專利名稱：用于高效色譜的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于進行高效率液相色譜分離的組合物和方法，更具體地涉及用于填充色譜柱的新型組合物和方法。
背景技術(shù)：
利用高性能液相色譜(HPLC)的分離依賴于流體流動流中的許多組分溶質(zhì)分子滲透穿過已知為固定相的粒子填充床。這允許高效地將粒子彼此分離。每種組分對固定相具有不同的親和力，導(dǎo)致每種組分在柱中不同的遷移速率和離開時間。分離效率由溶質(zhì)通過柱時其帶擴展的量確定。
塔板理論通常用來描述溶質(zhì)穿過色譜柱和帶展寬。塔板理論依據(jù)許多速率因子來解釋帶展寬。例如，分離可以視為是在多個相連的均等的離散的假設(shè)步驟中進行的，每個步驟空間都包含固定相和流動相，并且每個步驟中都建立了完全的平衡。每個這樣的階段稱為一個“理論”塔板。在這種情況下，由分離程度計算柱中的理論塔板數(shù)。柱長對于這種有關(guān)理論塔板的計算是重要的。柱長/(計算出的理論塔板數(shù))稱為“等價于一塊理論塔板的高度”或H，并且是帶展寬現(xiàn)象的量度。
帶展寬對于分離重要，表示分離的質(zhì)量。例如，一般而言，分離中帶越寬，分離或柱效率越差。
分離也基于相之間的關(guān)系。在色譜法中，一相是固定的，另一相是流動的。流動相以相對快的速率流動通過固定相，以致在這兩相之間實際上沒有達到完全平衡。當(dāng)進行分離來避免峰展寬并得到清晰高效的分離時，必須要考慮這一點。
在對色譜柱應(yīng)用塔板理論時，所有溶質(zhì)都被假定為最初存在于柱的第一塔板空間中。分散基于分配系數(shù)。在這種情況下，對于所遇到的溶質(zhì)濃度，分配系數(shù)恒定，且溶質(zhì)在每個塔板空間中在兩相之間快速分配自身。
提供最小峰展寬的柱表示清晰的分離，并且是HPLC系統(tǒng)和過程所期望的。充入柱中的填料屬性和柱的填充方式對于樣品組分獲得清晰和高效的分離都是高度重要的。因此，希望使各種確定相關(guān)帶展寬并對柱性能產(chǎn)生有害影響的過程達到最小。這些過程中的每一種對柱塔板高度H的影響可以通過速率理論而與例如流動相速度u、填充粒子的直徑dp和溶質(zhì)在流動相中的擴散系數(shù)之類的實驗變量相關(guān)。Van Deemter方程一般考慮HPLC中對等價于一塊理論塔板的高度H起作用的主帶展寬過程。此外，該方程可以簡化為與三個重要的變量粒子大小、流體速度和擴散系數(shù)相關(guān)。在該化簡方程中，隨著粒子大小增大，效率應(yīng)該下降。隨著流體速度增加，方程預(yù)測到傳質(zhì)項將決定效率，劣化與速度和粒子直徑的乘積成比例。應(yīng)認識到希望使帶展寬達到最小來確保在分析色譜法、產(chǎn)品純度和制備性色譜法中獲得最佳的溶質(zhì)分離。
但是，更小粒子在柱效率方面所帶來的好處一定被更高反壓的缺點所抵消，更高反壓的缺點包括由更高的系統(tǒng)壓力所造成的儀器成本增加和可靠性降低。而且，通常斷言理論上液相色譜中所用的粒子應(yīng)該是單分散的，并且具有盡可能窄的粒子大小分布。例如，Dewaele和Verzele公開了(J.Chromatography，260(1983)13-21)不同粒子大小的不規(guī)則形狀材料的混合體進行填充比相應(yīng)同等平均粒子大小產(chǎn)生更大的壓力。Dewaele和Verzele的工作局限在兩種組分的混合體?；旌象w中的每種組分具有單分散的粒子分布和分布的平均值。此外，粒子大小分布的平均值彼此相差大于40％。換句話說，平均直徑相差大的粒子混合體對降低系統(tǒng)的總反壓沒有效果。
因此，希望提供一種或者多種允許高效并有效分離的新材料，從而避免反壓增加和分離及效率差的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于色譜的裝置、方法和填充組合物。填充組合物包括兩種或多種具有粒子大小分布(PSD)和粒子大小分布平均值的組分。任意兩個粒子大小分布的平均值之間的差小于較大組分的平均值的40％。
粒子可以是適合色譜用途的任何無機或混雜無機/有機材料。
本發(fā)明還提供了包括具有PSD的粒子的填料和色譜柱，該PSD相對于具有更高反壓的填料被加寬了。
本發(fā)明還提供了制造并使用粒子或填料來分離各種有機和無機材料的方法。
最后，本發(fā)明提供了在總的分離和增大效率中有用的粒子二聚體。


