專利名稱：一種固定化金屬的親和色譜固定相及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離與純化技術(shù)，具體是一種固定化金屬的親和色譜固定 相及其制備方法。
背景技術(shù)：
翻譯后蛋白質(zhì)的修飾是蛋白質(zhì)組中研究的熱點課題。蛋白質(zhì)磷酸化作 為一種最常見，最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，參與了幾乎所有調(diào) 節(jié)生命活動的整個過程，包括細胞的增殖，發(fā)育和分化，神經(jīng)活動，肌肉 收縮，新陳代謝，腫瘤發(fā)生等，蛋白質(zhì)磷酸化還是目前所知道的信號的主 要傳遞方式。
蛋白質(zhì)磷酸化分析的傳統(tǒng)方法如放射性同位素標(biāo)記、化學(xué)修飾、Edman 降解以及薄層層析等方法。這些方法操作相對繁瑣，對實驗技能要求較高， 蛋白樣品需求量較大，或存在放射性污染等問題，限制了其廣泛使用。
近些年來用固定化金屬親和色譜來富集磷酸化肽段的方法由于其操作 簡單，成本較低，對實驗室要求也不那么嚴格，近些年得到了最為廣泛的 應(yīng)用。該方法的主要原理是利用磷酸化肽段所帶的磷酸根與固定化金屬親 和色譜中所固載的金屬離子之間發(fā)生作用，而非磷酸化肽不與之發(fā)生作用， 從而起到分離富集的效果。目前常用于磷酸化肽段富集的固定相多種多樣， 主要有瓊酯糖基、淀粉基、A1203、磁珠以及硅膠基質(zhì)等，通過用亞胺二乙 酸等衍生，利用羧基再與金屬離子如鐵、鎵等螯合，再用于磷酸化肽段富 集Aprilita, N. H. 等，"Poly(glycidyl methacrylate/divinylbenzene)-IDA-Fe-III in phosphoproteomics"，《Journal of Proteome Research》，P2312-2319 (2005年)；近 些年來Ti02和Zr02微球(Kweon, H. K等，"Selective zirconium dioxide-based enrichment of phosphorylated peptides for mass spectrometric analysis", 《Analytical Chemistry》，1743-1749 (2006年))也應(yīng)用于磷酸化肽段的富集，其本身即充當(dāng) 基質(zhì)，又提供與磷酸化肽段作用的金屬離子。亦有文獻報道利用磷酸酯中 的磷酸集團，與鋯等金屬離子相互作用，得到寡核苷酸單分子層，或利用 這種現(xiàn)象合成了以硅基質(zhì)為基礎(chǔ)的固定化金屬親和色譜基質(zhì)，但以聚甲基 丙烯酸縮水甘油酯類聚合物磷酸酯為基質(zhì)的固定化金屬親和色譜固定相用 于磷酸化肽段富集未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種通過化學(xué)反應(yīng)將聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物， 鍵合上磷酸酯基團，再與鋯、鐵等金屬離子螯合，實現(xiàn)對磷酸化肽段的高 選擇性分離、富集與純化固定化金屬的親和色譜固定相及其制備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 固定相結(jié)構(gòu)式為-.<formula>formula see original document page 5</formula>
其中GMA Polymer微球，粒徑為1 OOnm— 50um 。
