血-治療和固定檢驗)。在分離性輸血中首先在第一步中通過血漿過濾器分離血細(xì)胞和血漿。該血細(xì)胞立即輸回到動物體內(nèi)(經(jīng)靜脈導(dǎo)管)，而該分離的血漿在返回動物體內(nèi)之前通過實施例1中所制備的吸附裝置(這時該配位體通過結(jié)合到固定的親合性肽上而從該血漿中分離)。
3.Aβ42-適體3.1硅膠柱經(jīng)Tresylchlorid的活化該柱經(jīng)丙酮沖洗。將無水溶液(2ml丙酮、1ml Tresylchlorid、幾滴吡啶)通過該柱以進(jìn)行活化(10倍柱體積)，該柱在冰上培育過夜。接著用20倍柱體積的100％的丙酮(無水)淋洗該柱。該經(jīng)活化的柱在1mM HCl中保存。
3.2聚乙烯柱的活化于室溫下將聚乙烯管用20倍柱體積的溶液(在濃硫酸(H2SO4)中的2％高錳酸鉀(KmnO4)(w/v))淋洗，并接著用蒸餾水淋洗。為繼續(xù)耦合該柱表面，應(yīng)用二價分子或多價分子以交聯(lián)，該分子具有至少一個反應(yīng)性醛基(如1％的戊二醛)。將此在4℃下通過該柱1小時。接著通過還原性條件(如通過氰基硼氫化鈉(在0.15M NaCl中的0.00025％w/v，pH3.9))穩(wěn)定該反應(yīng)。
3.3Aβ42在經(jīng)活化的硅膠柱上的耦合經(jīng)Tresylchlorid活化的柱用0.1M Na2CO3(pH8.5)淋洗。將肽或蛋白(2mg/ml的0.1M Na2CO3，pH8,5)的溶液在37℃下多次通過該柱2小時以進(jìn)行耦合，并接著在冰上放置4小時。為封端該柱的游離結(jié)合位點，接著使過量的0.2M甘氨酸(pH8)通過該柱。
3.4糖蛋白耦合到活化的聚乙烯柱上經(jīng)活化的柱用0.1m Na2CO3(pH8.5)淋洗。用于耦合，將Aβ42(2mg/ml的0.1m Na2CO3，pH8.5)在37℃下多次通過該柱2小時，并接著在冰上放置4小時。為封端該柱的游離結(jié)合位點，接著使過量的0.2M甘氨酸，pH8通過該柱。為改進(jìn)反應(yīng)可加入1-乙-基3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亞胺(EDC)，5％w/v。
3.5制備用于清除不需要的分子的柱經(jīng)Tresylchlorid活化的柱用0.1M Na2CO3(pH8.5)淋洗。如果清除是針對具有一個或多個伯胺或仲胺的分子，則使該分子或混合物(2mg/ml的0.1M Na2CO3，pH8.5)在室溫下多次通過該柱過夜。為封端該柱的游離的結(jié)合位點，接著使一種過量的0.2M甘氨酸(pH8)通過該柱。如果不清除一個或多個伯胺或仲胺的分子，則該柱的所有結(jié)合位點均用甘氨酸封端。
在下列文獻(xiàn)中可以找到另外的派生方法Patterson，W.J.，NationalAeronautics and Space Administration，Technical Memorandum，NASATMX-73311，U.S.Government Printing Office，Washington，D.C.，1976；Ma，S.M.，Gregonis，D.E.，von Wagenen，R.A.，and Andrade，J.D.，in“Hydrogels for Medical and Related Applications”(J.D.Andrade，Ed.)，Amer.Chem.Soc.Symp.Series，Vol.31，p.241，1976；Harris，J.M.，Struck，E.C.，Case，M.G.，Paley，M.S.，Van Alstine，J.M.，and Brooks，D.E.，J.Polymer Sci.，Polymer Chem.Ed.，22，341(1984)；Regnier and Noel，Regnier，F(xiàn).E.，and Noel，R.J.，J.Chromatog.Sci.，14，(1976)；Yalpani，M.and Brooke，D.E.，J.Polymer Sci.，PolymerChem.Ed.，23，395(1985)。