圖1示出了HPLC系統(tǒng)的塔板高度與流動相線性速度的van Deemter圖的實例。
圖2示出了單分散和雙分散樣品的彼此重疊的粒子大小分布圖。
圖3示出了對于比較了具有圖2中所示大小分布的粒子的HPLC實驗的反壓與流速的圖。
圖4示出了圖3中所示實驗的van Deemter圖。
圖5示出了本發(fā)明的粒子的透射電子顯微圖。
圖6示出了對于其中柱填料是大粒子和小粒子的混合體的HPLC實驗，效率與大粒子百分比的圖。
圖7示出了對于與圖6中相同實驗，系統(tǒng)壓力與大粒子百分比的圖。
具體實施例方式
在詳細描述本發(fā)明之前，必須注意如本說明書和所附權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)對象，除非上下文另有清楚規(guī)定。因而，例如提及“一種材料”則包括多種材料的組合，提及“一種化合物”則包括多種化合物的混合物，提及“一種氮化物”則包括多種氮化物等。
在本發(fā)明的描述和權(quán)利要求中，將根據(jù)以下說明的定義使用下面的術(shù)語。
術(shù)語“基本上”當(dāng)這里用來表示物性時，意思是所述值的10％以內(nèi)。
術(shù)語“填充材料”表示無孔，有孔，或者有孔、無孔或表面有孔混合的填充材料。該術(shù)語并非用來限制，并包括上述材料的組合和混合體。
術(shù)語“固定相”表示包括粒子的相，這些粒子包括有機或無機材料，它們?nèi)芜x地具有與其鍵合的有機片段，從而使得粒子表面有益于某些色譜分離。在某些情況下，這些粒子或材料固定在柱中，不移動。無機材料的實例是但不限于硅石、鋯和鈦的氧化物。有機材料的實例是苯乙烯二乙烯基苯共聚物。無機材料也可包括本領(lǐng)域已知的、在同一結(jié)構(gòu)中包含有機和無機片段的“混雜”粒子，這種粒子在轉(zhuǎn)讓給Merck的美國專利4,017,528和轉(zhuǎn)讓給Waters的美國專利6,528,167和6,686,035中都有描述，并通過引用將這三篇專利的內(nèi)容結(jié)合于此。
這里參照圖來描述本發(fā)明。圖不是按比例繪制的，特別是為了清楚表述，某些尺寸可能夸大了。
實施例1通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如在都轉(zhuǎn)讓給Du Pont的美國專利No.3,782,075、3,855,172和4,010,242中描述的(通過引用將這三篇專利的內(nèi)容結(jié)合于此)標(biāo)準(zhǔn)方法，制備兩個已鍵合硅石粒子的樣品。利用也轉(zhuǎn)讓給Du Pont的美國專利No.4,705,725(通過引用將其內(nèi)容結(jié)合于此)中所描述的鍵合化學(xué)物來鍵合粒子。鍵合相是碳18(十八烷基)材料。應(yīng)該注意，這些處理技術(shù)得到限定的粒子大小分布(PSD)。這在工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中是普遍公知的。應(yīng)該注意，雖然在這些方法的情況下描述本發(fā)明，但本發(fā)明不應(yīng)視為限于這些粒子大小分布的組分。例如，能夠使用或開發(fā)生產(chǎn)近似相同或類似大小的、不在某種分布中的粒子。本發(fā)明也適用于這些類型的材料和情況。
圖2表示通過Coulter計數(shù)器(Beckman Instruments，Hialeah，F(xiàn)L)得到的這兩個樣品的粒子大小分布。從低于1μm到6μm用256個格子，計算每個格子中的粒子數(shù)目。從圖2可見，一個樣品(標(biāo)記為A)是單分散的，在約2μm處可以看到一個峰。第二個樣品提供了兩個峰，基本是直徑為1.8μm和2.2μm的粒子混合體，如Coulter計數(shù)器測得的。
使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將這兩個樣品填入直徑為4.6mm、長30mm的HPLC柱中。在Agilent 1100儀器(Agilent Technologies，Wilmington，DE)上進行HPLC實驗來測量反壓作為流動相通過柱的體積流速的函數(shù)和測量換算的塔板高度作為線性流速的函數(shù)。洗脫液是在20℃溫度下的85∶15乙腈∶水(體積比)。樣品是苯辛酮，在245nm下進行紫外檢測。