所述GMA Polymer微球為聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球。所 述聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球為甲基丙烯酸縮水甘油酯的交聯(lián) 均聚物或甲基丙烯酸縮水甘油酯與烯烴的交聯(lián)共聚物微球。所述甲基丙烯 酸縮水甘油酯的交聯(lián)均聚物是指聚甲基丙烯酸縮水甘油酯-乙烯基甲基丙烯 酸縮水甘油酯(GMA-EDMA);甲基丙烯酸縮水甘油酯與烯烴的交聯(lián)共聚 物是指聚甲基丙烯酸縮水甘油酯與苯乙烯的的交聯(lián)共聚物。
固定相的制備方法包括以下步驟
1) 氨基化反應(yīng)將100-400 g/L的氨基化試劑溶液與GMAPolymer微 球以5-25ml/lg比例混合，在0-80。C下反應(yīng)3-12h,反應(yīng)后產(chǎn)物用水沖洗 至中性，得氨基化的微球；
或?qū)⑸鲜鯣MA Polymer微球采用上述GMA Polymer整體柱替換，泵入 流速為0.001-0.5 mL/min，即得氨基化的整體柱。
2) 將步驟1 )得到每lg的氨基化的微球置于5-10 ml無水乙腈溶液中， 室溫條件下反應(yīng)過夜，待用；無水乙腈溶液中含有40-100mMPOC13, 40-60 mM2, 4, 6-三甲基卩比嚏;
或?qū)⒑?0-100 mM POC13, 40-60 mM 2, 4, 6-三甲基吡嚏的無水乙腈 溶液以0.001-0.5 mL/min的流速泵入步驟1)得到的氨基化的整體柱內(nèi),過 夜；
3) 將50-100倍微球或整體柱體積的水加入到步驟2)得產(chǎn)物中，使其 充分水解；
4) 將水解后的微球用醋酸或三氟乙酸將調(diào)至pH2-3，而后加入100 mM 的EDTA溶液(l g/5-10ml)，震蕩l-2小時，離心，棄去上清液，沉淀用水 洗滌3-5次，真空干燥，即可到固定化金屬親和色譜固定相。
或?qū)H 2-3醋酸或三氟乙酸溶液泵入整體柱，流速為0.001-0.5 mL/min, 時間30-60 min,然后將1.00 mM的EDTA溶液泵入整體柱，流速為0.001-0.5 mL/min,時間30-60 min,再用水以0.001-0.5 mL/min的流速沖洗整體柱 30-60min,即可到固定化金屬親和色譜固定相。
所述氨基化試劑為氨水、3，3-二氨丙基亞胺、乙二胺或1,6-二氨基已烷。
固定相的預(yù)處理，使用前將所述固定化金屬親和色譜固定相與鋯或鐵離 子溶液以l:50-100(g/ml)的比例加入含有100-200 mM鋯或鐵離子的質(zhì)量濃 度10%的醋酸溶液，放置過夜；離心，棄去溶液部份，再用質(zhì)量濃度10% 的醋酸溶液洗滌3次，真空干燥；
磷酸化肽段的分離、富集與純化，具體操作使用所得的固定相時，將固定化金屬親和色譜固定相與蛋白樣品以重量比為100-200: l混合，孵育30 分鐘，洗滌去除非磷酸化肽段，最后用質(zhì)量濃度為12.5%的氨水洗脫。 本發(fā)明所具有的優(yōu)點
本發(fā)明較傳統(tǒng)固定化金屬親和色譜固定相可有效提高對磷酸化肽段的 選擇性富集效果，且可以有效降低對非磷酸化肽段的非特異性吸附，基質(zhì) 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可在較廣的pH范圍內(nèi)使用。
本發(fā)明通過化學(xué)反應(yīng)將聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物，鍵合上磷 酸酯基團，再與鋯、鐵等金屬離子螯合，實現(xiàn)對磷酸化肽段的高選擇性分 離、富集與純化。與傳統(tǒng)的IMAC材料相比，其具有非特異性吸附小，分 辨率高等優(yōu)點，聚合物微球可以方便的裝填成各成IMAC柱，整體柱由于 體積可變，可以制成不同長度，不同內(nèi)徑的IMAC柱，特別是制成微柱后， 適合于微量樣品中的磷酸化肽段的富集，并且可以方便地與^HPLC-ESI-MS 聯(lián)用，提高質(zhì)譜的檢測限和靈敏度。