3.6實施核酸在Aβ42上的接觸和柱分離所述涂層柱無泄漏地進(jìn)行串接，首先是用于清除不需要的分子的柱，接著是Aβ42-柱。為了平衡，將合適的緩沖劑，如緩沖溶液(10mM Tris-HCl、50mM KCl、1.5mM MgCl2和明膠0.001％(w/v)，pH8.3)在冰上通過該柱1小時。該組合核酸文庫的核酸放置在1ml的相同緩沖劑中并在95℃下加熱10分鐘以進(jìn)行熔融雙鏈，并接著以多倍(4-30倍)柱體積通過該柱。然后將該柱分離，并在冰上用所選的緩沖劑(見上)洗滌過夜。用合適的切割工具以物流方向分離。
4.Aβ42在肽1208(FGFPEHLLVDFLQSLS-C)上的結(jié)合研究為分析淀粉狀蛋白-β在肽1208上的結(jié)合，首先將肽耦合在載體蛋白(BSA)上，該肽濃度為500μMol(約1mg/ml)。將1208-BSA共軛物結(jié)合到ELISA板上，這時每孔結(jié)合100ng肽。該ELISA板用PBS，1％BSA飽和，接著在8-1000ng/孔的濃度范圍內(nèi)分析淀粉狀蛋白-β(1-42)的結(jié)合。結(jié)合的淀粉狀蛋白-β用特異性的鼠抗體檢測。最后，借助于生物素化的抗-鼠抗體和鏈霉抗生素耦合的過氧化酶進(jìn)行定量測定結(jié)合的淀粉狀蛋白-β的量。使用ABTS作為基質(zhì)，并在405nm波長下在ELISA-讀出器上進(jìn)行分析。(圖1)為分析肽1208的結(jié)合，將淀粉狀蛋白-β(1-42)結(jié)合在ELISA板上(500ng/孔)。接著，該ELISA板用PBS，1％BSA飽和，然后分別加入游離肽1208或1208-BSA共軛物(1.6-50ng)。結(jié)合的肽用特異性單克隆抗體檢測。使用生物素化的抗-鼠抗體和鏈霉抗生素耦合的過氧化酶進(jìn)行最后定量測定。使用ABTS作為基質(zhì)，并在405nm波長下在ELISA-讀出器上進(jìn)行分析。(圖2)將1208-BSA共軛物結(jié)合在ELISA板上(100mg肽/孔)，并用PBS，1％BSA飽和該板。接著在有游離肽1208或?qū)φ针?濃度為30-2000ng/ml)存在下分析淀粉狀蛋白-β(1-42)的結(jié)合。該結(jié)合的淀粉狀蛋白-β的檢測按所述進(jìn)行。(圖3)
權(quán)利要求
1.一種分離性輸血-設(shè)備，該設(shè)備包含一種可與血流或血漿流相接觸的固體載體，其特征在于，該固體載體是一種淀粉狀蛋白-β-前體-蛋白(APP)-結(jié)合受體。
2.權(quán)利要求1的設(shè)備，其特征在于，該APP-結(jié)合受體選自抗-APP-抗體、抗-Aβ40-抗體、抗-Aβ42-抗體、APP結(jié)合蛋白，特別是凝膠溶蛋白、apoJ或apoE、APP結(jié)合肽、APP結(jié)合的神經(jīng)節(jié)苷脂，特別是GM1或APP-結(jié)合核酸，特別是適體或這些受體的混合物。
3.權(quán)利要求1或2的設(shè)備，其特征在于，該載體是一種無菌的和無致熱的柱。
4.權(quán)利要求1-3中任一設(shè)備的應(yīng)用，其提供用于治療阿爾茨海默氏病或用于預(yù)防該病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離性輸血－設(shè)備，其包含可與血流或血漿流相接觸的固體載體，該設(shè)備適用于治療阿爾茨海默氏病人。
文檔編號B01D15/08GK1867365SQ200480030326
公開日2006年11月22日 申請日期2004年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月12日
發(fā)明者弗蘭克·馬特納, 沃爾特·施米特 申請人:阿法里斯研發(fā)有限責(zé)任公司