圖3示出了HPLC實驗的反壓圖。其中示出了樣品A和B，并且所示樣品B在如通過圖4中van Deemter圖判斷的最佳流速下的反壓比樣品A的要低20％。
圖4示出了樣品柱的van Deemter曲線。利用相同的平均粒子大小，計算這兩個柱的換算塔板高度。就最大柱效率而言的最佳流速通過圖中的最小值的位置來判斷，并且從圖中可見，在最小塔板高度周圍，塔板高度相差不超過幾個百分比(樣品B的0.00385mm對樣品A的0.00372mm)；曲線中最小值足夠?qū)挘瑥亩谥恼麄€工作速度范圍中柱的性能基本相同。
因此，樣品B的較寬粒子大小分布證明在HPLC實驗中有效地明顯降低了反壓，同時又沒有犧牲柱效率。
圖5示出了裝有上述寬PSD粒子的載片放大500倍的透射電子顯微圖(TEM)。雖然一般不可能將Coulter計數(shù)器數(shù)據(jù)與TEM數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，但顯微圖中的許多粒子似乎連結(jié)形成二聚體。因此，雖然不希望受機理所限，但可能如Coulter計數(shù)器所測得的某些或所有PSD雙峰特點是由二聚體結(jié)構(gòu)造成的。這里所要求保護的本發(fā)明范圍包括其中存在二聚體粒子結(jié)構(gòu)的PSD。
實施例2制備具有與實施例1中相同鍵合相、內(nèi)徑為4.6mm、長為30mm的HPLC柱。這些柱裝載有1.8μm平均直徑和3.5μm平均直徑的單峰粒子大小分布的粒子混合體。HPLC實驗條件如下儀器Agilent 1100(Agilent Technologies，Wilmington，DE)注射體積2μl檢測具有1.8ul池的254nm紫外流動相 60/40甲醇/水流速1.5ml/min
溫度室溫樣品尿嘧啶、苯酚、4-氯硝基苯和甲苯表1

從表1中可見，更小粒子1.8μm的效率優(yōu)勢在加入高達30％更大粒子的情況下基本得以保留，并且系統(tǒng)壓力節(jié)省57bar。圖6和7更清楚地示出了這種影響，其中效率與3.5μm粒子的百分比曲線表明加入高達40％粒子仍呈平臺狀，壓力與3.5μm粒子的百分比曲線基本為線性。
從“背景技術(shù)”部分的討論并不能直接清楚為什么這種多種粒子大小的混合體應(yīng)該能夠表現(xiàn)出相對于操作柱所需的反壓的這種高效率。在不希望受機理所限的情況下，對柱效率的可能貢獻可能來自于柱的裝填更容易，從而色譜效率更接近于更小粒子的理論最大值。另一可能的貢獻可能來自于固定相與該固定相已填入其中的柱的壁之間的邊界填充效應(yīng)。
雖然以上給出的實施例都限制了具體的粒子大小分布和色譜條件設(shè)置，但本發(fā)明不應(yīng)視為是受限于這些條件。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員從本公開內(nèi)容將清楚，柱中填料可以包括其它不是鍵合硅石的材料，并仍保持與硅石柱相同的由PSD帶來的好處。
此外，PSD不需要是雙峰的，只要相比較具有相同平均粒子大小的窄PSD，它寬得足以提供對反壓的所需降低。本領(lǐng)域的技術(shù)人員不需過多實驗就能夠開發(fā)出具有表現(xiàn)出反壓與效率的最優(yōu)關(guān)系的PSD粒子。
固定相中的粒子不必所有的都具有相同程度的孔。例如，固定相可以包括帶有不同程度孔的粒子混合體，例如無孔的粒子或表面有孔的粒子。表面有孔粒子的實例在轉(zhuǎn)讓給Du Pont的美國專利No.4,477,492中給出，并通過引用將其內(nèi)容結(jié)合于此?？傊景l(fā)明的范圍涵蓋任何相對于效率基本相同的固定相反壓降低的、多孔性不同的多種大小粒子的混合體。
本發(fā)明的粒子的平均粒子大小也不應(yīng)視為受限于上述實施例。平均粒子大小僅受粒子作為色譜固定相的可用性限制，并且通常在0.5μm～100μm和1μm～10μm的范圍中。雖然以上給出的實施例涉及粒子在分析應(yīng)用中的使用，但本發(fā)明用在制備色譜法中的優(yōu)勢將明顯可見，其中對于給定的反壓可得到更高的效率。
雖然實施例表明本發(fā)明用于小的有機分子(尿嘧啶、苯酚、甲苯和4-硝基苯)，但本發(fā)明也適用于分離大的聚合物、蛋白質(zhì)、核酸和肽。利用本發(fā)明也可分離本領(lǐng)域已知的其它生物分子。
權(quán)利要求
1.一種用在色譜分離中的柱，包括(a)殼體；和(b)設(shè)置在所述殼體內(nèi)的固定相，該固定相包括填充材料，所述填充材料包括兩種或多種組分，每個組分具有一粒子大小分布和一平均粒子直徑，其中任意兩個平均直徑的差小于或等于較大平均值的40％。