圖1為本發(fā)明的固定化金屬親和色譜固定相的合成路線示意圖。
圖2為采用本發(fā)明的固定化鋯離子親和色譜固定相富集(x-酪蛋白中磷 酸化肽段的MALDITOF MS譜圖。
圖3為釆用本發(fā)明的固定化鋯離子親和色譜固定相富集p-酪蛋白中磷 酸化肽段與標(biāo)準磷酸化酪氨酸肽段混合的MALDITOF MS譜圖。
圖4為采用本發(fā)明的固定化鐵離子親和色譜固定相富集a-酪蛋白中磷 酸化肽段的MALDITOFMS譜圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合

對本發(fā)明作具體敘述。 實施例1
固定相的制備方法包括以下步驟
GMA Polymer微球的制備由聚甲基丙烯酸縮水甘油酯與乙烯基甲基 丙烯酸縮水甘油酯所得的微球，通過溶脹法，以聚乙烯基苯為種子(0.5g)， 通過甲基丙烯酸縮水甘油酯(9.0 g)與乙烯基甲基丙烯酸縮水甘油酯(3.5 g)在 種子上聚合，2% (w/w)的AIBN為引發(fā)劑，在120 mL 0.1% SDS (w/w)溶 液反應(yīng)，超聲震蕩至成固體，得到無孔的的聚合物微球，粒徑8-12 um。(參 見Boling Gong, Jinxia Zhu, Long Li, Kejuan Qiang, Li Ren, Synthesis of non-porous poly(glycidylmethacrylate國co-ethylenedimethacrylate) beads and their application in separation of biopolymers,Talanta， 2006, 68: 666-672。
l)氨基化反應(yīng)釆用25%(質(zhì)量濃度)的濃氨水為氨基化試劑與10 ml/ lg的上述制備的GMAPolymer微球混合，在60°C下反應(yīng)3小時，反應(yīng)后 產(chǎn)物用水沖洗至中性，得氨基化的微球；
或?qū)⑸鲜鯣MA Polymer微球釆用上述GMA Polymer整體柱替換，泵入 速度為0.5mL/min 。2) 將步驟l)得到每lg的氨基化的微球置于10ml無水乙腈溶液中， 室溫條件下反應(yīng)12小時，待用；無水乙腈溶液中含有40mMPOC13,40mM 2, 4, 6-三甲基吡啶;
或?qū)o水乙腈溶液以0.5 mL/min的流速泵入步驟1 )得到氨基化的整體 柱內(nèi)；使其用無水乙腈將反應(yīng)體系置換至無水體系；
3) 將50倍微球或整體柱體積的水加入到步驟2)得產(chǎn)物中，使其充分 水解；
4) 將水解后的產(chǎn)物用醋酸將調(diào)至pH2-3，而后加入30)iL100mM的 EDTA溶液，震蕩1小時，離心，棄去上清液，沉淀水洗滌3次；真空干燥， 即可到固定化金屬親和色譜固定相。
或?qū)H2-3醋酸溶液以流速為0.5mL/min，時間30min,泵入整體柱， 然后將100 mM的EDTA溶液以流速為0.5 mL/min，時間30min,泵入整 體柱，再用水以0.5 mL/min的流速沖洗整體柱30min,即可到固定化金屬 親和色譜固定相。
固定相的預(yù)處理，使用前將所述固定化金屬親和色譜固定相與鋯或鐵離 子溶液以1: 100(g/ml)的比例加入含有100 mM鋯離子的質(zhì)量濃度10%的醋 酸溶液，放置過夜；離心，棄去溶液部份，再用質(zhì)量濃度10%的醋酸溶液 洗滌3次，真空干燥；
磷酸化肽段的分離、富集與純化，具體操作使用所得的固定相時，將固 定化金屬親和色譜固定相與蛋白樣品以重量比為100: 1混合，孵育30分 鐘，洗滌去除非磷酸化肽段，最后用質(zhì)量濃度為12.5%的氨水洗脫。
實施例2
與實施例l不同之處在于