2.如權(quán)利要求1所述的柱，其中所述固定相包括選自有機材料、無機材料、混雜材料或其組合的材料。
3.如權(quán)利要求1所述的柱，其中所述分布的兩個峰處的直徑之間的差小于或等于這兩個峰各處直徑的平均值的35％。
4.如權(quán)利要求1所述的柱，其中所述柱可用在液相色譜分離中。
5.如權(quán)利要求4所述的柱，其中所述柱可用在制備分離中。
6.如權(quán)利要求1所述的柱，其中所述柱可用于氣相色譜分離中。
7.如權(quán)利要求1所述的柱，其中所述填充材料包括二聚體。
8.一種用在色譜分離中的柱，包括(a)殼體；和(b)設(shè)置在所述殼體內(nèi)的固定相，該固定相包括粒子數(shù)在500和3000之間、粒子平均直徑在1和4微米之間的第一組分和粒子數(shù)在500和3000之間、粒子平均直徑在1和4微米之間的第二組分。
9.用在色譜填充材料中作為固定相的物質(zhì)組合物，所述填充材料包括具有雙峰數(shù)均粒子大小分布的粒子或者具有雙峰數(shù)均粒子大小分布的不同多孔性粒子的混合物，在所述粒子大小分布中，所述分布的兩個峰處的直徑之間的差小于或等于這兩個峰處直徑的平均值的40％。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述固定相包括選自有機材料、無機材料、混雜材料或其組合的材料。
11.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述固定相包括具有雙峰分布的粒子，在所述分布中，所述分布的兩個峰處的直徑之間的差小于或等于這兩個峰處直徑的平均值的35％。
12.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述組合物可用在液相色譜分離中。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述組合物可用在制備分離中。
14.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述組合物可用于氣相色譜分離中。
15.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述填充材料包括二聚體。
16.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述填充材料包括球形粒子和所述球形粒子二聚體的復(fù)合粘結(jié)結(jié)構(gòu)的粒子。
17.一種色譜分離方法，包括(a)使樣品接觸具有填充材料的固定相，該填充材料包括具有粒子大小分布的粒子，在所述粒子分布中，每種分布的兩個峰處的粒子直徑之間的差小于或等于這兩個峰處直徑的平均值的40％；和(b)分離樣品組分。
18.如權(quán)利要求17所述的色譜分離方法，其中所述固定相包括選自有機材料、無機材料、混雜材料或其組合的材料。
19.如權(quán)利要求17所述的色譜分離方法，其中所述柱可用在液相色譜分離中。
20.如權(quán)利要求17所述的色譜分離方法，其中所述柱可用于氣相色譜分離中。
21.如權(quán)利要求1所述的柱，其中所述填充材料包括球形粒子和所述球形粒子二聚體的復(fù)合粘結(jié)結(jié)構(gòu)的粒子。
22.一種色譜分離方法，包括(a)使樣品接觸固定相，所述固定相具有包括第一和第二組分的填充材料，所述第一組分的數(shù)均粒子大小分布比所述第二組分的數(shù)均粒子大小分布寬，其中所述第一組分的最大粒子大小直徑近似于所述第二組分的最大粒子大小直徑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于改進色譜分離的新型組合物、柱和方法。具體地，新型柱填料用來提高總的色譜分離和效率。本發(fā)明提供了具有用于分離小分子、蛋白質(zhì)或核酸的多種粒子或的粒子混合物的填充材料。
文檔編號B01D15/08GK1724105SQ200510080509
公開日2006年1月25日 申請日期2005年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月1日
發(fā)明者威廉·E·貝爾波, 艾倫·D·博若司克, 蒂莫西·詹姆斯·朗洛伊斯 申請人:安捷倫科技有限公司