GMA Polymer微球的制備通過溶脹法，以聚乙烯基苯為種子，通過 甲基丙烯酸縮水甘油酯與乙烯基甲基丙烯酸縮水甘油酯在種子上聚合，得 到大孔的的聚合物微球，粒徑8-12 um。 (BolingGong,Lili Wang, Chaozhan Wang, Xindu Geng, Preparation of hydrophobic interaction chromatographic packings based on monodysperse
poly(glycidylmethacrylate畫co-ethylenedimethacrylate) beads and their application, Journal of Chromatography A, 2004， 1022:33-39。)
1) 氨基化反應(yīng)將20g3,3-二氨丙基亞胺溶于lOOmL無水丙酮中，聚 甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球加入該無水丙酮溶液中(l g/ 10 mL), 室溫條件下反應(yīng)4h，反應(yīng)后產(chǎn)物用水沖洗至中性，得氨基化的微球；
或?qū)⑸鲜鯣MA Polymer微球釆用上述GMA Polymer整體柱替換，泵入 速度為0.5mL/min 。
2) 將步驟1 )得到每lg的氨基化的微球置于5 ml無水乙腈溶液中，室 溫條件下反應(yīng)過夜，待用；無水乙腈溶液中含有100mMPOC13，60mM2,4, 6-三甲基p比p定；或?qū)o水乙腈溶液以0.001 mL/min的流速泵入步驟1 )得到每lg的氨 基化的整體柱內(nèi)；
3) 將100倍微球或整體柱體積的水加入到步驟2)得產(chǎn)物中，使其充 分水解；
4) 將水解后的微球用三氟乙酸將調(diào)至pH 2-3，而后加入100 mM的 EDTA溶液(l g/5-10ml)，震蕩2小時，離心，棄去上清液，沉淀用水洗滌 5次，真空干燥，即可到固定化金屬親和色譜固定相。
或?qū)H2-3三氟乙酸溶液以泵入流速為0.001 mL/min,時間60 min整 體柱，然后將100 mM的EDTA溶液以流速為0.001 mL/min，時間60min， 泵入整體柱，再用水以0.001 mL/min的流速沖洗整體柱60 min，即可到固 定化金屬親和色譜固定相。
固定相的預(yù)處理，使用前將所述固定化金屬親和色譜固定相與鋯或鐵離 子溶液以1: 50(g/ml)的比例加入含有100 mM鋯離子的質(zhì)量濃度10%的醋 酸溶液，放置過夜；離心，棄去溶液部份，再用質(zhì)量濃度10%的醋酸溶液 洗滌3次，真空干燥；
磷酸化肽段的分離、富集與純化，具體操作使用所得的固定相時，將固 定化金屬親和色譜固定相與蛋白樣品以重量比為200: 1混合，孵育30分 鐘，洗滌去除非磷酸化肽段，最后用質(zhì)量濃度為12.5%的氨水洗脫。 實施例3
與實施例l不同之處在于
GMAPolymer微球的制備通過溶脹法，以聚乙烯基苯為種子(0.5 g)， 通過甲基丙烯酸縮水甘油酯(9.0 g)與乙烯基甲基丙烯酸縮水甘油酯(3.5 g)在 種子上聚合，2% (w/w)的AIBN為引發(fā)劑，在120 mL 0.1% SDS (w/w)溶 液反應(yīng)，超聲震蕩至成固體，得到無孔的的聚合物微球，粒徑8-12 um。 (Boling Gong, Jinxia Zhu， Long Li, Kejuan Qiang, Li Ren, Synthesis of non-porous poly(glycidylmethacrylate-co-ethylenedimethacrylate) beads and their application in separation of biopolymers，Talanta, 2006, 68: 666-672)。
1)氨基化反應(yīng)將乙二胺40g溶于100mLpH5左右的嗎啉乙烷碘酸 (MES),聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球加入溶液中(lg/10mL)，室 溫條件下反應(yīng)3h，反應(yīng)后產(chǎn)物用水沖洗至中性，得氨基化的微球；
或?qū)⑸鲜鯣MA Polymer微球釆用上述GMAPolymer整體柱替換，泵入 速度為0.5mL/min 。
2)將步驟1)得到每lg的氨基化的微球置于8 ml無水乙腈溶液中，室 溫條件下反應(yīng)過夜，待用；無水乙腈溶液中含有60mMPOC13,50mM2,4, 6-三甲基吡P定；
或?qū)o水乙腈溶液以0.05 mL/min的流速泵入步驟1 )得到每lg的氨基 化的整體柱內(nèi)；
3 )將80倍微球或整體柱體積的水加入到步驟2 )得產(chǎn)物中，使其充分水解；4)將水解后的微球用三氟乙酸將調(diào)至pH 2-3，而后加入100 mM的 EDTA溶液(l g/5-10 ml),震蕩1.5小時，離心，棄去上清液，沉淀用水洗 滌4次，真空干燥，即可到固定化金屬親和色譜固定相?；?qū)H2-3三氟乙酸溶液泵入整體柱，流速為0.001-0.5 mL/min,時間 30-60 min，然后將100 mM的EDTA溶液泵入整體柱，流速為0.001-0.5 mL/min，時間30-60 min，再用水以0.001-0.5 mL/min的流速沖洗整體柱 30-60min,即可到固定化金屬親和色譜固定相。 實施例4與實施例1不同之處在于GMA Polymer微球的制備首先在3%的KPS(過磷酸鉀)做引發(fā)劑，將 亞胺基二乙酸(IDA)衍生的GMA與苯乙烯在乙醇/水溶液中70攝氏度反應(yīng) 12h，得到苯乙烯基-甲基丙烯酸縮水甘油酯-IDA-微球，粒徑100nm左右。 (C.Y. Chen, and C.Y Chen, Stability constants of water-soluble and latex types of chelating polymers containing iminodiacetic acid with some transition-metal ions. European Polymer Journal, 2003， 39: 991-1000.)1) 氨基化反應(yīng)將1，6-二胺基己烷10g冰水洛中溶于pH7.5, 200 mM 磷酸鹽緩沖體系中，用濃HCl調(diào)節(jié)pH值保持在7.5，最終體積為100 mL,聚 甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球加入該溶液中(l g/ 10 mL)， 4攝氏度 反應(yīng)5h，反應(yīng)后產(chǎn)物用水沖洗至中性，得氨基化的微球；或?qū)⑸鲜鯣MA Polymer微球采用上述GMA Polymer整體柱替換，泵入 速度為0.001 mL/min 。2) 將步驟1)得到每lg的氨基化的微球置于7 ml無水乙腈溶液中，室 溫條件下反應(yīng)過夜，待用；無水乙腈溶液中含有80mMPOC13,45mM2,4, 6-三甲基吡嚏；或?qū)o水乙腈溶液以0.001-0.5 mL/min的流速泵入步驟1)得到每lg的氨基化的整體柱內(nèi)；3) 將50-100倍微球或整體柱體積的水加入到步驟2)得產(chǎn)物中，使其充分水解；4) 將水解后的微球用醋酸或三氟乙酸將調(diào)至pH2-3，而后加入100 mM 的EDTA溶液(l g/5-10 ml),震蕩2小時，離心，棄去上清液，沉淀用水洗 滌3次，真空干燥，即可到固定化金屬親和色譜固定相?；?qū)H2-3醋酸或三氟乙酸溶液泵入整體柱，流速為0.001-0.5 mL/min, 時間30-60 min, 然后將100 mM的EDTA溶液泵入整體柱，流速為0.001-0.5 mL/min,時間30-60 min,再用水以0.001-0.5 mL/min的流速沖洗整體柱 30-60min,即可到固定化金屬親和色譜固定相。應(yīng)用例1樣品蛋白酶解溶液的制備1 mg的ot-酪蛋白和(3-酪蛋白的分別溶解在lmL, 50 mM的碳酸氫胺溶液中(pH 8.2)，按照與胰蛋白酶的質(zhì)量比40:1 的比例加入胰蛋白酶進行酶解反應(yīng)，反應(yīng)時間為16 h，酶解溫度控制在37 °C，加入0.1%甲酸。獲得的蛋白酶解溶液置于冰箱中保存?zhèn)溆谩Ａ姿峄亩蔚姆蛛x、富集與純化將實施例1中所得的固定化鋯離子 親和色譜固定相加入至乙腈，得最終濃度為30mg/mL。1. 將a-酪蛋白和卩-酪蛋白的酶解液2 pmol加入100 的10%醋酸溶液， 再加入10pL的實施例1的固定相，室溫下孵育30分鐘，然后在35000xg 下高速離心，棄去上層清液。2. 加入100 jiL含100 mM NaCl的10%醋酸溶液，振搖清洗5分鐘，然 后在35000xg下高速離心，棄去上層清液。3. 加入100 iliL的10%醋酸溶液，振搖清洗5分鐘，然后在335000xg下 高速離心，棄去上層清液。4. 加入100 pL的12.5%氨水，超聲清洗Zr02納米粒子5分鐘，然后 在35000xg下高速離心，收集上層清液。5. 將上步收集的上清液放入冷凍干燥機濃縮。6. 用MALDI TOF MS分析(參見圖2、圖3 )從圖中可以看到所有的主要質(zhì)譜峰均為磷酸化肽段，非磷酸化肽段的質(zhì) 譜峰很少，即使有也強度很低，這說明所合成的固定化鋯離子親和色譜固 定相對磷酸化肽段具有很好的選擇性和較高特異性。而且對各種類型的磷 酸化肽段(蘇氨酸、絲氨酸和酪氨酸)都一樣有效。應(yīng)用例2樣品蛋白酶解溶液的制備同應(yīng)用例1。磷酸化肽段的分離、富集與純化釆用實施例2制備的固定化鐵離子 親和色譜固定相1. a-酪蛋白的酶解液用10。/。醋酸溶液調(diào)節(jié)pH值約為2,將2 pmol蛋白酶解液緩慢通過整體柱中。2. 用30 pL含100 mMNaCl的10%醋酸溶液，沖洗柱子。3. 用30 pL的10%醋酸溶液沖洗柱子。4. 用30)iL的12.5%氨水，沖洗柱子并收集。5. 將上步收集的上清液放入冷凍干燥機濃縮干燥。6. 用MALDI TOF MS分析(參見圖4 )從圖中可以看到所有的主要質(zhì)譜峰均為磷酸化肽段，非磷酸化肽段的質(zhì) 譜峰很少，即使有也強度很低，這說明所合成的固定化鐵離子親和色譜固 定相對磷酸化肽段具有很好的選擇性和較高特異性。
權(quán)利要求
1.一種固定化金屬的親和色譜固定相，其特征在于固定相結(jié)構(gòu)式為其中GMA Polymer微球，粒徑為100nm-50um。
2. 按權(quán)利要求l所述固定化金屬的親和色譜固定相，其特征在于所述 GMAPolymer微球為聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球。
3. 按權(quán)利要求2所述固定化金屬的親和色譜固定相，其特征在于所述 聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球為甲基丙烯酸縮水甘油酯的交聯(lián)均 聚物或甲基丙烯酸縮水甘油酯與烯烴的交聯(lián)共聚物微球。
4. 按權(quán)利要求3所述固定化金屬的親和色譜固定相，其特征在于所述 甲基丙烯酸縮水甘油酯的交聯(lián)均聚物是指聚甲基丙烯酸縮水甘油酯-乙烯基 甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA-EDMA);甲基丙烯酸縮水甘油酯與烯烴的 交聯(lián)共聚物是指聚甲基丙烯酸縮水甘油酯與苯乙烯的的交聯(lián)共聚物。
5. —種權(quán)利要求l所述親和色譜固定相的制備方法，其特征在于包括 以下步驟，.1 )氨基化反應(yīng)將100-400 g/L的氨基化試劑溶液與GMAPolymer微 球以5-25ml/lg比例混合，在0-8(TC下反應(yīng)3-12h,反應(yīng)后產(chǎn)物用水沖洗 至中性，得氨基化的微球；或?qū)⑸鲜鯣MA Polymer微球釆用上述GMA Polymer整體柱替換，泵入 流速為0.001-0.5 mL/min，即得氨基化的整體柱。.2) 將步驟1 )得到每lg的氨基化的微球置于5-10 ml無水乙腈溶液中， 室溫條件下反應(yīng)過夜，待用；無水乙腈溶液中含有40-100mMPOC13, 40-60 mM2, 4, 6-三甲基吡啶；或?qū)⒑?0-100 mM POC13， 40-60 mM 2， 4, 6-三甲基吡嚏的無水乙腈 溶液以0.001-0.5 mL/min的流速泵入步驟1)得到的氨基化的整體柱內(nèi),過 夜；.3) 將50-100倍微球或整體柱體積的水加入到步驟2)得產(chǎn)物中，使其 充分水解；.4) 將水解后的微球用醋酸或三氟乙酸將調(diào)至pH2-3，而后加入100 mM 的EDTA溶液(l g/5-10ml)，震蕩l-2小時，離心，棄去上清液，沉淀用水 洗滌3-5次，真空干燥，即可到固定化金屬親和色譜固定相?；?qū)H2-3醋酸或三氟乙酸溶液泵入整體柱，流速為0.001-0.5 mL/min, 時間30-60 min,然后將100 mM的EDTA溶液泵入整體柱，流速為0.001-0.5 mL/min,時間30-60 min,再用水以0.001-0.5 mL/min的流速沖洗整體柱30-60min,即可到固定化金屬親和色譜固定相。
6. 按照權(quán)利要求5所述的固定化金屬的親和色譜固定相的制備方法，其 特征在于所述氨基化試劑為氨水、3,3-二氨丙基亞胺、乙二胺或l,6-二氨 基&烷
7. —種權(quán)利要求1所述的親和色譜固定相的應(yīng)用，其特征在于固定相的預(yù)處理，使用前將所述固定化金屬親和色譜固定相與鋯或鐵離子溶液以 l:50-100(g/ml)的比例加入含有100-200 mM鋯或鐵離子的質(zhì)量濃度10%的 醋酸溶液，放置過夜；離心，棄去溶液部份，再用質(zhì)量濃度10%的醋酸溶 液洗滌3次，真空干燥；磷酸化肽段的分離、富集與純化，具體操作使用所得的固定相時，將固 定化金屬親和色譜固定相與蛋白樣品以重量比為100-200: l混合，孵育30 分鐘，洗滌去除非磷酸化肽段，最后用質(zhì)量濃度為12.5%的氨水洗脫。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離與純化技術(shù)，具體是一種固定化金屬的親和色譜固定相及其制備方法。固定相結(jié)構(gòu)如圖，其中GMAPolymer微球，粒徑為100nm-50um，GMAPolymer微球為聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物微球。通過氨基化和磷酸脂化，得到一種具有高效的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類聚合物磷酸酯基新型固定化金屬親和色譜固定相的合成方法，通過與鋯離子和鐵離子螯合，用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中的研究，可用于磷酸化肽段高選擇性分離、富集與純化，同時較傳統(tǒng)固定相，降低了對非磷酸化肽段的非特異性吸附。
文檔編號B01J20/281GK101288844SQ20071001103
公開日2008年10月22日 申請日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日
發(fā)明者葉明亮, 周厚江, 順 封, 鄒漢法 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所